全二维液相色谱分离技术及应用-ThermoFisherScientific

分析型液相色谱系统
全二维液相色谱分离技术及应用
前言
赛默飞液相色谱特色技术
——双三元（DGLC ）梯度分离技术
众所周知，全二维液相色谱分离技术峰容量大、动态范围宽、分辨率高，具有更好的分离能力。

因此，在利用液相色谱对复杂样品的化学组成及其含量进行分析时，基于各种接口技术结合正交分离模式的全二维液相色谱分离技术，可获得更好更多的结果，尤其是分析时间不受限制的离线全二维分离模式，在获得更高峰容量的同时兼具应用灵活的特点。

2D-LC 的峰容量 (n) = n1x n2
整合进样、分离、切换、收集，并完成二维或多维自动化分离分析是色谱分析仪器的发展趋势，赛默飞世尔科技早在Ultimate Famos Switchos 微流液相系统上就实现了多维模式的分离分析，2006年就在Ultimate3000 nano and Cap 系统上配置Comprehensive 2D LC kits 实现了全二维分析，现在将在线、离线全二维分析进一步推广在常规分析型液相系统上以满足日益增长的各种分析需求。

赛默飞能将在线、离线全二维分析推广在常规分析型液相系统上正是得益于独特的双三元（DGLC ）梯度分离技术。

该技术采用双泵设计，每个泵作为一个单独的体系，有各自独立的比例阀和流动相体系，同时单独控制三种不同的流动相，在Chromeleon 变色龙软件的支持下，结合独特的阀切换技术，通过灵活的流路连接设计，使一套常规分析型液相色谱系统即可以轻松实现二维及全二维液相色谱分离。

此外该技术还可轻松实现在线固相萃取、流动相在线除盐、
在线柱后衍生和反梯度补偿、并联/串联色谱等高级应用。

值得一提的是该技术不仅可应用于常规液相，而且还A
Valve
12
6
5
4
3
B
Valve
1
2
6
54
3二维液相色谱分离原理
引自: Giddings, J. Chromatogr. A, 703 (1995), 3
n 2p e a k s
n 1peaks
3
在线全二维分离技术应用实例
中药刺五加
刺五加（Acanthopanax senticosus ）是五加科五加属的一种落叶灌木，主要的药用部分是它的根及根皮，药材名又称五加参，是中药五加皮的一种。

其成分复杂，结构确认存在困难。

采用在线全二维分离技术，短时间即可获得较多的峰，结合MS 数据和已知文献可完成主要组分的结构确认。

刺五加混合对照品和药材样品3D 谱图
（其中1 绿原酸；2 紫丁香苷；3 紫丁香苷；4 异嗪皮啶；5 紫丁香苷E ）
典型的全二维色谱连接图
1D column
2D column
waste
Mass
spectrometry
waste
L o o p 2
Loop 1
Sampler
Cycle i
Cycle i+1
DAD
1D column
2D column
waste
Mass spectrometry
waste
L o o p 2
Loop 1
Sampler
DAD
条件与结果：
一维色谱柱：Hypersil GOLD PFP （4.6×150mm ，5µm ）二维色谱柱：Acclaim Polar Advantage ⅡC18（4.6×50mm ，3µm ）流动相A ：一维：甲醇；二维：乙腈流动相B ：0.1%甲酸
分离结果：80min ，>60 个峰
中药苦荞麦
中药苦荞麦是(Fagopyrum Mill) 有降血糖、降血脂、降尿糖等作用。

系统的化 mAU
1
2
3
5 6
7
27.5
30.0
32.5
35.0
10.0
40.0 50.0 mAU min
1
2
3
4
5
6
7
WVL:320 nm
0.0 10.0
20.0
30.0
min
WVL:320 nm
min
46.00
48.00
51.00
WVL:320 nm
mAU
8
9
10
11
8
910
11
4
300A /m A U
2
90%
269.3
600
A /m A U
3D chromatogram
多中心切割在线脱盐质谱分析模式
LC-MS 联用技术是药物杂质定性鉴别的重要分析手段，然而现有的很多液相色谱分离方法为改善分离或检测经常会使用非挥发性缓冲盐流动相 (如磷酸盐缓冲溶液或离子对试剂)，这显然与质谱的ESI(APCI)-MS 不兼容。

采用赛默飞UltiMate 3000双三元液相色谱（DGLC ），可实现在线去除流动相中的非挥发性缓冲盐，让您无需改变现有的分析方法就可轻松使用LC-MS 联用技术对药物杂质进行更深入的研究。

以往一次进样仅能分析一个杂质， 而采用基于6位置14通阀的二维多中心切割模式，可同时实现多个杂质组分的定性分析，极大提升分析效率。

分离条件：
一维色谱柱： Acclaim Mixed-Mode HILIC-10 (2.1 mm ×10 mm, 3 μm ) ，
二维色谱柱：Acclaim RSLC Polar Advantage II (2.1 mm ×150 mm, 2.2 μm) ，Acclaim RSLC Phenyl-1
(2.1 mm ×150 mm, 3 μm)
Auto sampler
Analytical Column
Left
pump
Right pump
DGLC
UV
1
3
5
1’
3’
5’
1
65
23
4
24
62’
4’
6’
In
Out
1
65
2
3
4
T o MS
T o waste
T o waste
Auto sampler
Analytical Column
Left pump Right pump
DGLC UV 1
3
51’
3’5’
1
65
234
24
62’
4’
6’In
Out
1
6
52
34Desalting column
T o MS T o waste
T o waste
0.0
5.0
10.0
15.0
20.025.0
30.0
Time [min]
-500100200250A b s o r b a n c e [m A U ]
IMP-1 - 4.250
IMP-2 - 4.870
IMP-3 - 5.793
API - 13.987
IMP-4 - 17.767
IMP-5 - 22.190
IMP-6 - 24.233
min
mAU
250300pA
阿莫西林克拉维酸系统适应性样品在线除盐
阿莫西林克拉维酸钾适用于产β-内酰胺酶流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌所致的下呼吸道感染等疾病，在2015版药典系统适应性试验中因流动相为非挥发性盐，无法直接与质谱兼容给杂质分析带来了极大挑战。

采用DGLC 双三元液相色谱系统的多中心切割在线除盐模式，可使样品直接进入质谱进行检测且一次进样可完成6 个以上杂质的检测，很好地解决了此问题。

电雾式检测器（Charged Aerosol Detector ，CAD ）作为一种质量通用型检测器，可以检测任何非挥发性物质，其所兼容的流动相与质谱一致。

但较易摸索色谱分析条件，所以在线二维液相多中心切割法结合CAD 检测器可作为质谱分析前的预实验，本实验即是如此。

方法:
右泵分离：0.05mol/L 磷酸二氢钠溶液- 甲醇(95 ：5) 左泵除盐：甲酸胺- 甲醇
离线二维进行单克隆抗体纯化与表征
在生物药物研发的不同阶段都需要对目标产物进行纯化和分析表征，抗体过程优化的早期阶段有大量样品要做滴度、聚集体和电荷变异体的分析。

抗体聚集体等产品相关的物质可能导致严重的副作用，如形成抗药物抗体，这些都与抗体生产、纯化和处理条件密切相关。

赛默飞世尔科技单克隆抗体纯化与表征平台使用双梯度泵和带收集功能的自动进样器等模块。

多步
单抗分析平台分析数以百计的单抗样品时，含有抗体的细胞培养液用蛋白A 柱回收抗体，纯化的抗体样品自动化再进样，先用SEC 柱做单体、聚集体和片段分析，再用IEC 柱做电荷变异体分析，这些都是自动化完成的。

ProPac 系列IEC 柱用来做糖基化、唾液酸化、C —端赖氨酸、脱氨基、谷氨酰胺环化、马来酰脲酸加合物氧化、半胱氨酸化、硫醚相关修饰、琥珀酰亚胺和异构化的表征，通用的pH 梯度分析方法可根据等电点的差异对不同步骤1：蛋白A 捕获IgG(单抗)和自动化组分收集
步骤2：SEC 聚集体分析
步骤3: IEC 电荷变异体分析
双三元梯度泵，二合一泵设计
自动进样器具进样、收集和再进样功能，两种进样技术一体化
BR1043·L11/15F_CMD_CN
在线全二维分析系统推荐配置
离线全二维的配置
Ultimate DGP 3600 RS 系列:
SRD-3600 Integrated Solvent and Degasser Rack
DGP-3600RS Dual-Gradient Rapid Separation Pump System and Degasser Rack WPS-3000TRS Rapid Separation Wellplate Sampler,Thermostatted,
TCC-3000RS Rapid Separation Thermostatted Column Compartment equipped with two valves （如配置一个六通阀和一个十通阀）
DAD-3000 RS Rapid Separation Diode Array Detector with 2.5µL flow cell
GC image LCxLC ，matlab 软件（第三方数据处理软件，用于全二维液相色谱的数据处理、分析和可视化）
DGP-3600 Dual-Gradient Analytical Pump （biocompatible ） SRD-3600 Solvent Rack with 6 degasser channels WPS-3000T(B)FC (Biocompatible)Analytical Autosampler with Fraction Collection
TCC-3000SD Thermostatted Column Compartment
Valves （如配置两个二位十通阀或流通阀等）
DAD-3000 Diode Array Detector 或
VWD-3400detector
欢迎扫描关注官方微信。