人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
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〔关键词〕 人成纤维细胞； 细胞分离； 培养； 鉴定 〔中图分类号〕 R34 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（ 2012） 06-1215-02； doi： 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 06. 047
人成纤维细胞（ Fibroblasts，Fbs） 是由胚胎时期间充质细胞 分化而来。成纤维细 胞 主 要 存 在 于 结 缔 组 织，且 细 胞 取 材 方 便、增殖能力强、生长旺盛，体外培养后细胞生物学特性稳定。 本研究旨在探讨人成纤维细胞分离、纯化培养的技术，为成体 细胞移植奠定基础。
1 材料与方法 1. 1 主 要 试 剂 DMEM / F12 （ Gibco ） ，优 等 胎 牛 血 清 （ Hyclone） ，胰蛋白酶（ Promega） ，Ⅳ型胶原酶、Triton X-100（ Sigma） ， 抗 Vimentin 单克隆抗体（ Santa Cruz） 。 1. 2 人成纤维细胞的分离与培养 在手术室无菌条件下，切 取成人四肢正常皮肤组织 0. 3 ～ 0. 5 cm2 ，用含双抗（ 100 U / ml 青霉素、100 U / ml 链霉素） 的 PBS 反复冲洗 3 次，去除血污并尽 量去除皮下结缔组织； 加入 1 ml 0. 25% 胰酶 4℃ 过夜，次日分 离表皮真皮； 使用含双抗的 PBS 反复冲洗 3 次； 用已灭菌的眼 科剪剪成 1 mm3 左右的组织小块，将组织块放入 50 ml 离心管 中，加入组织量 2 ～ 3 倍的 0. 2% Ⅳ型胶原酶，37℃ 消化，待组织 块呈棉絮状取出，在组织消化过程中适当摇动混悬液，以加快 消化进程； 向离心管中加入 2 ml PBS，反复吹打组织块，过 200 目筛网，制备单细胞悬液； 单细胞悬液 1 000 r / min 离心 10 min， 弃上清； 加入 4 ml 含双抗 10% Hyclone 胎牛血清 重悬细胞； 细 胞计数并以 2 × 106 / ml 细胞量接种于 25 cm2 培养瓶中，置于 37℃ ，5% CO2 ，饱和湿度培养箱中 20 min，PBS 反复冲洗 2 次， 尽量去除未贴壁细胞，以达到细胞纯化的目的； 更换新的含双 抗的 10% Hyclone 胎牛血清 4 ml，置于 37℃ ，5% CO2 ，饱和湿 度恒温培养箱中培养； 次日换夜； 以后每 2 ～ 3 d 换液一次。 1. 3 细胞形态学观察 利用倒置显微镜观察细胞生长情况及 形态变化。 1. 4 细胞标本的制备 将灭菌的盖玻片置于 24 孔板内； 将已 消化、离心洗涤的各组细胞用含 10% Hyclone 的胎牛血清培养
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分wenku.baidu.com离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
1 北华大学附属医院神经内科 2 吉林大学中日联谊医院放射线科 通讯作者： 张桂珍（ 1955-） ，女，博士生导师，教授，主要从事糖尿病分子
诊断与治疗研究。 第一作者： 王玲玲（ 1983-） ，女，主治医师，在读博士，主要从事糖尿病分
子诊断与治疗研究。
液重悬，加 入 24 孔 板，每 孔 加 0. 5 ml 细 胞 悬 液； 将 其 置 于 37℃ ，5% CO2 孵箱继续培养，待细胞融合达 80% ，吸弃原培养 液，加入 0. 01 mol / L PBS 冲洗 5 min，重复 2 次； 4% 多聚甲醛 固定，室温 20 min，蒸馏水冲洗 5 min，重复 2 次。 1. 5 细胞 HE 染色 将 1. 4 中处理的盖玻片进行以下步骤： 二甲苯（ Ⅰ） 5 ～ 10 min； 二甲苯（ Ⅱ） 5 ～ 10 min； 95% 乙醇（ Ⅰ） 1 ～ 3 min； 95% 乙 醇 （ Ⅱ） 1 ～ 3 min； 80% 乙 醇 1 min； 蒸 馏 水 1 min； 苏木精液染色 5 ～ 15 min； 流水稍洗去苏木精液 1 ～ 3 s； 1% 盐酸乙醇 1 ～ 3 s； 稍水洗 10 ～ 30 s； 促蓝液返蓝 10 ～ 30 s； 流 水冲洗 10 ～ 15 min； 蒸馏水过洗 1 ～ 2 s； 0. 5% 曙红液染色1 ～ 3 min； 蒸馏水稍洗 1 ～ 2 s； 80% 乙醇稍洗 1 ～ 2 s； 95% 乙醇（ Ⅰ） 3 ～ 5 min； 95% 乙醇（ Ⅱ） 3 ～ 5 min； 无水乙醇 5 ～ 10 min； 无水乙 醇 5 ～ 10 min； 二甲苯（ Ⅰ） 3 ～ 5 min； 二甲苯（ Ⅱ） 2 ～ 5 min； 二甲 苯（ Ⅲ） 3 ～ 5 min； 中性树胶封固定图片。 1. 6 细胞免疫组化 将 1. 4 中处理的盖玻片进行以下步骤： 细胞 上 滴 加 0. 1% TritonX-100，10 min，0. 1 mol / L PBS 冲 洗 5 min，2 次； 3 % H2 O2 溶液阻断 15 min，0. 1 mol / L PBS 冲洗 5 min，3 次； 血清封闭 30 min，滤纸擦掉多余血清； 加一抗孵育 液（ 稀释度为 1∶ 100） ，4℃ 过夜； 0. 1 mol / L PBS 冲洗 5min，3 次； 加入二抗 20 min，0. 1 mol / L PBS 冲洗 5 min，3 次； DAB 发色，水 洗终止； 苏木精复染细胞核，常规脱水透明，中性树脂封片。 对照组中一抗二抗均为 PBS。
人成纤维细胞（ Fibroblasts，Fbs） 是由胚胎时期间充质细胞 分化而来。成纤维细 胞 主 要 存 在 于 结 缔 组 织，且 细 胞 取 材 方 便、增殖能力强、生长旺盛，体外培养后细胞生物学特性稳定。 本研究旨在探讨人成纤维细胞分离、纯化培养的技术，为成体 细胞移植奠定基础。
1 材料与方法 1. 1 主 要 试 剂 DMEM / F12 （ Gibco ） ，优 等 胎 牛 血 清 （ Hyclone） ，胰蛋白酶（ Promega） ，Ⅳ型胶原酶、Triton X-100（ Sigma） ， 抗 Vimentin 单克隆抗体（ Santa Cruz） 。 1. 2 人成纤维细胞的分离与培养 在手术室无菌条件下，切 取成人四肢正常皮肤组织 0. 3 ～ 0. 5 cm2 ，用含双抗（ 100 U / ml 青霉素、100 U / ml 链霉素） 的 PBS 反复冲洗 3 次，去除血污并尽 量去除皮下结缔组织； 加入 1 ml 0. 25% 胰酶 4℃ 过夜，次日分 离表皮真皮； 使用含双抗的 PBS 反复冲洗 3 次； 用已灭菌的眼 科剪剪成 1 mm3 左右的组织小块，将组织块放入 50 ml 离心管 中，加入组织量 2 ～ 3 倍的 0. 2% Ⅳ型胶原酶，37℃ 消化，待组织 块呈棉絮状取出，在组织消化过程中适当摇动混悬液，以加快 消化进程； 向离心管中加入 2 ml PBS，反复吹打组织块，过 200 目筛网，制备单细胞悬液； 单细胞悬液 1 000 r / min 离心 10 min， 弃上清； 加入 4 ml 含双抗 10% Hyclone 胎牛血清 重悬细胞； 细 胞计数并以 2 × 106 / ml 细胞量接种于 25 cm2 培养瓶中，置于 37℃ ，5% CO2 ，饱和湿度培养箱中 20 min，PBS 反复冲洗 2 次， 尽量去除未贴壁细胞，以达到细胞纯化的目的； 更换新的含双 抗的 10% Hyclone 胎牛血清 4 ml，置于 37℃ ，5% CO2 ，饱和湿 度恒温培养箱中培养； 次日换夜； 以后每 2 ～ 3 d 换液一次。 1. 3 细胞形态学观察 利用倒置显微镜观察细胞生长情况及 形态变化。 1. 4 细胞标本的制备 将灭菌的盖玻片置于 24 孔板内； 将已 消化、离心洗涤的各组细胞用含 10% Hyclone 的胎牛血清培养
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分wenku.baidu.com离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
1 北华大学附属医院神经内科 2 吉林大学中日联谊医院放射线科 通讯作者： 张桂珍（ 1955-） ，女，博士生导师，教授，主要从事糖尿病分子
诊断与治疗研究。 第一作者： 王玲玲（ 1983-） ，女，主治医师，在读博士，主要从事糖尿病分
子诊断与治疗研究。
液重悬，加 入 24 孔 板，每 孔 加 0. 5 ml 细 胞 悬 液； 将 其 置 于 37℃ ，5% CO2 孵箱继续培养，待细胞融合达 80% ，吸弃原培养 液，加入 0. 01 mol / L PBS 冲洗 5 min，重复 2 次； 4% 多聚甲醛 固定，室温 20 min，蒸馏水冲洗 5 min，重复 2 次。 1. 5 细胞 HE 染色 将 1. 4 中处理的盖玻片进行以下步骤： 二甲苯（ Ⅰ） 5 ～ 10 min； 二甲苯（ Ⅱ） 5 ～ 10 min； 95% 乙醇（ Ⅰ） 1 ～ 3 min； 95% 乙 醇 （ Ⅱ） 1 ～ 3 min； 80% 乙 醇 1 min； 蒸 馏 水 1 min； 苏木精液染色 5 ～ 15 min； 流水稍洗去苏木精液 1 ～ 3 s； 1% 盐酸乙醇 1 ～ 3 s； 稍水洗 10 ～ 30 s； 促蓝液返蓝 10 ～ 30 s； 流 水冲洗 10 ～ 15 min； 蒸馏水过洗 1 ～ 2 s； 0. 5% 曙红液染色1 ～ 3 min； 蒸馏水稍洗 1 ～ 2 s； 80% 乙醇稍洗 1 ～ 2 s； 95% 乙醇（ Ⅰ） 3 ～ 5 min； 95% 乙醇（ Ⅱ） 3 ～ 5 min； 无水乙醇 5 ～ 10 min； 无水乙 醇 5 ～ 10 min； 二甲苯（ Ⅰ） 3 ～ 5 min； 二甲苯（ Ⅱ） 2 ～ 5 min； 二甲 苯（ Ⅲ） 3 ～ 5 min； 中性树胶封固定图片。 1. 6 细胞免疫组化 将 1. 4 中处理的盖玻片进行以下步骤： 细胞 上 滴 加 0. 1% TritonX-100，10 min，0. 1 mol / L PBS 冲 洗 5 min，2 次； 3 % H2 O2 溶液阻断 15 min，0. 1 mol / L PBS 冲洗 5 min，3 次； 血清封闭 30 min，滤纸擦掉多余血清； 加一抗孵育 液（ 稀释度为 1∶ 100） ，4℃ 过夜； 0. 1 mol / L PBS 冲洗 5min，3 次； 加入二抗 20 min，0. 1 mol / L PBS 冲洗 5 min，3 次； DAB 发色，水 洗终止； 苏木精复染细胞核，常规脱水透明，中性树脂封片。 对照组中一抗二抗均为 PBS。