原代神经细胞培养

原代神经细胞培养

新生鼠神经元细胞的培养

准备工作：

1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过

夜烤干。

2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；

0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。

3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。包被过程：0.05%poly-lysin滴于

置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。

4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。

取材：

1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm

的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。

2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。

3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相

应部位的组织,分别放在相应的皿中。

4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分

钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。

5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离

心沉淀。

6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。

7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织

块明显变小。

8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。

9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖

玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。

10、2小时后补培养基0.5ml每孔（12孔板为例）。注：补DMEM／10%FBS 或 DMEM／

10FBS：NB 1：1或者NB均可。

11、第二天如果细胞太脏，可以用预热的D-PBS洗两遍，然后全换液。

12、第三天，如果胶质增值至面积的一般以上，可加胶质抑制剂FUDR（sigma）或AraC

（sigma）。以后2-3天换一次液。

培养基：

NB培养基（添加：2％B27；首次补液2mM glutamine，以后0.5mM glutamine或不加glutamine），0.5ml/孔（12孔板），隔2日半量换液，视培养基颜色和细胞状态决定。

可选择的培养条件：MEM培养基（添加：1％B27；0.6%glucose；首次补液2mM glutamine，以后0.5mM glutamine或不加glutamine），0.5ml/孔（12孔板），隔1－2日半量换液，视培养基颜色和细胞状态决定。

注：

该取材方法所取神经元纯度相对不高，会夹杂有胶质细胞。从胚胎取材能获得较高纯度神经元，一般神经元的取材都是取孕18天鼠。

原代神经细胞培养

E18神经元细胞的培养

E18神经元细胞的培养和新生鼠神经元细胞的培养步骤类似，唯一的区别在于多了从怀孕的母鼠中取出孕鼠的步骤。

准备工作：

同新生鼠神经元细胞的培养

其中母鼠怀孕时间的控制需要注意，可以在晚上将几只雌鼠和雄鼠混合笼养，第二天早上雌雄分开，这样时间的误差就在12小时左右。

取材：

1.从-200C取出四个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于盛放胚胎，一大皿用于冷却剥出

的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第四个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。

2.将孕鼠用乙醚麻醉，腹部用75%酒精消毒，用剪刀将外层的皮肤剪开足够大的面积，然

后换一把干净的剪刀剪开内层的皮肤，露出胚胎。

3.剥离处完整的小鼠，断头处死。

4.弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应

部位的组织,分别放在相应的皿中。

5.将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，

吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。

6.消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心

沉淀。

7.吸弃上清，注意不要将组织吸出。

8.加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块

明显变小。

9.放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。

10.计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻

片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。

11.2小时后补培养基0.5ml每孔（12孔板为例）。注：补DMEM／10%FBS 或 DMEM／10FBS：

NB 1：1或者NB均可。

12.第三天以后，如果胶质增值至面积的一般以上，可加胶质抑制剂FUDR（sigma）或AraC

（sigma）。以后2-3天换一次液。

培养基：

NB培养基（添加：2％B27；首次补液2mM glutamine，以后0.5mM glutamine或不加glutamine），0.5ml/孔（12孔板），隔2日半量换液，视培养基颜色和细胞状态决定。

可选择的培养条件：MEM培养基（添加：1％B27；0.6%glucose；首次补液2mM glutamine，以后0.5mM glutamine或不加glutamine），0.5ml/孔（12孔板），隔1－2日半量换液，视培养基颜色和细胞状态决定。