不同方法处理724树脂对蛋清溶菌酶吸附作用的影响
蛋清溶菌酶提取技术的研究共3篇
蛋清溶菌酶提取技术的研究共3篇蛋清溶菌酶提取技术的研究1蛋清溶菌酶提取技术的研究概述在医学、食品、制药等行业中，蛋清溶菌酶（ovomucin）是一种重要的蛋白质，在不同领域中有不同的应用价值。
目前，提取蛋清溶菌酶的方法有多种，根据对目标产物的要求，选择合适的提取工艺是提高提取效率、降低成本，同时保证产品品质的关键。
传统的蛋清溶菌酶提取方法包括酸碱处理、物理打碎等方法，虽然能得到目标产物，但这种方法存在不少问题，例如操作复杂，产物纯度不高等。
近年来，一些新技术如超声波提取、微波提取等逐渐被应用到蛋清溶菌酶提取中，为蛋清溶菌酶提取研究带来了新思路和新突破。
酸碱处理法酸碱处理法是传统的蛋清溶菌酶提取方法，主要是通过对蛋清的酸碱性调节使得蛋清溶菌酶在溶液中释放。
酸碱处理法操作简单，但是由于酸碱处理对蛋清溶菌酶的结构影响较大，使其产物的纯度较低。
物理打碎法物理打碎法是另一种常用的蛋清溶菌酶提取方法，主要是通过机械力的作用使蛋清溶菌酶从细胞中释放。
其优点是成本低，但存在操作复杂、易受外界因素影响，同时产物纯度低的缺陷。
超声波提取法超声波提取法是一种新兴的蛋清溶菌酶提取技术，该方法通过超声波的力量使细胞壁破裂，从而使蛋清溶菌酶易于释放。
相比传统的提取方法，该方法具有操作简单，提取效率高，提取速度快，产物纯度优等明显优点。
微波提取法微波提取法是另一种新兴的提取技术，该方法主要是通过微波辐射使蛋清细胞壁被加热；随着温度升高，蛋清溶菌酶会逐渐释放。
该方法具有提取速度快、提取效率高等优点，但是同时由于微波剩余辐射等原因，该方法的应用还存在一些安全隐患。
总结综上所述，提取蛋清溶菌酶是目前相关行业中的重要问题之一，选择适合的提取方法具有重要的实际应用价值。
传统的方法虽然操作简单，但存在许多问题，因此越来越多的新技术被应用到该领域。
超声波提取、微波提取是比较新兴的技术，在提取效率，产物纯度等方面都具有很大的优势。
我们需要深入研究新技术在蛋清溶菌酶提取中的应用，不断探索新的提取方案，为相关行业的发展贡献力量提取蛋清溶菌酶是一个重要的问题，不仅在生命科学研究中有广泛应用，而且在食品工业、医药等领域也有着重要的应用价值。
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋白：4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。
离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚乙二醇浓缩：盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；3·冷冻干燥：用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成；②溶菌酶的处理：用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染色和脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干净，再用脱色液脱色。
溶菌酶的制备
溶菌酶的制备[适用对象]生物工程专业[实验学时]18学时一、实验目的1、掌握：用阳离子交换树脂724树脂层析分离溶菌酶；透析的操作和盐析的操作。
2、了解：溶菌酶的制备的基本过程和溶菌酶的应用与溶菌酶的活性检测方法。
二、实验原理溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清里，蛋清溶菌酶含量丰富，溶菌酶是一种碱性球蛋白，在pH6.5时，带正电荷，可与阳离子交换剂进行离子交换，进行粗分离，蛋白质溶液可以盐析沉淀，蛋白质不能透过半透膜，可用透析除盐进行精纯。
三、仪器设备离心机、冷冻干燥机、低温冰箱、透析代、层析柱等。
四、相关知识点多课程知识点：蛋白质化学特点，生化提取方法：蛋白质分解方法，离子交换原理与方法。
本课程知识点综合：蛋白质制备方法。
五、实验步骤（一）724树脂的预处理1、水浸泡，浮洗市售724树脂200g用蒸馏水500ml浸泡30分钟，搅拌稍静置，将细小颗粒浮洗掉。
2、泡酸4%盐酸处理浸泡1小时，水洗中性。
3、泡碱4%氢氧化钠处理浸泡1小时，水洗中性，再用pH6.5 PBS浸泡平衡，得钠型724树脂。
（二）原料处理1、取蛋清每组打新鲜鸡蛋20个取蛋清约200ML于2000ML烧杯中。
2、除杂质新鲜蛋清除去脐带、弹壳碎片等杂质。
3、预冷新鲜蛋清置于4℃冰箱预冷。
（三）粗纯1、吸附处理的新鲜蛋清用处理好的724树脂100g ，在5-10℃搅拌吸附2小时。
2、洗涤吸附完毕，树脂用蒸馏水洗涤3次，再用0.15M, pH6.5 PBS洗涤树脂，滤干树脂，除去洗涤液。
3、洗脱洗涤完后树脂装入层析柱，用2/3体积的10%硫酸铵洗脱2次，收集洗脱液。
4、沉淀10%硫酸铵洗脱液加固体硫酸铵至总液含40%硫酸铵进行盐析沉淀，沉淀滤干得溶菌酶粗品。
（四）精纯1、溶解溶菌酶粗品用一倍量蒸馏水溶解成溶菌酶粗品液。
2、透析膜前处理市售透析膜，用蒸馏水浸泡，煮沸。
冷却，取出，用橡皮筋系紧一端。
试试漏不漏水。
3、透析溶菌酶粗品液装入透析袋，系紧于装有蒸馏水的烧杯中透析8小时，透析2-3次，即换水2-3次。
树脂吸附法分离蛋清溶菌酶的原理
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鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定
进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。
国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目 前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发 达国家的鲜蛋加工业可以加工较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰 而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的 氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶， 或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。 缺点： 由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它 在工业上的大规模利用。
目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意 大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。 近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了 其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模 约为700吨。
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。
（2）非酶学测定法： 电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活 性及失去活性的溶菌酶总量。
免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高， 为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验 条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应 用。
盐析法
1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重 要方法之一。
价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓 度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。 盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或 1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。
蛋清溶菌酶的研究
1 前言1.1 溶菌酶溶菌酶(Lysozyme, EC) 又称细胞壁溶解酶（Muramidase）是一种细胞非特异性免疫蛋白，是由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在 1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。
广泛存在于生物体的体液和组织液中，包括植物汁液、动物分泌液、人的眼泪、唾液、乳汁、禽蛋及部分细菌中。
其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。
但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为 0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。
它是一种作用于微生物细胞壁的胞壁质水解酶，根据作用的微生物的种类不同，可分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
根据作用位点不同，细菌细胞壁溶菌酶可分为：水解肽聚糖主链的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺之间β-1, 4 糖苷键的胞壁质酶作用于肽聚糖侧链酰胺键的酰胺酶，和作用于肽链尾端的内肽酶，具体见图 1-1。
根据来源不同可分为：T4 噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和动物溶菌酶，其中动物溶菌酶又细分为：C 型(chicken-lysozyme type)、G 型(goose-type)和 I 型(invertebrate-type)溶菌酶。
人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。
本文中选取来源于鸡蛋清中的溶菌酶即 C 型溶菌酶。
图 1-1 胞壁质水解酶的类型及其水解位点Fig 1-1 Types of Murein hydrolases and their catalytic sites on peptide.1.1.1鸡蛋清溶菌酶的物理化学性质鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解溶壁小球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌基本上不起作用。
当有EDTA存在时，某些革兰氏阴性菌也可以被该酶分解。
鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。
鸡蛋中溶菌酶的提取
鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings Li Huay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。
溶菌酶的提取工艺路线
溶菌酶的提取工艺路线1前言：1.1溶菌酶性质溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用0白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃，pH值为3条件下，15min后活力保持87%。
抑制剂：有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。
1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。
通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。
01.2溶菌酶来源该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
1.2溶菌酶应用1．溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。
现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。
2．溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。
溶菌酶结构特点及分离纯化的研究
溶菌酶结构特点及分离纯化的研究摘要：本文对溶菌酶的结构特点和作用机制做了简单介绍，并对近年来溶菌酶分离纯化的方法,如结晶法、离子交换法、亲和层析法、膜处理技术、反胶团萃取法等进行了综述。
关键词：溶菌酶、结构特点、作用机制、分离纯化1 前言溶菌酶(1ysozyme;EC3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
人们对溶菌酶的研究始于本世纪初,英国细菌学家弗莱明(Flem ing)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
在自然界中,溶菌酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁体液、木瓜、大麦、无花果和卷心菜等植物中以及微生物中也含此酶[1],其中以蛋清含量最为丰富，约0.3%[2]。
2 溶菌酶的结构特点和作用机制2.1 溶菌酶的类型溶菌酶按其所作用的微生物不同分为两大类,即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
细菌细胞壁溶菌酶有两种,一种是作用于β-1.4糖苷键的细胞壁溶解酶,另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。
真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶[3]。
2.2 溶菌酶的结构鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶,它由18种129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,在分子中的4对含硫氨基酸Cys间形成4个S-S键。
Phillips 等人1956年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构,溶菌酶分子近椭圆形,大小为4.5nm×3.0nm×3.0nm,其构象复杂,α螺旋仅占25％,在分子的一些区域有伸展着的β片层结构,研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的,疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用,其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙,这是溶菌酶的活性部位。
溶菌酶提取试验的适宜条件探讨
溶 菌酶是 一 种有效 的抗菌 剂 ，又称 胞壁 质酶 或 Ｎ 酰 胞 壁 质 聚糖 水 解酶 ，广泛 存 在 于动 物 、植 物 及 一
微生 物体 中。鸡蛋 和 哺乳 动物 的乳 汁是溶 菌 酶 的主要 来源 ，其 中 以鸡 蛋 清 中含 量 较高 。 由于离子 交换 树
脂 吸 附法 的操 作过 程 简单且 易 于完 成 ，因而 一 般 采 用 该 方法 从 鸡 蛋 清 中提 取 溶菌 酶 ，其 中蛋 白质 含 量 （ 包括 酶 吸附量 和 杂蛋 自含量 ）通 过 测定其 吸 光度 值 来 确定 。下 面 ，笔 者对 溶 菌 酶提 取 试 验 的适 宜 条件
研 究所 ） ；硫 酸铵 、磷 酸二 氢钠 、磷 酸氢 二钠 、乙二胺 四乙酸钠 、丙 酮等 试剂 （ 皆为 国产分 析纯 ） 。
厂） Ｓ ２恒温 水浴 锅 （ ；Ｇ Ｙ一 北京 市 医疗设 备 厂） Ｘ － 片式 真空 泵 （ 海 市精 工 真空 设备 厂 ） ；２ Ｚ １旋 临 ；ＤＺ 一 Ｆ
２ ）吸 附 将蛋 清液 放 置冰箱 中 降温 到 ５ ℃后 ，加 入 Ｄ１ ２阳离 子交换 树脂 并搅 拌 ７ ５ ｈ后静 置 。 ３ ）洗 脱 将上层 清 液倾 出 ， 下层 树脂 用等 体积 的 去 离子水 清洗 以 除去 吸附 的蛋 白质 ，然后 过滤 并 重 复清 洗 ，再将 树脂 抽滤 除 去水 分 。把清洗 好 的树 脂倒 入 到 与树 脂 体积 相 等 的硫 酸 铵溶 液 中进行 洗 脱 ，
２ ０小型 真 空干燥 器 （ 州 长城科 工贸 有 限公 司） ５ 郑 。
１２ ． 验 方 法 ． 试
１ 蛋 清的制 备 ）
将 鸡 蛋用 ２ ℃ 的蒸 馏水 洗净 ，在 鸡蛋 两端 各 敲一个 小洞 ，使 蛋清 流 出 ，搅拌 ２ ｉ ０ ａ ｒｎ
树脂常见问题处理方法
树脂常见问题处理方法树脂常见问题处理方法1.树脂使用前的预处理在离子交换树脂的工业产品中，常含有少量有机低聚物及一引起无机杂质。
在使用初期会逐渐溶解释放，影响出水水质或产品质量。
因此，新树脂在使用前必须进行预处理，具体方法如下：1、树脂装入交换器后，用洁净水反洗树脂层，展开率为50-70%，直至出水清晰，无气味、无细碎树脂为止。
2、用约2倍树脂体积的4-5%HCl溶液，以2m/h流速通过树脂层。
全部通入后，浸泡4-8小时，排去酸液，用洁净水冲洗至出水呈中性。
冲洗流速为10-20m/h。
3、用约2倍树脂体积的2-5%NaOH溶液，按上面进HCl的方法通入和浸泡。
排去碱液，用洁净水冲洗至出水呈中性。
流速同上。
酸、碱液若能重复进行2-3次，则效果更佳。
经预处理后的树脂，在第一次投入运行时应适当增加再生剂用量，以保证树脂获得充分的再生。
2.树脂硅污染的处理方法硅化合物污染发生在强碱阴离子交换器中，尤其是在强、弱型阴树脂联合应用的设备和系统中，其结果往往导致阴交换器的除硅效率下降。
发生这种污染的原因是再生不充分，或树脂失效后没有及时再生。
处理方法，可用稀的温碱液浸泡溶解。
碱液浓度为2%，温度约40度。
污染严重时，可使用加温的4%氢氧化钠溶液循环清洗。
3.树脂有机污染的处理方法乙烯系强碱性阴树脂易受有机物污染，其征状为：（1）树脂颜色变深；（2）工作交换容量下降；（3）出水电导率增大；（4）出水pH值降低；（5）出水二氧化硅含量增大；（6）清洗水量增加。
防止有机物污染的基本措施是在预处理中将水中有机物尽量除去，并采用抗污染树脂，如大孔弱碱阴树脂，丙烯酸系阴树脂对抗有机物污染很有效。
常用复苏方法为碱性盐法。
即用10%NaCl+4-6%NaOH混合液，用量为3个床体积，以缓慢的流速通过树脂层，当第2个床体积通过入后，浸泡树脂8小时或放置过夜，再通入第3床体积混合液。
混合液需加温至40-50度。
若在混合液中加1%左右磷酸钠或硝酸钠，或结合压缩空气搅拌树脂层，则效果更佳。
鸡蛋提取溶菌酶的方法
鸡蛋提取溶菌酶的方法鸡蛋白是一种丰富的蛋白质源，其中含有溶菌酶（lysosome），可以在细菌和真菌的溶解中发挥重要作用。
溶菌酶是一种具有溶菌、抗菌活性的酶类。
鸡蛋提取溶菌酶的方法主要包括以下几个步骤：1. 鸡蛋的分离：首先将新鲜的鸡蛋进行分离，只保留蛋清（蛋白质）部分，去除蛋黄。
2. 蛋清处理：将蛋清中的蛋白质与溶菌酶分离，可以采用酸碱沉淀法。
将蛋清加入适量的酸（如醋酸）中，使酸度下降到pH 4以下，随后使用碱（如氢氧化钠）中和酸性溶液，使溶液pH回升到中性左右。
这一过程中，溶菌酶会发生沉淀现象，可以方便地分离出来。
3. 溶菌酶的除杂：蛋清中可能还存在其他酶类或蛋白质，为了获得纯净的溶菌酶，可以进行一轮或多轮的洗涤与纯化。
例如，可以使用盐析法，通过逐渐增加溶液中的盐浓度来沉淀溶菌酶，然后用溶液洗涤沉淀物，最后得到纯净的溶菌酶。
4. 溶菌酶的浓缩与干燥：将纯净的溶菌酶溶液通过浓缩技术（如超滤或冷冻干燥）使溶液浓度增大，得到较为浓缩的溶菌酶溶液。
5. 溶菌酶的活性测定：对提取得到的溶菌酶进行活性测定，可以通过测定其对特定底物的溶解能力来评估溶菌酶的活性。
常见的测量方法包括显色法和滴定法等。
鸡蛋提取溶菌酶的方法相对简单，但有一些需要注意的注意事项：1. 鸡蛋的新鲜度对溶菌酶的提取效果有一定影响，新鲜的鸡蛋中溶菌酶的含量较高。
因此，在进行实验时应选择新鲜的鸡蛋。
2. 溶菌酶的活性与条件相关，如温度、酸碱度等。
在提取过程中需要控制好这些条件，以保证溶菌酶的稳定性和活性。
3. 提取得到的溶菌酶需储存于低温（通常-20C）下，否则易失活。
4. 鸡蛋中的蛋白质含量较高，在提取过程中需要留意对蛋白质的处理，避免产生其他影响或污染。
需要特别注意的是，提取溶菌酶并非只有上述方法，还可以根据实际需要结合其他技术和方法进行提取，例如离心、层析、电泳等。
总结起来，鸡蛋提取溶菌酶的方法包括鸡蛋的分离、蛋清处理、溶菌酶的除杂、溶菌酶的浓缩与干燥以及溶菌酶的活性测定等步骤。
鸡蛋清溶菌酶的提取纯化工艺研究
点沉淀相结合的方法可除去大部分杂蛋 白，去除
蛋清的粘度 ，使溶菌酶得到初步的分离和纯化 。 鸡蛋清 溶壁小球菌 ７ ４ ２ 大孔弱酸性阳离子 ２１ ．２预处理条件的确定 ． 清 整 ： 鱼 上清液 垫变 上清 交换树脂 羧甲其纤维素Ｃ ＭＣ 标准溶菌酶 （ 酶活 原蛋 垫 旦 叠登 力＞１０ ０ ０ ０单位／ ｇ 牛肉浸膏 蛋白胨 Ｎ Ｃ（ ｍ ） ａＩ 分 析纯）琼脂 其它试剂均为分析纯 １ 主要仪 器 ． ２ 超净工作 台 隔水式电热恒温培养箱 恒温振荡器
山 东 食 晶 发 苕 莩
２１．（ ０ １４总第１３ ６ 期）
鸡蛋清溶菌酶的提取纯化工艺研究
李书丰
（ 州职业 技术 学 院粮油 食 品系 山东 德州 ２３ ３ ） 德 ５ ０４
摘
要 ：以新鲜 鸡蛋 清为原料 ， 以溶壁小球 菌的茵悬液 为底 物检 测溶茵酶 的活 力。 根据 溶茵酶具有耐热性 、 电点较 高的 等
特点， 用１ ａ Ｉ 先 ％Ｎ Ｃ进行盐溶 ， 再采 用热 变性 （５Ｃ ３ ｉ ７ 。， ｍｎ 等电点沉淀 （．） ）和 ４５ 法除去蛋 清 中大量杂蛋 白， 然后 用７ ４ ２ 弱酸阳
离子树 脂从蛋 清液中吸 附提取 溶 茵酶 ， 起始 缓冲液为１ １ ｍ ｌＬ 、 Ｈ ．４ ／ ｏ ） ｐ ６６ 的磷 酸缓冲液 。 ５（ ／ 再用１％ （ ｉ） Ｏ溶液进行 ｏ Ｎ ｌ Ｓ
２１．（ ０１４总第１３ ６期）
一
山 东 食 晶 发 酵
失活 ，选择以下参数为最佳：
表 ２预 处理最佳条件
合 并洗 脱 峰 处 的洗 脱 液 ，浓 缩 ｌ倍 后 进行 真 ０ 空 冷冻 干燥 。
３ ． ２离子交换树脂的使用
７ ４ 孔 弱 酸 性 阳离 子 交 换 树 脂 的预 处 理 、 ２大 ２１ ．－ 验步 骤 ３实 ２１ ． 鉴别 质 量 ：鸡蛋 清 的稠 度是 最重 要 的指标 ．． １ ３ 转 型
蛋白质选择吸附树脂
蛋白质选择吸附树脂是一种用于分离和纯化蛋白质的树脂，它能够选择性地吸附蛋白质，同时释放其他分子，如盐和多糖。
这种树脂由交联的聚合物组成，其中一些官能团可与蛋白质的极性基团相互作用。
这种树脂具有高选择性、高吸附容量、可逆性、再生性和易于处理等优点。
蛋白质选择吸附树脂可以用于蛋白质的分离、纯化、分级和鉴定等方面。
它能够吸附蛋白质并减少其他杂质的含量，从而提高蛋白质的纯度和活性。
这种树脂在生物技术产业、制药工业、食品和饮料行业等领域得到了广泛应用。
在使用蛋白质选择吸附树脂时，需要注意选择合适的树脂型号和浓度，以及合适的洗脱剂和洗脱方式。
此外，需要定期对树脂进行再生和清洗，以确保其性能和稳定性。
需要注意的是，不同品牌的蛋白质选择吸附树脂可能存在差异，因此在使用前需要进行充分的试验和评估。
实训 溶菌酶的提取分离
实训溶菌酶的提取分离［任务描述］溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，临床上用于五官科各种黏膜炎症、龋齿等。
自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类家禽的蛋清中，鸡蛋清约含0.3％。
鸡蛋清溶菌酶分子的化学组成，是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链，有4对二硫键，相对分子质量14388，呈一扁长椭球体,是一种碱性球蛋白。
溶菌酶是非常稳定的蛋白质。
pH在1.2～11.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变。
遇热也很稳定，pH4～7，100℃处理10min仍保持原酶活力；pH5.5，50℃加热4h，酶变得更活泼。
热变性是可逆的，变性的临界点是77℃，随溶剂的变化变性临界点也有变化，当变性剂pH在l以下时，变性临界点降到43℃。
一般说来，变性剂能促进酶的热变性，但变性剂过量时，则酶的热变性变为不可逆。
在碱性环境中，用高温处理时，酶活性降低。
低浓度（10-7mol/L）在碱性和中性环境中能使酶免受热的失活影响。
酶对变性剂相对的不敏感（高浓度酶除外）。
吡唑、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，滤纸能抑制酶的活性，氧化剂能使酶钝化。
在6mol/L盐酸胍溶液中，酶完全变性，而在10mol/L的尿素中，酶则不变性。
用乙二醇、丙烯乙二醇、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氧杂环己烷等进行有机溶剂变性实验，在50℃以下，除乙醇、二氧杂环己烷外，其他变性剂的浓度要在50％以上时才能引起溶菌酶的变化，氢氰酸能部分恢复酶活力。
药用溶菌酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。
无臭，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。
在酸性溶液中十分稳定，而水溶液遇碱易被破坏，耐热至55℃以上。
最适pH为6.6，等电点为10.5～11.0。
由于溶菌酶是碱性蛋白质，常与氯离子结合成为溶菌酶氯化物。
生化制药主要采用鸡蛋清或蛋壳为原料制备溶菌酶，因此本次实训任务根据溶菌酶的特性，通过色谱分离、膜分离和盐析等技术，从蛋清和蛋壳中制备溶菌酶。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析
实验四 纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析一、实验目的1，了解各环境因素（如：温度、pH 值等）对酶稳定性的影响。
2，了解衡量酶稳定性的指标：半衰期T 1/2。
二、实验原理酶的稳定性常用半衰期（T 1/2：：一定条件下酶活力丧失50%所需的时间）来衡量。
一般来说半衰期越长表明酶在特定条件下的稳定性越好。
溶菌酶的热失活行为可简化为不可逆的一级失活模型 令时间为t 时活性酶的浓度为[E]t , 酶活性为A t ，则有：根据式（1），以0lntA A 对处理时间t 作图其斜率即为d k 。
进而通过式（2）便可求得半衰期（T 1/2）。
三、实验材料、试剂、仪器1. 材 料：实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶。
2. 试 剂：0.5 mol/L NaOH 。
3. 仪 器；pH 计、离心管、金属浴四、实验步骤1.酸性条件下溶菌酶的稳定性稀释5倍 75℃纯化溶菌酶—————→分装离心管（0.5mL/管）———→分别处理0, 10, 20, 40, 60 min 保温 冷却至室温———————→测酶活 2. 碱性条件下溶菌酶的稳定性稀释5倍 75℃纯化溶菌酶—————→调pH 值调至8.0左右—→分装离心管（0.5mL/管）———→分别保温冷却至室温00001/2[][][][]exp()ln[]ln[]ln ln ln.................................(1)ln 2..................................(2)td tt d t d t d d tdd E k E dtE E k t E E k t A A k t A k t A T k -==-=-=-==处理0, 10, 20, 40, 60 min———————→测酶活3. 酶活的测定及计算方法方法：玻璃比色杯快速混匀底物悬浮液2.0mL—————→加入0.05mL酶液————→测A450nm值1min内的变化（15s记录一次）计算：采用自定义酶活性单位（U）：当前测定条件下，测定体系在450 nm波长下吸光度每分钟下降0.01所需的酶量为1个酶活力单位（U）。
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术2010-03-01 点击数：327华南理工大学食品学院郑建仙鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3.5％，是提取溶菌酶的方便来源。
但不同产地的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。
工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤和亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。
●直接结晶法在鸡蛋清中加入5%的NaCl，调节pH到10左右，加入溶菌酶晶种，在0℃—5℃静置结晶，分离蛋清，得到结晶物，经纯化后再进行重结晶。
●离子交换法溶菌酶是一种阳离子型蛋白质。
它由阴离子交换树脂吸附，使其从蛋清中分离出来，然后用0.3mol/L以上食盐水洗脱树脂，洗脱液经透析、超滤、冷冻干燥便得粉状产品。
●亲和色谱法利用酶与底物专一性结合形成复合物的特点，以羧甲基甲壳素（CM-CH）为底物专一性结合溶菌酶，然后用水和稀醋酸洗脱，洗脱液经透析、超滤、喷雾干燥或真空干燥便得粉状产品。
利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。
Stermberg等1974年报道了应用聚丙烯酸（PAA）形成PAA-溶菌酶聚电解质复合物。
Chern等于1996年应用pH敏感的亚微粒丙烯酸胶浆以及Eudragit L100作为溶菌酶的沉淀剂。
最近Vaigya等报道采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到90％的收率。
他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH敏感聚合物具有更多的优点，因为后者通常只有较低的得率。
●其他方法用水或稀酸将鸡蛋清稀释2.5—10倍，调整液体pH至2.5—7.0，在此弱酸性水溶液中加入少量钙并加热，使溶菌酶以外的蛋白质大部分凝固，从分离出的上清液和凝固物的洗净液中提取溶菌酶。
Owen等1997年报道，使用连续逆流、膨胀床吸附系统分离溶菌酶，该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题，诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。
Ghosh等报道，采用小型的中空纤维超率系统从蛋清干粉中分离溶菌酶。
鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化 26
五、方法改进
方法：反胶团萃取
原理：当表面活性剂溶于大量与水不相溶的有机溶剂中，达到一定浓 度时，会形成极性头在内，非极性头在外的聚集体，这种聚集体为反 胶团(当体系中含量一定量的水，则在反胶团中心有一个水池，可以 包围水溶性的蛋白质分子(这种反胶团的有机溶剂与蛋白质水溶液混 合时，一定条件下，蛋白质分子能够从水相进入到反胶团的中心水池， 经过分相后，再将有机相与另一水相接触，改变条件，即可打开胶团， 释放蛋白质分子，从而达到萃取分离的目的。
鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化
生制12 李雅 26
一、实验材料——鸡蛋清
理化性质：溶菌酶广泛存在于自然界中，其中以蛋清含量最为 丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残 基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶 构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。 可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性 菌； 鸡蛋清中溶菌酶是一种罕见的稳定蛋白质，对温度和酸不敏感， 在弱碱性条件下稳定； 鸡蛋清中溶菌酶的等电点为10.8，远大于鸡蛋清中其他蛋白质 的等电点。
操作：用粗蛋清溶液进行分离纯化,可使溶菌酶的纯度提高16～20倍, 达到0.62～0.76 mg/mg蛋白,这种亲和反胶团系统可以重复使用三次, 加入聚氧乙烯(120)去水三梨糖醇三油酸酯(Tween85)作为辅助表面 活性剂可以提高反胶团系统的容量。在pH9.16的前水相中,使用含有 Tween85(20 g/L)的反胶团可以使溶菌酶的产率超过70%。为了进一 步提高反微团萃取分离的选择性,可在反微团表面活性剂的烷基连接对 待分离蛋白质具有生物专一性的配基,实现反微团亲和萃取分离。
二、方法及原理
方法：离子交换色谱法 原理：离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合 力的差异进行物质分离的操作技术,由于具有简便、高效、成本低,通 常选择弱酸性阳离子交换树脂进行分离。