第13章流式细胞分析技术讲义
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第一章 血液标本采集与处理
临床免疫学检验技术
第十三章 流式细胞分析技术
邵启祥
目录
第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 一、经典流式细胞仪 二、量化成像分析流式细胞仪 三、质谱流式细胞仪
第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、数据显示方式
目录
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、单细胞免疫标本的制备 二、常用的荧光染料与标记染色 三、基于免疫微球技术的应用
经典流式细胞仪的结构
（二）分析工作原理
荧光染色待测单细胞悬液
进样器系统
液流
细胞流
驱动系统
流动室
鞘液
单细胞流
检测区域
激光
激发细胞
荧光素
PMT/PD检测器
信号放大
FSC/SSC
计算机
信号转换、储存和分析。
液流系统和液流聚焦示意图
液流系统和光学系统
鞘液
喷嘴
荧光信号 激光束聚焦
样品流
光学系统、样品激发和FSC检测
质谱流式细胞仪结构简图
（二）分析工作原理
金属元素偶联抗体
标记细胞
进样器
雾化系统
单细胞雾化液滴
离子源
原子电离
带电粒子
高频交变电磁场
雪崩式放电
ຫໍສະໝຸດ Baidu
涡流电流
离子云形成
ICP-TOF检测
计算机系统
数据处理和分析
经典流式细胞仪图
质谱流式细胞仪工作原理
质谱流式常用标记元素
常用外周血抗CD分子抗体标记元素
质谱流式细胞仪结果分析
Original from Purdue University Cytometry Laboratories
光学系统、样品激发和SSC检测
光学系统、样品激发和荧光检测
光学系统和荧光检测
（三）分选工作原理
单细胞流
流动室
超声压电晶体高频振动
散射光
单细胞液滴
选定细胞群体
荧光信号
加载电荷
偏转高压静电场
重点提示
本章小结
概述
流式细胞术（flow cytometry，FCM）： 是基于流式细胞仪的一项快速、精确、高通量针对微 粒（细胞）的特征或功能进行多参数定性、定量分析和分 选的新型技术。 流式细胞术的特点： 快速、高通量、准确、灵敏、定性或定量地对完整细 胞群体分析反映出细胞群体的生物学特征或功能，或根据 微粒（细胞）的特征进行分选，进而研究其生物学特征和 功能。
第一节 流式细胞仪的分析及分选原理
一、概 述
流式细胞仪（flow cytometer）： 是多学科交叉融合的产物，是集光学、化学、材料学 、流体力学、自动化控制、光电测量、细胞生物学、生物 化学、免疫学和计算机图像分析等技术于一体的现代化新 型分析仪器。作为一种先进的微粒（细胞）定性和定量分 析仪器。
第四节 流式细胞分析的临床应用 一、机体免疫状态的检测 二、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 三、肿瘤耐药相关蛋白分析 四、艾滋病检测中的应用 五、自身免疫病中的应用 六、移植免疫中的应用
目录
第五节 影响流式细胞分析的主要因素 一、标本采集和单细胞悬液制备的质量控制 二、荧光染色过程中的质量控制 三、仪器的质量控制 四、数据采集和分析过程中的质量控制
荧光显微成像的形态学量化分析系统与经典流式细胞仪 的结合体。
液流系统：注射泵、流动室、鞘液流和细胞流
LED灯
明场细胞显微图像
光学系统：
荧光显微系统
全固态激光器
流式细胞仪检测
检测系统：TDI CCD
（二）分析工作原理
细胞悬液
注射泵
流动室
液流聚焦
系统鞘液
LED照射
极限层流
抑制细胞搏动、翻转
明视野细胞形态
流式细胞仪特点： ①速度快，每秒可测量数万个微粒；②精度高；③准 确性好；④多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、 化学和生物特性的多参数测量。
二、经典流式细胞仪
（一）基本结构 经典分析型的流式细胞仪的结构组成 液流系统：液流驱动系统、流动室、鞘液流和标本流 信号检测：光源、光束形成器（流动室前光学系统） 、流动室后光学系统 转换及放大系统：光电转换器、放大器和信号处理电 路 计算机分析系统 分选型流式细胞仪 分选系统：荧光激活细胞分选系统（FACS）
分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点 的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总 量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成 反比。
二、量化成像分析流式细胞仪
（一）基本结构
量化成像分析流式细胞仪（imaging flow cytometer） 的组成：
第二节 数据的显示与分析
一、参数
流式细胞仪的主要参数有两大类： 散射光信号：前向散射光和垂直散射光 荧光信号：各种不同的流式细胞仪可检测的荧光信号 数量不同，随着配置的激光器越多，可检测的荧光信号越 多。 分析型流式细胞仪最高标配4个激光器（ 488、633 、405和375 nm），可检测20个参数（18种荧光），而定 制型可配置11个激光器，30个检测器，可测定 32个参数 。大型分选型流式细胞仪最高可配置7个激光器，检测24 个参数（22种荧光），可6路分选。
液滴偏转
进入分选收集管，完成细胞分选
数据储存，分析。
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴
不充电 弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求：
分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细 胞的含量成正比。
分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分 率。
二、散射光的测定
（一）前向散射光（forward scattered light，FSC ）
是与细胞切线方向小角度散射光，其能反映细胞形状 和体积大小。
二、散射光的测定
（二）侧向散射光或垂直散射光（side scattered light，SSC）
激光照射到细胞内容物时，可以产生方向不同和强弱 不等的散射光，垂直方向散射光对细胞膜、胞质、核膜的 折射率更为敏感，可反映被检测细胞内精细结构和颗粒信 息。
固态激光
TDI CCD捕获信号
散射光和荧光信号
计算机分析系统
细胞明视野、荧光图像和流式分析图
量化成像分析流式细胞仪结构、原理
A.量化成像分析流式细胞仪结构图
B.量化成像分析流式细胞仪结果分析图
细胞核转位检测
三、质谱流式细胞仪
（一）基本结构 质谱流式细胞仪（mass cytometer）的组成 质谱流式细胞仪是经典的流式技术和质谱技术的结 合体。 进样雾化系统 离子源：热气化室和电感耦合等离子体焰炬 离子传递和过滤系统 ICP-TOF检测系统 计算机及其分析系统
临床免疫学检验技术
第十三章 流式细胞分析技术
邵启祥
目录
第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 一、经典流式细胞仪 二、量化成像分析流式细胞仪 三、质谱流式细胞仪
第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、数据显示方式
目录
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、单细胞免疫标本的制备 二、常用的荧光染料与标记染色 三、基于免疫微球技术的应用
经典流式细胞仪的结构
（二）分析工作原理
荧光染色待测单细胞悬液
进样器系统
液流
细胞流
驱动系统
流动室
鞘液
单细胞流
检测区域
激光
激发细胞
荧光素
PMT/PD检测器
信号放大
FSC/SSC
计算机
信号转换、储存和分析。
液流系统和液流聚焦示意图
液流系统和光学系统
鞘液
喷嘴
荧光信号 激光束聚焦
样品流
光学系统、样品激发和FSC检测
质谱流式细胞仪结构简图
（二）分析工作原理
金属元素偶联抗体
标记细胞
进样器
雾化系统
单细胞雾化液滴
离子源
原子电离
带电粒子
高频交变电磁场
雪崩式放电
ຫໍສະໝຸດ Baidu
涡流电流
离子云形成
ICP-TOF检测
计算机系统
数据处理和分析
经典流式细胞仪图
质谱流式细胞仪工作原理
质谱流式常用标记元素
常用外周血抗CD分子抗体标记元素
质谱流式细胞仪结果分析
Original from Purdue University Cytometry Laboratories
光学系统、样品激发和SSC检测
光学系统、样品激发和荧光检测
光学系统和荧光检测
（三）分选工作原理
单细胞流
流动室
超声压电晶体高频振动
散射光
单细胞液滴
选定细胞群体
荧光信号
加载电荷
偏转高压静电场
重点提示
本章小结
概述
流式细胞术（flow cytometry，FCM）： 是基于流式细胞仪的一项快速、精确、高通量针对微 粒（细胞）的特征或功能进行多参数定性、定量分析和分 选的新型技术。 流式细胞术的特点： 快速、高通量、准确、灵敏、定性或定量地对完整细 胞群体分析反映出细胞群体的生物学特征或功能，或根据 微粒（细胞）的特征进行分选，进而研究其生物学特征和 功能。
第一节 流式细胞仪的分析及分选原理
一、概 述
流式细胞仪（flow cytometer）： 是多学科交叉融合的产物，是集光学、化学、材料学 、流体力学、自动化控制、光电测量、细胞生物学、生物 化学、免疫学和计算机图像分析等技术于一体的现代化新 型分析仪器。作为一种先进的微粒（细胞）定性和定量分 析仪器。
第四节 流式细胞分析的临床应用 一、机体免疫状态的检测 二、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 三、肿瘤耐药相关蛋白分析 四、艾滋病检测中的应用 五、自身免疫病中的应用 六、移植免疫中的应用
目录
第五节 影响流式细胞分析的主要因素 一、标本采集和单细胞悬液制备的质量控制 二、荧光染色过程中的质量控制 三、仪器的质量控制 四、数据采集和分析过程中的质量控制
荧光显微成像的形态学量化分析系统与经典流式细胞仪 的结合体。
液流系统：注射泵、流动室、鞘液流和细胞流
LED灯
明场细胞显微图像
光学系统：
荧光显微系统
全固态激光器
流式细胞仪检测
检测系统：TDI CCD
（二）分析工作原理
细胞悬液
注射泵
流动室
液流聚焦
系统鞘液
LED照射
极限层流
抑制细胞搏动、翻转
明视野细胞形态
流式细胞仪特点： ①速度快，每秒可测量数万个微粒；②精度高；③准 确性好；④多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、 化学和生物特性的多参数测量。
二、经典流式细胞仪
（一）基本结构 经典分析型的流式细胞仪的结构组成 液流系统：液流驱动系统、流动室、鞘液流和标本流 信号检测：光源、光束形成器（流动室前光学系统） 、流动室后光学系统 转换及放大系统：光电转换器、放大器和信号处理电 路 计算机分析系统 分选型流式细胞仪 分选系统：荧光激活细胞分选系统（FACS）
分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点 的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总 量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成 反比。
二、量化成像分析流式细胞仪
（一）基本结构
量化成像分析流式细胞仪（imaging flow cytometer） 的组成：
第二节 数据的显示与分析
一、参数
流式细胞仪的主要参数有两大类： 散射光信号：前向散射光和垂直散射光 荧光信号：各种不同的流式细胞仪可检测的荧光信号 数量不同，随着配置的激光器越多，可检测的荧光信号越 多。 分析型流式细胞仪最高标配4个激光器（ 488、633 、405和375 nm），可检测20个参数（18种荧光），而定 制型可配置11个激光器，30个检测器，可测定 32个参数 。大型分选型流式细胞仪最高可配置7个激光器，检测24 个参数（22种荧光），可6路分选。
液滴偏转
进入分选收集管，完成细胞分选
数据储存，分析。
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴
不充电 弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求：
分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细 胞的含量成正比。
分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分 率。
二、散射光的测定
（一）前向散射光（forward scattered light，FSC ）
是与细胞切线方向小角度散射光，其能反映细胞形状 和体积大小。
二、散射光的测定
（二）侧向散射光或垂直散射光（side scattered light，SSC）
激光照射到细胞内容物时，可以产生方向不同和强弱 不等的散射光，垂直方向散射光对细胞膜、胞质、核膜的 折射率更为敏感，可反映被检测细胞内精细结构和颗粒信 息。
固态激光
TDI CCD捕获信号
散射光和荧光信号
计算机分析系统
细胞明视野、荧光图像和流式分析图
量化成像分析流式细胞仪结构、原理
A.量化成像分析流式细胞仪结构图
B.量化成像分析流式细胞仪结果分析图
细胞核转位检测
三、质谱流式细胞仪
（一）基本结构 质谱流式细胞仪（mass cytometer）的组成 质谱流式细胞仪是经典的流式技术和质谱技术的结 合体。 进样雾化系统 离子源：热气化室和电感耦合等离子体焰炬 离子传递和过滤系统 ICP-TOF检测系统 计算机及其分析系统