不同方法处理724树脂对蛋清溶菌酶吸附作用的影响
蛋清溶菌酶提取技术的研究共3篇
蛋清溶菌酶提取技术的研究共3篇蛋清溶菌酶提取技术的研究1蛋清溶菌酶提取技术的研究概述在医学、食品、制药等行业中，蛋清溶菌酶（ovomucin）是一种重要的蛋白质，在不同领域中有不同的应用价值。
目前，提取蛋清溶菌酶的方法有多种，根据对目标产物的要求，选择合适的提取工艺是提高提取效率、降低成本，同时保证产品品质的关键。
传统的蛋清溶菌酶提取方法包括酸碱处理、物理打碎等方法，虽然能得到目标产物，但这种方法存在不少问题，例如操作复杂，产物纯度不高等。
近年来，一些新技术如超声波提取、微波提取等逐渐被应用到蛋清溶菌酶提取中，为蛋清溶菌酶提取研究带来了新思路和新突破。
酸碱处理法酸碱处理法是传统的蛋清溶菌酶提取方法，主要是通过对蛋清的酸碱性调节使得蛋清溶菌酶在溶液中释放。
酸碱处理法操作简单，但是由于酸碱处理对蛋清溶菌酶的结构影响较大，使其产物的纯度较低。
物理打碎法物理打碎法是另一种常用的蛋清溶菌酶提取方法，主要是通过机械力的作用使蛋清溶菌酶从细胞中释放。
其优点是成本低，但存在操作复杂、易受外界因素影响，同时产物纯度低的缺陷。
超声波提取法超声波提取法是一种新兴的蛋清溶菌酶提取技术，该方法通过超声波的力量使细胞壁破裂，从而使蛋清溶菌酶易于释放。
相比传统的提取方法，该方法具有操作简单，提取效率高，提取速度快，产物纯度优等明显优点。
微波提取法微波提取法是另一种新兴的提取技术，该方法主要是通过微波辐射使蛋清细胞壁被加热；随着温度升高，蛋清溶菌酶会逐渐释放。
该方法具有提取速度快、提取效率高等优点，但是同时由于微波剩余辐射等原因，该方法的应用还存在一些安全隐患。
总结综上所述，提取蛋清溶菌酶是目前相关行业中的重要问题之一，选择适合的提取方法具有重要的实际应用价值。
传统的方法虽然操作简单，但存在许多问题，因此越来越多的新技术被应用到该领域。
超声波提取、微波提取是比较新兴的技术，在提取效率，产物纯度等方面都具有很大的优势。
我们需要深入研究新技术在蛋清溶菌酶提取中的应用，不断探索新的提取方案，为相关行业的发展贡献力量提取蛋清溶菌酶是一个重要的问题，不仅在生命科学研究中有广泛应用，而且在食品工业、医药等领域也有着重要的应用价值。
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋白：4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。
离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚乙二醇浓缩：盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；3·冷冻干燥：用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成；②溶菌酶的处理：用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染色和脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干净，再用脱色液脱色。
溶菌酶的制备
溶菌酶的制备[适用对象]生物工程专业[实验学时]18学时一、实验目的1、掌握：用阳离子交换树脂724树脂层析分离溶菌酶；透析的操作和盐析的操作。
2、了解：溶菌酶的制备的基本过程和溶菌酶的应用与溶菌酶的活性检测方法。
二、实验原理溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清里，蛋清溶菌酶含量丰富，溶菌酶是一种碱性球蛋白，在pH6.5时，带正电荷，可与阳离子交换剂进行离子交换，进行粗分离，蛋白质溶液可以盐析沉淀，蛋白质不能透过半透膜，可用透析除盐进行精纯。
三、仪器设备离心机、冷冻干燥机、低温冰箱、透析代、层析柱等。
四、相关知识点多课程知识点：蛋白质化学特点，生化提取方法：蛋白质分解方法，离子交换原理与方法。
本课程知识点综合：蛋白质制备方法。
五、实验步骤（一）724树脂的预处理1、水浸泡，浮洗市售724树脂200g用蒸馏水500ml浸泡30分钟，搅拌稍静置，将细小颗粒浮洗掉。
2、泡酸4%盐酸处理浸泡1小时，水洗中性。
3、泡碱4%氢氧化钠处理浸泡1小时，水洗中性，再用pH6.5 PBS浸泡平衡，得钠型724树脂。
（二）原料处理1、取蛋清每组打新鲜鸡蛋20个取蛋清约200ML于2000ML烧杯中。
2、除杂质新鲜蛋清除去脐带、弹壳碎片等杂质。
3、预冷新鲜蛋清置于4℃冰箱预冷。
（三）粗纯1、吸附处理的新鲜蛋清用处理好的724树脂100g ，在5-10℃搅拌吸附2小时。
2、洗涤吸附完毕，树脂用蒸馏水洗涤3次，再用0.15M, pH6.5 PBS洗涤树脂，滤干树脂，除去洗涤液。
3、洗脱洗涤完后树脂装入层析柱，用2/3体积的10%硫酸铵洗脱2次，收集洗脱液。
4、沉淀10%硫酸铵洗脱液加固体硫酸铵至总液含40%硫酸铵进行盐析沉淀，沉淀滤干得溶菌酶粗品。
（四）精纯1、溶解溶菌酶粗品用一倍量蒸馏水溶解成溶菌酶粗品液。
2、透析膜前处理市售透析膜，用蒸馏水浸泡，煮沸。
冷却，取出，用橡皮筋系紧一端。
试试漏不漏水。
3、透析溶菌酶粗品液装入透析袋，系紧于装有蒸馏水的烧杯中透析8小时，透析2-3次，即换水2-3次。
树脂吸附法分离蛋清溶菌酶的原理
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鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定
进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。
国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目 前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发 达国家的鲜蛋加工业可以加工较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰 而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的 氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶， 或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。 缺点： 由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它 在工业上的大规模利用。
目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意 大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。 近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了 其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模 约为700吨。
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。
（2）非酶学测定法： 电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活 性及失去活性的溶菌酶总量。
免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高， 为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验 条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应 用。
盐析法
1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重 要方法之一。
价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓 度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。 盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或 1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。
蛋清溶菌酶的研究
1 前言1.1 溶菌酶溶菌酶(Lysozyme, EC) 又称细胞壁溶解酶（Muramidase）是一种细胞非特异性免疫蛋白，是由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在 1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。
广泛存在于生物体的体液和组织液中，包括植物汁液、动物分泌液、人的眼泪、唾液、乳汁、禽蛋及部分细菌中。
其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。
但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为 0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。
它是一种作用于微生物细胞壁的胞壁质水解酶，根据作用的微生物的种类不同，可分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
根据作用位点不同，细菌细胞壁溶菌酶可分为：水解肽聚糖主链的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺之间β-1, 4 糖苷键的胞壁质酶作用于肽聚糖侧链酰胺键的酰胺酶，和作用于肽链尾端的内肽酶，具体见图 1-1。
根据来源不同可分为：T4 噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和动物溶菌酶，其中动物溶菌酶又细分为：C 型(chicken-lysozyme type)、G 型(goose-type)和 I 型(invertebrate-type)溶菌酶。
人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。
本文中选取来源于鸡蛋清中的溶菌酶即 C 型溶菌酶。
图 1-1 胞壁质水解酶的类型及其水解位点Fig 1-1 Types of Murein hydrolases and their catalytic sites on peptide.1.1.1鸡蛋清溶菌酶的物理化学性质鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解溶壁小球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌基本上不起作用。
当有EDTA存在时，某些革兰氏阴性菌也可以被该酶分解。
鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。
鸡蛋中溶菌酶的提取
鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings Li Huay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。
溶菌酶的提取工艺路线
溶菌酶的提取工艺路线1前言：1.1溶菌酶性质溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用0白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃，pH值为3条件下，15min后活力保持87%。
抑制剂：有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。
1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。
通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。
01.2溶菌酶来源该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
1.2溶菌酶应用1．溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。
现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。
2．溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。