环介导的等温扩增法

• 2、Isolation of Single-Stranded DNA
1）LAMP reaction 2）Primer extension LAMP
The products that were amplified by LAMP were digested with TspRI and then extended using a primer that hybridizes to the 39 overhanging sequence at a cleavage site.
环介导的等温扩增法
严海生 2012.09.21
背景介绍
•
聚合酶链武反应技术(PCR)自1985年问世来，以其灵敏性、特异 性和快速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用，由此可见 核酸扩增技术的重要性。 PCR方法依据其灵敏度高、特异性好，成 为目前最精准的基因诊断方法。 • 然而常规PCR技术存在如下缺陷：
（3）基于锁式探针的滚环扩增
• 这种探针包括以下3个部分：5’端T1和3’端T2为检测臂，与靶 序列互补结合，可在连接酶的作用下使探针环化；P1和P2为滚环扩 增的通用引物区，实现环状锁式探针的级联扩增。 如果体系中存在检测的靶序列，锁式探针的两个检测臂被连接起 来，形成环化的锁式探针，形成的锁式探针和靶序列的杂交会产生较 为稳定的拓扑结构，因而也保证了环化探针的稳定性。环化的锁式探 针可以通过通用引物进行扩增，实现检测信号的放大以及多元检测。 如果体系中不存在需要检测的靶序列，线形锁式探针就不会被连接酶 连接形成环化的锁式探针，也就不会被通用引物扩增。
products
7、Solutions • 1、
2、HNB反应指示剂
Thanks for your attention！
• 3、Loop-prime
•
Loop primers hybridize to the stem-loops, except for the loops that are hybridized by the inner primers, and prime strand displacement DNA synthesis. RESULT:signal increase was detected at 14 min and 44 min with and without the loop primers, respectively
•
NASBA反应是由AMV反转录酶、RNA酶 H、T7 RNA聚合酶3种酶共同协作完
成的。引物 I 的 3’ 端与靶 序列互补，5’ 端具有被靶RNA聚合酶识别的启 动子序列，引物 II的5’ 端序列与靶 RNA序列相同。NASBA整个反应分为两相： 非循环相和循环相。如开始用 RNA靶序列，反应将如此进行：首 先，5’ 端含 有RNA聚合酶启动子序列的引物I与靶序列复性，并由反转录酶催化产生一cDNA 链，以RNaseH降解新生成的双链螺旋中的RNA，这样生成了带有启动子序列的 cDNA，以上称为非循环相。然后，引物II与裸露的cDNA复性，进行第二 链的合
5、Advantages
• 1、high efficiency without influence of non-target DNA, only need a few copies • 2、high specific • • 3、high sensitivity
4、simple and easy to perform
增技术的出现满足了上述要求。
1、赖解旋酶恒温基因扩增技术（HDA）
• HDA技术是依靠解旋酶解开双链DNA，结合蛋白(SSB)保持单链DNA状态， DNA聚合酶催化靶片段的扩增。反应温度依据使用的酶的不同而不同。
2、核酸依赖的扩增（NASBA)
• 1990年首次提出的由一对引物引导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温 扩增酶促过程。反应在42℃进行，扩增速度与PCR一样快，在3小时内可扩增 1000万倍。
•
环介导等温扩增技术
• 环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是
利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高
效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝， 扩增产物 是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合 物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。 • LAMP等温扩增反应体系包含了内外引物、模板 DNA、Bst DNA聚合酶、dNTP和 缓冲液。其基本操作过程是将 LAMP 反应体系(除Bst DNA聚合酶)在95℃加热5min
成，启动子序列变为双链。
3、滚环DNA扩增
在现有的核酸扩增技术中，根据其特点可以分为两类：一类是把 靶核酸的直接扩增，一类是信号放大扩增。其中，滚环扩增是一种既 能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大的扩增方法。RCA分线性和指 数扩增两种形式。
（1）线性RCA
• 线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶的作用下被延伸，产 物是与原始引物相连的DNA单链。线性RCA只适用于环状核酸的扩增。例如环 状病毒、质粒和环状染色体。
(2)，byproduct.
• 2、Detection
(3), SYBR GreenⅠ
(4), Real-time PCR
• 3、Development
• 1、RT-LAMP
• By combination with reverse transcription, LAMP can amplify RNA sequences with high efficeency.
5、easy detection
6、RT-LAMP
6、shortages
• 1、 the risk of contamination resulting from the high
quantity of amplified DNA produced
• 2、LAMP methods are not feasible for diagnosis due to difficulties in accurately interpreting results with problems of sensitive visualization of amplified
4、Optimized conditions for LAMP
• 1、Tm value: • F1c、B1c>F2、B2，in order that a looped out structre formed immediately after release of the single-stranded DNA from the template • F2、B2>F3、B3，to ensure that synthesis occurred earlier from the inner primes than from the outer primes
后，冷却，再加入8U Bst DNA聚合酶，在63％保温 60min，然后在高于 8O℃的温
度下加温2min终止反应。
• 1、LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和 再循环阶段
LAMP原理小动画
• 2、Detection
• (1), Electrophoresis ,
• (1)需要昂贵的PCR仪； • (2)多因素影响扩增效果；
• (3)常引起非特异性扩增；
• (4)扩增反应时间长，一般需要几个小时，难以在基层推广应用等诸 多的缺陷，急需更新的方法来替代。
•
近年来随着分子生物学技术的发展，新的核酸扩增技
术也不断涌现。根据是否需要温度循环也可分为两类：一
类是非等温扩增体系，如聚合酶链式反应(PCR)、Fra Baidu bibliotek连接酶 链式反应(LCR)等。另一类是等温扩增体系，如赖解旋酶 恒温基因扩增(HDA)、核酸依赖的扩增(NASBA)、滚环扩增 (RCA)、环介导的等温扩增（LAMP）等系统，核酸恒温扩
• 2、a stem –loop DNA is critical for cycling ,the preferable size between F2c and F1c is 40 base
• 3、the size of the target DNA should be set to less than 300bp • 4、DNA polymerase is anothor critical factor , • 5、 Chemicals detabilizing the DNA helix can elevate amplification efficiencies, the presence of 0.5-1.5M betaine or Lproline stimulated not only the overall rate of the reaction,but also increased target selectivity with a significant reduction in amplification of irrelevant seqences
• （2）指数RCA
• 指数RCA与线性RCA相似，它采用了第二种引物。该引物序列与环 状DNA序列完全一致。在RCA循环中，此引物与第一次线性RCA产物结 合并在聚合酶的作用
• 下延伸，其产物又作为 • 第一种探针的模板，这
• 样一来产物呈指数递增。
• 指数 RCA也可用于非环 • 状 DNA的扩增。