癫痫清抗癫痫物质基础研究_张翼

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辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 11 期
癫痫清抗癫痫物质基础研究
张翼，姜鸿，贾冬，尤献民，王健，盛亮亮，王帅
（ 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）
摘 要：目的： 研究复方中药癫痫清抗癫痫的药效物质基础，从而确定本处方的提取方法和提取工艺。方法： 采用 SPSS 统计分析方法，以癫痫清处方的 117 个色谱峰的相对峰面积为自变量（ X） ，提取物抗癫痫试验药理结果为因变量 （ Y） ，进行相关分析和回归分析。结果： 得到 117 个色谱峰与药理结果的相关系数和回归方程。结论： 初步确定处方中 41 个色谱峰所代表的化学组分为癫痫清处方中具有抗癫痫的药效物质基础； 并确定了处方中各药材的有效成分及有效 部位和各药材的提取方法。
析探讨癫痫清处方中可能的药效物质基础。
4. 2 相关分析 在惊厥潜伏期试验中，有效变量应与
药理结果 Y1 （ 惊厥潜伏期） 呈正相关关系，相关分析
图 3 提取物ⅢHPLC 色谱图
结果与 Y1 密切正相关的变量有： X3 、X10 、X32 、X34、X46 、 X60 、X67 、X68 、X69 、X72 、X82 、X83 、X88 、X89 、X93 、X97 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱX98 、
按处方配比，取处方量药材，置圆底烧瓶中，加水
6 倍量，用电热套回流提取 2h，放冷，滤过，滤液混匀， 量取 1 /2 滤液，浓缩至相对密度 1. 10 左右（ 60℃ 时测 定） 并置减压箱内减压干燥至干，称定重量，粉碎成细 粉，加糊精稀释成含生药量为 10g / g 的粉末，作为Ⅰ号 提取物； 剩余 1 /2 溶液置分液漏斗中，依次用等倍量醋 酸乙酯、正丁醇各萃取 3 次，分别合并各自萃取溶液， 用旋转蒸发仪减压回收溶剂，残渣置减压箱内减压干 燥至干，称定重量，粉碎成细粉，分别加入糊精适量，配 制成含生药量为 10g / g 的粉末： Ⅱ号提取物（ 醋酸乙酯 层） 、Ⅲ号提取物（ 正丁醇层） ； 取经过上述溶剂萃取后 的水层溶液，浓缩至每 1mL 含 2g 生药，放至室温，边 搅拌边加入等倍量乙醇，继续搅拌 10min，静置过夜， 取上清液回收乙醇，浓缩并置减压箱内减压干燥至干， 称定重量，粉碎成细粉，加糊精适量，配制成含生药量
英钠组、癫痫清提取物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号组，每组 10
只，雌 雄 各 半。 各 给 药 组 分 别 灌 胃 给 药，给 药 体 积
40mL / kg，模型组灌胃给予同体积蒸馏水，每日 1 次，
图 1 提取物ⅠHPLC 色谱图
连续 3 天。给药 50min 后，各组分别腹腔注射戊巴比 妥钠 45mg / kg，30min 内翻正反射消失 1min 以上者表
品溶液。
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号组，每组 10 只，雌雄各半。各给药组分
2. 4 HPLC 指纹图谱分析 取各供试品溶液，在上述 别灌胃给药，给药体积 40mL / kg，模型组灌胃给予同体
色谱条件下进样，5 个提取物以提取物Ⅰ为准共得到 117 个色谱峰，见图 1 ～ 5，用 X1 ～ X117 分别代表各色谱 峰校正后的峰面积。
提取物Ⅲ 8． 6 ± 2． 7 5． 0 ± 1． 1▲ 162． 9 ± 85． 8▲
提取物Ⅳ 8． 7 ± 1． 6▲ 3． 6 ± 0． 5▲▲ 140． 3 ± 69． 8
提取物Ⅴ 6． 4 ± 1． 1 5． 0 ± 1． 3 170． 5 ± 89． 0▲
注： 与空白对照组比较，▲P ＜ 0. 05，▲▲P ＜ 0. 01。
器，检测波长： 在线波长； 柱温： 25℃ ； 谱图记录 90min。
2. 3 供试品溶液制备 取上述Ⅰ ～ Ⅴ号提取物粉末
图 5 提取物ⅤHPLC 色谱图
各适量，分别精密称取 5g，加 50% 乙醇（ V / V） 100mL， 称重，回 流 提 取 0. 5h，放 至 室 温，称 重，用 50% 乙 醇
DAD 检测 器 （ 美 国 Agilent 公 司 生 产） 。色 谱 纯 乙 腈 （ 美国天地公司生产） ； 娃哈哈纯净水（ 杭州哇哈哈集
图 4 提取物ⅣHPLC 色谱图
团有限公司生产） ； 其他试剂均为分析纯。
2. 2 色谱条件 色谱柱： EclipseXDB － C185μ，250mm
× 4. 6mm（ Agilent 公司生产） ； 流动相 A： 娃哈哈纯净 水，B： 乙腈； 梯度洗脱。流速： 1mL·min － 1 ； DAD 检测
致谢： 本研究得到解放军中药研究所肖小河研究 员、赵艳玲研究员的大力支持，在此一并致谢！
参考文献 ［1］ 肖小河，金城，赵中振，等． 论中药质量控制与评价模式的创新与
发展［J］． 中国中药杂志，2007，32（ 14） ： 1377． ［2］ 黄挺，吴万垠，李勇，等． 薏苡仁油注射液和超液化碘油介入治疗
3讨论 目前，中药质量的主要控制模式是化学含量测定
法，由于多数中药有效成分尚不清楚，相当数量中药所 含化学成分与其药效并无关联，如 2010 年版《中国药 典》中以测定甘油三油酸酯来控制薏苡仁质量［6］，而甘 油三油酸酯与薏苡仁药理作用的关系尚不确切。本研 究基于薏苡 仁 对 肿 瘤 细 胞 具 有 抑 制 作 用 的 药 理 学 基 础，从抗肿瘤生物活性检测角度初步建立了薏苡仁抗 肿瘤生物效价方法。同传统的化学含量测定法相比， 直接关注药理作用是本研究方法的特点。由于多数中 药生物活性不如化学药品和生物制品强，因此，选择合 适的检测技术是中药生物效价检测方法建立的重要环 节。本研究 建 立 的 基 于 MTT 法 的 薏 苡 仁 抑 制 肝 癌 2215 细胞生物活性检测方法，已经广泛运用于生物制
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X106 、X108 、X114 。 经过相关分析，共有 X3 、X4 、X5 、X10 、X18 、X23 、X30 、
X32 、X34、X46 、X60 、X67 、X68 、X69 、X72 、X82 、X83 、X84 、X88 、 X89 、X93 、X97 、X98 、X105 、X106 、X108 、X114 、X115 等 28 个化学组 分可能为癫痫清处方抗癫痫的药效物质基础。 4. 3 回归分析 在惊厥潜伏期中，变量 X3 、X10 、X17、 X32 、X40 、X46 、X60 、X68 、X83 、X89 、X93 、X98 、X105 、X106 、X108 被 引入回归方程，X17、X40 的回归系数为负数，与药效预 期的结果相反，被剔除； 在睡眠潜伏期中，变量 X4 、X5 、 X18 、X32 、X38 、X40 、X46 、X60 、X67 、X83 、X84 、X88 、X89 、X93 、X97 、 X98 、X108 、X115 被引入回归方程，X38 、X40 的回归系数为正 数，与药效预期的结果相反，被剔除； 在睡眠时间中，变 量 X10 、X23 、X30 、X40 、X46 、X60 、X67 、X72 、X82 、X83 、X89 、X93 、 X97 、X98 、X105 、X114 、X117 被引入回归方程，但 X40 、X117 回归 系数都为负数，与药效预期的结果相反，被剔除。
［J］． 陕西医学杂志，2007，36（ 12） ： 1682 － 1684． ［5］ 周海钧． 药品生物检定［M］． 北京： 人民卫生出版社，2005： 393 －
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2010： 353 － 354．
品的生物检测中，具有客观、灵敏、准确、高效、方便的 特点。可为更好地评价薏苡仁质量提供了新的技术支 撑。实验过程中发现，培养板边缘效应会引起一定误 差，因此，宜将培养板两侧孔设为空白。
MTT 法可以作为生物效价检测方法之一用于中 药品质评价，由于中药有多方面的药理作用，同时，根 据现代药品检验的发展趋势，最好筛选出易于培养，检 测速度快，与中药药理直接相关的生物模型。
X105 、X106 、X108 ； 在睡眠试验中，有效变量应与药理结果 Y2 （ 睡眠潜伏期） 呈负相关关系，Y3 （ 睡眠时间） 呈正相 关关系，相关分析结果与 Y2 有密切负相关的变量有：
X4 、X5 、X18 、X32 、X60 、X67 、X69 、X72 、X83 、X93 、X97 、X98 、X105 、 X106 、X108 、X115 ； 与 Y3 密 切 正 相 关 的 变 量 有： X10 、X23 、 X30 、X46 、X67 、X68 、X72 、X82 、X83 、X84 、X88 、X97 、X98 、X105 、
收稿日期：2011 － 03 － 15 基金项目：国家科技重大新药创制专项课题（ 2009ZX09103） 作者简介：张翼（ 1986 － ） ，男，四川自贡人，硕士研究生，研究方向： 中药
复方配伍研究。 通讯作者：贾冬（ 1963 － ） ，男，河北丰润人，研究员、主任中药师，博士研
究生导师，研究方向： 中药复方配伍研究，新药药效学和安全 性评价研究，E － mail： jiadg@ yahoo． com． cn。
大鼠肝癌的研究［J］． 中华肝脏病杂志，2002，10（ 6） ： 452 － 454． ［3］ 李大鹏． 康莱特注射液与化疗药合用对裸鼠移植人肺癌 A549 的抑瘤
作用的研究［J］． 中药新药与临床药理，2005，15（ 2） ： 109 － 111． ［4］ 李昌生，卢云． 康莱特促进肝癌细胞凋亡相关分子的研究进展
关键词：癫痫清； 物质基础； 相关分析； 回归分析； 癫痫 中图分类号：R742． 1 文献标识码：A 文章编号：1000 － 1719（2011）11 － 2234 － 03
癫痫清处方由石菖蒲等 7 味中药组成，本处方具 有豁痰息风、活血通络、开窍益智的功效； 主治痰瘀内 阻的痫证。 本 研 究 是 将 癫 痫 清 提 取 液 按 不 同 化 学 极 性，分离成不同化合物成分群，对不同化合物成分群进 行抗癫痫试验，将药效学实验结果与各提取物指纹图 谱峰相对峰面积相关联，通过 SPSS 统计软件的相关分 析和回归分析初步确定癫痫清处方中与抗癫痫作用相 关的色谱峰，为癫痫清药效物质基础的进一步深入研 究奠定科学的理论基础。通过与处方中药材的指纹图 谱对比，确定了处方中各药材的有效成分及有效部位， 从而确定了各药材的提取方法，为癫痫清下一步的工 艺研究确立了方向。 1 提取物制备