黑曲霉发酵柠檬酸

黑曲霉发酵生产柠檬酸

（中北）生物技术18083108 陈园园

摘要：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤，了解产物提取的几种方法，学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理，掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。

关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸

实验材料和试剂：

样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处）

培养基：查氏培养基、马铃薯培养基

无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶

试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0.1M NaOH 、0.1M H2SO4 实验器材：

无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱

实验步骤

一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养

1.黑曲霉的分离培养

①土壤样品的采集

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

②制平板：

在融化好的查氏培养基中加入链霉素0.2mL/瓶

制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。

③制备土壤稀释液：

1. 称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。

2. 另取无菌离心管2支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水。取10－1的土壤稀释液，吸取0.1mL加入第一只离心管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－3、10－4土壤稀释液。

无菌操作法分别吸取10－2、10－3 、10－4土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的3块查氏平板培养基上。

④涂板

用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，静置于桌面5min。

2.黑根霉的分离培养

马铃薯培养基2块

1号马铃薯培养基用接种环无菌操作从酒酿样品中挑取1环在上面进行划线分离，

2号马铃薯培养基取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻璃珠的无菌水三角瓶进行稀释溶解，

取稀释液0.1mL在上面进行均匀涂布。

将划好的培养基置于517房间30℃培养箱内正置培养3天，进行结果观察和转接。3.菌种检测和扩培

培养72小时后，星期一过来，检查查氏培养基和划线马培，看是否有产酸的曲霉菌落，和典型的根霉菌落，并显微检测其是否为黑曲霉和黑根霉。确证后分别将其转接至剩余的两块PDA平板培养基上扩增培养和保藏。

二．黑曲霉发酵柠檬酸

1.种子液制备

菌种获得（纯种），无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上，用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制成孢子悬液。

2.液体深层发酵

无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇床上，30℃培养5～6天。

三．柠檬酸的提取

把发酵完成后的发酵液中的目的产物提取出来，并通过精制成为合格产品，该过程通常称为后提取，后提取是发酵工程不可缺少的部分。

1、处理黑曲霉玉米粉发酵液：

布氏漏斗垫上纱布抽滤除去菌体和残渣，量筒测量清液体积V0；

2、滴定：

量取5mL清液、5mL蒸馏水于锥形瓶中，再滴入2～3d酚酞指示剂，用0.1M NaOH 溶液滴定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，记下消耗的NaOH 溶液体积V1；

M总酸（g）＝V1(mL)×0.1(mol/L)×0.001×1/3×210×V0 /5

M碳酸钙（g）＝M柠檬酸×（V0 －5）/ V0 ×1/210×3/2×100

3、钙盐沉淀：

称取一定质量的碳酸钙粉末，边搅拌边缓慢地加入到剩余的清液中（防止产生大量的泡沫），85℃反应5min（使柠檬酸钙沉淀下来），趁热抽滤，并用沸水洗涤沉淀物2～3次（除去残糖、蛋白质等可溶性杂质）；

4、酸解：

VH2SO4（mL）＝M碳酸钙/100/0.1(mol/L)×1000

在沉淀物中加入约两倍体积的蒸馏水，调匀成浆状，量取一定体积0.1M H2SO4溶液，边搅拌边加入到浆液中，85度反应10min，趁热抽滤，获得清亮的酸解液；

5、低压浓缩：

将酸解液转入圆底烧瓶中，水浴60～70度，真空度0.08~0.09MPa，浓缩至原体积约1/10；

6、冷却结晶：

将浓缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约15min，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重m柠檬酸。

计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：M总酸（g）/ V发酵液（mL）

计算钙盐沉淀法柠檬酸的得率：m柠檬酸（g）/ 原料（g）

实验结果：

1.黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养结果

黑曲霉菌丛黑褐色，菌丝发达多分枝，顶囊大球形，分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。

黑根霉菌落呈黑色灰色菌丝为白色呈絮状，从假根处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成球形的孢子囊。

2.柠檬酸的提取结果

柠檬酸呈白色结晶粉末

V0=125ml V1=7.8ml

M总酸（g）＝V1(mL)×0.1(mol/L)×0.001×1/3×210×V0 /5

M总酸（g）＝7.8×0.1×0.001×1／3×210×125／5=1.365g

M碳酸钙（g）＝M柠檬酸×（V0 －5）/ V0 ×1/210×3/2×100

M碳酸钙（g）＝1.365×110／125×1／210×3／2×100=0.86g

VH2SO4（mL）＝M碳酸钙/100/0.1(mol/L)×1000

VH2SO4（mL）＝0.86／100／0.1×1000=86 ml

计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：M总酸（g）/ 原料（g）

黑曲霉发酵柠檬酸的产率=1.365／10.0=13.65％

计算钙盐沉淀法柠檬酸的得率：m柠檬酸（g）/ M总酸（g）

钙盐沉淀法柠檬酸的得率=0.56／1.365=41％

讨论：

本次实验目的为掌握真菌的分离、培养基本方法；获得黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸；了解产物发酵生产的机理；柠檬酸发酵的发酵条件；掌握发酵过程步骤；了解产物提取的几种方法；学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理；掌握沉淀法提取柠檬酸的方法。

1.土壤样品的采集需注意以下因素

根据土壤特点

1．土壤有机质含量和通气状况2.土壤酸碱度和植被状况3．地理条件4．季节条件

根据微生物生理特点采样

1.根据微生物营养类型

2.根据微生物的生理特性

2.柠檬酸合成的代谢调节

1、由于锰离子的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+ 浓度升高，促进

了EMP途径的畅通。

2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。

3、在控制Fe2+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。

4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶Ａ和丙酮酸固定CO２反应相平衡，以及柠檬酸合成酶

不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力。

5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失

活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。

3.柠檬酸发酵的条件：

1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖；

2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）；

3、合适的pH值；

4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速250r/m）；

5、限制重金属离子如Mn2＋、Fe2＋、Zn2＋含量。

4.影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素

①菌种②发酵培养基（碳源、氮源）③纯种发酵与灭菌④无机添加剂⑤pH对微生物生长的影响⑥溶氧的影响⑦温度对微生物生长的影响

5.影响柠檬酸提取效率的因素

钙盐沉淀中是否充分沉淀；可溶性杂质是否完全除去；多次抽滤操作中抽滤是否充分；冷却结晶是否充分。