猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及其可溶性分析

收 稿 日 期 ：２０１５－０４－２３ 修 回 日 期 ：２０１５－０６－０６ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （３１１７２３３１）。 第一作者：周景明，男，副 教 授，博 士，硕 士 研 究 生 导 师，从 事 分 子 免 疫 学 和 免 疫 学 检 测 技 术 研 究 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｊｉｎｇｍｉｎｇ＠ｚｚｕ．
将重组载体 ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２ 分 别 转 至 大 肠 杆 菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）和 Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）感 受 态 细 胞。３７ ℃ 培养１６ｈ，挑取阳性 克 隆，进 行 菌 液 ＰＣＲ 和 双 酶 切鉴定。
将 鉴 定 成 功 的 ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２－Ｂｌ２１（ＤＥ３）和 ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２－Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）菌 种 接 种 至 ２ ｍＬ 含 ３０ｇ／Ｌ 卡那霉素抗生素的 ＬＢ 培养基，３７ ℃、２２０ ｒ／ｍｉｎ培 养 过 夜。 次 日 按 照 １∶１００ 体 积 比 接 入 新鲜的１０ｍＬ 含 ３０ｇ／Ｌ 卡 那 霉 素 抗 生 素 的 ＬＢ 培养基，３７ ℃、２２０ｒ／ｍｉｎ震荡培养至 ＯＤ 值达到 ０．６～０．８，加 入 终 浓 度 为 １ ｍｍｏｌ／Ｌ 的 ＩＰＴＧ， ３７ ℃、２２０ｒ／ｍｉｎ 诱 导 ８ｈ。１２ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ２ｍｉｎ，收集菌体，分别用 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 凝 胶 电 泳 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ鉴 定 蛋 白 表 达 情 况 。 １．４ Ｅ２ 蛋 白 的 可 溶 性 分 析
因重组 Ｅ２ 蛋 白 含 Ｈｉｓ标 签，因 此 采 用 镍 柱 洗脱。变性蛋白液含２０ｍｍｏｌ／Ｌ 咪唑，与镍柱结 合后，用含２５０ ｍｍｏｌ／Ｌ 咪 唑、８ ｍｏｌ／Ｌ 尿 素 的 洗 脱液洗脱。
采用２种方法对纯化得到的变性蛋白进行复 性：将变性纯化得到的 Ｅ２ 蛋白放入复性缓冲 液， 并设置８、６、４、２、１ ｍｏｌ／Ｌ 尿 素 梯 度，每 个 梯 度 透 析１２ｈ，最 后 用 ＰＢＳ 透 析 ３ｄ，超 滤 管 浓 缩；将 变 性纯化得到的 Ｅ２蛋白 逐 滴 加 入 含 ２ ｍｏｌ／Ｌ 尿 素 的 复 性 缓 冲 液 ，超 滤 管 浓 缩 ，ＰＢＳ 透 析 ３ｄ。
ｅｄｕ．ｃｎ 通 信 作 者 ：王 爱 萍 ，女 ，教 Байду номын сангаас ，博 士 ，博 士 研 究 生 导 师 ，从 事 分 子 免 疫 学 和 免 疫 学 检 测 技 术 研 究 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｉｎｇａｗ＠ｚｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１１ 期
周景明等：猪瘟病毒 Ｅ２蛋白在大肠杆菌中的表达及其可溶性分析
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Ｅ２ 蛋 白 主 要 以 包 涵 体 的 形 式 存 在 ，制 备 包 涵 体的步骤：超声后的沉淀重悬于 ２０ ｍＬ 清 洗 缓 冲 液；４ ℃、１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，弃上清；重复 以上操作１ 次；沉 淀 重 悬 于 ２０ ｍＬ 重 悬 缓 冲 液， ４ ℃、１２ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ２０ ｍｉｎ，弃 上 清；沉 淀 溶 于１０ｍＬ ８ｍｏｌ／Ｌ 尿 素 变 性 液，吹 打 混 匀，３７ ℃ 搅拌过 夜；４ ℃、１２ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ２０ ｍｉｎ，弃 沉 淀 ，收 集 上 清 ，上 清 液 即 为 变 性 蛋 白 。
随着分子生 物 学 技 术 在 ＣＳＦ 研 究 领 域 的 应 用，ＣＳＦ 病原学、分子 流 行 病 学、诊 断 及 防 治 等 方 面的研究取 得 许 多 新 进 展。 现 有 研 究 表 ［２］ 明，囊 膜糖 蛋 白 Ｅ２ 是 猪 瘟 病 毒 的 主 要 保 护 性 抗 原，其 在猪瘟病 毒 多 聚 蛋 白 上 的 位 置 始 于 氨 基 酸 残 基 ６９０，终止 于 氨 基 端 残 基 １ ０６０，长 约 ３７０ 个 氨 基 酸。Ｅ２蛋白是 ＣＳＦＶ 吸 附 和 进 入 敏 感 细 胞 的 必 需蛋白［３］，能诱导机体产生高滴度的中和抗 体，抵 抗致 死 剂 量 的 攻 击，而 缺 乏 Ｅ２ 蛋 白 的 猪 瘟 病 毒 则不 能 诱 导 机 体 产 生 中 和 抗 体［４］，Ｅ２ 基 因 变 异 可影响猪瘟病毒的免疫原性和反应原性 。 ［５］ 鉴 于 此，本研究 在 大 肠 杆 菌 中 高 效 表 达 猪 瘟 病 毒 Ｅ２ 蛋白，以期为 ＣＳＦ 亚 单 位 疫 苗 研 制、血 清 学 诊 断 提供依据。
根据石门株 ＣＳＦＶ Ｅ２序列 ＡＦ５３１４３３设计１ 组引物，用于 扩 增 长 １ １１３ｂｐ 的 ＣＳＦＶＥ２ 全 基 因 片 段 。 引 物 由 生 工 生 物 工 程 （上 海 ）股 份 有 限 公 司 合 成，序 列 为 Ｆ：５′－ｔｔＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＴＡＧＣ－ ＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＣＡ－３′；Ｒ：５′－ｔｔＡＡＧＣ－ ＴＴＧＧＣＧＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＧＡＡＣＴＡＣＧ－３′， 上游引入 ＥｃｏＲⅠ 酶 切 位 点，下 游 引 入 ＨｉｎｄⅢ 酶 切位点，ｔｔ 代 表 保 护 碱 基，下 划 线 指 酶 切 位 点。 ＰＣＲ 程序：９４ ℃ ５ ｍｉｎ，９４ ℃ ３０ｓ，６８ ℃ ３０ｓ，
Ｍ．ＤＬ２０００；１．ＰＣＲ 扩增产物 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ 图１ 重组表达质粒 ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２的 ＰＣＲ 结果
Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２
Ｍ．ＤＬ１５０００；１．ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２双酶切产物 Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２；２．ｐＥＴ－２８ａ双 酶 切 产 物 Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓ－ ｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ－２８ａ
图２ 重组表达质粒 ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２的双酶切鉴定 Ｆｉｇ．２ Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２
２．２ Ｅ２ 蛋 白 的 表 达 检 测 重组 菌 株 ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２－Ｂｌ２１（ＤＥ３）和 ｐＥＴ－
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西 北 农 业 学 报
２４ 卷
２８ａ－Ｅ２－Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）经 ＩＰＴＧ 诱 导 后，进 行 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳检测。结果显示（图３），与 ｐＥＴ－ ２８ａ－Ｒｏｓｅｔｔａ （ＤＥ３）相 比，ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２－Ｒｏｓｅｔｔａ （ＤＥ３）在４６ｋｕ 处 有 １ 条 明 显 的 表 达 条 带，与 预 测的 Ｅ２ 蛋 白 分 子 质 量 大 小 符 合。 而 ｐＥＴ－２８ａ－ Ｅ２－Ｂｌ２１（ＤＥ３）无明显的表 达 条 带，以 猪 瘟 病 毒 阳 性血清 为 一 抗，进 行 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检 测 可 知，其 在 ４６ｋｕ 处 有 明 显 条 带 （图 ４）。
１ 材料与方法
１．１ 试 剂 限制性 内 切 酶 ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ 均 购 自 日 本
ＴａＫａＲａ 公 司，Ｔ４ ＤＮＡ 连 接 酶 购 自 美 国 Ｐｒｏ－ ｍｅｇａ公司，ＩＰＴＧ 购 自 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司，Ｇｅｌｒｅｄ购自美国 Ｂｉｏｔｉｕｍ 公司，ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘ－ ｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｎｉｂｅｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 均购自日本 ＴａＫａＲａ公司，ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅｒ ｐｌｕｓ购 自 美 国 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ 公 司，ｐＥＴ－２８ａ（＋ ）、 ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ 均 由 郑 州 大 学 分 子 免疫实验室保存。 １．２ ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２ 重 组 载 体 构 建
诱 导 １００ ｍＬ 菌 液，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ２０ ｍｉｎ收集菌体。经 ＰＢＳ重悬后，超声破碎，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心 ２０ ｍｉｎ，分 别 收 集 上 清、沉 淀，ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 凝胶电泳，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ鉴定 Ｅ２蛋白的可 溶性。 １．５ Ｅ２ 蛋 白 的 变 性 纯 化 与 复 性
猪瘟病毒 Ｅ２蛋白在大肠杆菌中的表达及其可溶性分析
周 景 明 ，李 鹏 飞 ，张 改 平 ，祁 艳 华 ，裴 艳 艳 ，扣 莉 云 ，蒋 敏 ，王 爱 萍
（郑州大学 生命科学学院 郑州 ４５０００１）
摘 要 旨在表达出囊膜糖蛋白 Ｅ２，为猪瘟病毒的亚单位 标 记 疫 苗 研 制、血 清 学 诊 断 等 提 供 依 据。 以 ｐＭＤ－ １８Ｔ－Ｅ２为模板，扩增猪瘟病毒Ｅ２ 基因，克隆至原核表达载体 ｐＥＴ－２８ａ，构建重组原 核 表 达 质 粒 ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２， 并在大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中诱导表达。结果显示，通过 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 凝胶电泳可检测到４６ｋｕ的 蛋 白 条 带， 与预期结果一致；目的蛋白主要以包涵体形式存在。将 Ｅ２蛋白变性纯化后，分别采用透析复性和 稀 释 复 性 ２ 种方法进行复性，成功得到可溶性 Ｅ２蛋白。 关键词 猪瘟病毒 Ｅ２；原核表达；包涵体；蛋白复性 中 图 分 类 号 Ｓ８５２．６５＋１ 文 献 标 志 码 Ａ 文 章 编 号 １００４－１３８９（２０１５）１０－００２４－０５
３０ ℃和２５ ℃诱导８ｈ，超声破碎后取上清和沉淀 进行 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 凝胶电泳。结果表明（图 ５），Ｅ２ 蛋白主要以包涵体形式存在。
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１～３．ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２－Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）诱 导 结 果 Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２－Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）；４．ｐＥＴ－２８ａ－ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）诱导结果 Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ－２８ａ－Ｒｏｓｅｔｔａ （ＤＥ３）；５～７．ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２－ＢＬ２１（ＤＥ３）诱 导 结 果 Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２－ＢＬ２１（ＤＥ３）；８．ｐＥＴ－２８ａ－ＢＬ２１（ＤＥ３）诱 导 结 果 Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ－２８ａ－ＢＬ２１（ＤＥ３）
７２ ℃ ９０ｓ，３５ 个 循 环，７２ ℃ １０ ｍｉｎ。 通 过 １０ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳鉴定 ＰＣＲ 产物。
采用 ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ 双 酶 切 回 收 ＰＣＲ 产 物 和 ｐＥＴ－２８ａ。产物 经 切 胶 回 收 后，通 过 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶１６ ℃连接过夜。
连接产物转化至 ＤＨ５α感受态细胞，３７ ℃ 培 养１６ｈ，挑取单克隆，进 行 菌 液 ＰＣＲ 和 双 酶 切 鉴 定，确 定 Ｅ２ 的 正 确 插 入 方 向，正 确 者 命 名 为 ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２，最后送至生 工 生 物 工 程（上 海）股 份 有限公司测序。 １．３ 猪瘟病毒 Ｅ２蛋白表达
西 北 农 业 学 报 ２０１５，２４（１１）：２４－２８ Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ Ｓｉｎｉｃａ
ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１５．１１．００５
网 络 出 版 日 期 ：２０１５－１１－１６ 网 络 出 版 地 址 ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１２２０．Ｓ．２０１５１１１６．１７２９．０１０．ｈｔｍｌ
猪瘟（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ，ＣＳＦ）是 由 猪 瘟 病毒（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）引 起 的 一 种 急 性 、发 热 性 传 染 病 ，具 有 高 度 的 传 染 性 和 致 死性。ＣＳＦＶ 是ｓｓＲＮＡ 病 毒，基 因 组 全 长 约 １２３ ｋｂ，仅含有一 个 大 的 开 放 阅 读 框 （ＯＲＦ），此 ＯＲＦ 翻译成含 ３ ８９８ 个 氨 基 酸 残 基、分 子 质 量 约 ４３８ ｋｕ 的 多 聚 蛋 白 ，并 进 一 步 在 病 毒 和 宿 主 细 胞 蛋 白 酶的作用下加工为成熟蛋白 。 ［１］
２ 结果与分析
２．１ ｐＥＴ－２８ａ－Ｅ２ 重组载体的构建 扩增得到的 Ｅ２片段大小约为１ １００ｂｐ，与预
计相符（图１）。重组质粒经 ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ双酶 切，得到大 小 约 １ １００ｂｐ 和 ５ ３００ｂｐ 的 片 段 （图 ２），测 序 符 合 率 ９９．７％ ，表 明 重 组 质 粒 构 建 成 功 。