细胞分子模型

细胞分子模型
分子水平的药物筛选模型： 受体、酶、通道、基因、其他
标准的体外分子水平筛选 • 优点： • 快速 • 微量 • 筛选结果准确、稳定，易于评价 • 不足： • 只能对特定靶点的单指标检测 • 提供化合物对靶点作用的有限信息，无法对
化合物的生物活性进行综合评价 • 单纯的分子水平的高通量药物筛选技术已不
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3 荧光检测分析技术 • 定量读取荧光密度；单次实验中同时获得其他荧光特性，
如荧光寿命、极化、淬灭，提高筛选的有效性，可快速、 多参数地评价样品和靶之间的相互作用 (1)极化荧光( fluorescence polarization, FP) 分析 生物体系中分子间相互作用，根据荧光标记的小分子在 游离和与大分子结合靶标2种状态时的极化荧光值不同 而区分 优点： • 不用分离荧光标记物，反应在均相溶液中进行 • 检测时间不会影响结果 • 高灵敏性、高稳定性、可重复性 • 操作简便，假阴性或假阳性率低 • 用于细胞水平的膜受体如GPCR、核受体调节剂的HTS筛 选，如促肾上腺皮质激素2α亚型受体(CRF2αR)的功能 分析中cAMP的直接检测
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第1节 概述
细胞分子模型与动物模型的区别： 动物模型 • 优点： • 传统的筛选方法 • 直接反映治疗效果、不良反应、毒性作
用 • 预测临床价值、应用前景 • 不足： • 筛选效率低，并非均有疾病模型，动物
个体差异，成本高 细胞分子模型
细胞、分子水平药物筛选模型
• 优点：
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优点：
• GFP自发荧光，且荧光稳定；不需其他的底 物和辅因子；GFP与其他蛋白嵌合后不影响 其自身荧光特性
• GFP及其变体：用于实时动态研究体内或细 胞水平的蛋白定位和转位，蛋白的降解，蛋 白-蛋白的相互作用，细胞骨架动力学，细 胞周期，检测目的基因表达变化
• β-内酰胺酶，水解荧光能量共振转移 ( FRET)底物CCF4 /AM行定量检测，或作为 核因子调节的指示蛋白，用于受来自百度文库功能筛选
受重组位点的影响，基因拷贝数不确定，阳 性克隆的产生率低，筛选时间长等 • 现用游离体载体( episomal vector)：转染 效率高，阳性克隆筛选速度快
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2 报告基因技术 • 将靶基因连接到细胞上，通过激活或抑制靶
基因导致报告基因的表达，通过比色、荧光 或发光的方法检测 • 简便，如荧光素酶( luciferase)和β-半乳 糖苷酶报告基因系统，不需裂解分离可直接 均质检测 • 用于活体细胞的报告基因多是绿色荧光蛋白 (GFP)，适于活体细胞检测，被称为生物传 感蛋白
• 荧光底物设计和人工合成： • 细胞筛选用的β-内酰胺酶(β-lactamase)报告基因
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(2)荧光共振能量转移( fluorescence resonance energy transfer, FRET) 指非放射性能量在适当 能量给予体和接受体之间转移
• 当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时，其能 量能有效转移给受体，导致受体发射荧光
• 供体和受体空间距离的变化能显著影响能量的有效转 移效率
病理细胞等 • 多数生物性物质均可通过转基因的方法由细
胞表达 (6)分子生物学和细胞生物学手段 • 特别是基因芯片技术 • 发现疾病有关基因,克隆 • 建立稳定细胞株 • 大规模药物筛选
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目前： (1) 微量化，超高通量化 1 536孔板，荧光方
法可达3 456－9 600孔 • 微量化技术是实行超高通量筛选( uHTS)的基
础 • 载体微孔板硬度、自动化加样精度 • 检测系统 • 数据分析系统 (2) 均质检测：一步加入
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(3) 多指标、多靶点、多通道检测是现今细胞水平 高通量筛选技术的核心和关键
• 光显微荧光成像技术是进行多指标检测的基础 • 多指标、多靶点检测有助于发现药物作用的新途
径，深入认识药物作用的机制 • 为筛选具有互补的多靶点作用机制的单一治疗药
• 耗材少
• 药物作用机制明确
• 筛选规模大，高通量筛选
• 已成为药物筛选的主要方法
• 快速、微量、大规模为特征的高通量筛选
背景：
•药物的作用机制要从细胞水平去探索
•潜在的药物作用靶点数目和有待筛选的化合物数目增多
特点：
•筛选规模和筛选速度更大
•筛选模型的检测技术能够更快速、全面反映被筛样品的生
物活性特征
能满足新药发现的需细胞分要子模型
• 受体筛选模型 • 受体与放射性配体结合模型：将受体、配体、
被测物及必要的辅助因子一起加入到缓冲溶 液中温孵 • 达到平衡后过滤, 滤纸上残留的即为结合的 放射性配体,通过液体闪烁计数来测量 • 灵敏度高、特异性强 • 适合大规模筛选
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• 酶筛选模型: • 筛选作用于酶的药物 • 主要观察药物对酶活性的影响 • 酶的反应底物和产物皆可作为检测指标,由此
物提供了手段和工具 (4) 实时动态检测和可视化 • 对活细胞进行荧光标记，荧光成像技术， • 分子水平的实时动态检测和可视化研究 • 自动图像分析和数据量化分析
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第３节 常用技术
1 细胞水平重组技术 • 重组技术是细胞水平高通量常用技术手段 • 经典方法是通过重组基因在宿主细胞基因组
的随机整合而产生稳定细胞株 • 不足：重组基因的定位不可预测，表达水平
确定反应速度
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第２节 细胞水平药物筛选模型
• 细胞水平药物筛选模型：以细胞功能为 基础的筛选模型
(1) 完整细胞，活细胞自然条件下研究药 物对生命体功能的影响，接近体内的生 化过程，比较准确地了解药物的生物学 特性，提供生物相关信息，一次试验可 获得多个参数的高内涵信息
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(2) 着眼于细胞整体的某些功能和信号转导途 径中的其他位点
• 在对每一个分子通路并不完全了解的情况下, 细胞水平筛选是唯一可用的方法
(3) 鉴定分子水平发现的化合物 (4) 观察被筛选样品对细胞的作用, 不反映药
物作用的具体途径和靶标, 只反映药物对细 胞生长过程的综合作用
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(5)细胞模型的材料来源较容易 • 用于药物筛选的细胞：正常细胞、转基因和