鸡蛋清中溶菌酶的提取工艺研究
蛋清溶菌酶提取技术的研究共3篇
蛋清溶菌酶提取技术的研究共3篇蛋清溶菌酶提取技术的研究1蛋清溶菌酶提取技术的研究概述在医学、食品、制药等行业中，蛋清溶菌酶（ovomucin）是一种重要的蛋白质，在不同领域中有不同的应用价值。
目前，提取蛋清溶菌酶的方法有多种，根据对目标产物的要求，选择合适的提取工艺是提高提取效率、降低成本，同时保证产品品质的关键。
传统的蛋清溶菌酶提取方法包括酸碱处理、物理打碎等方法，虽然能得到目标产物，但这种方法存在不少问题，例如操作复杂，产物纯度不高等。
近年来，一些新技术如超声波提取、微波提取等逐渐被应用到蛋清溶菌酶提取中，为蛋清溶菌酶提取研究带来了新思路和新突破。
酸碱处理法酸碱处理法是传统的蛋清溶菌酶提取方法，主要是通过对蛋清的酸碱性调节使得蛋清溶菌酶在溶液中释放。
酸碱处理法操作简单，但是由于酸碱处理对蛋清溶菌酶的结构影响较大，使其产物的纯度较低。
物理打碎法物理打碎法是另一种常用的蛋清溶菌酶提取方法，主要是通过机械力的作用使蛋清溶菌酶从细胞中释放。
其优点是成本低，但存在操作复杂、易受外界因素影响，同时产物纯度低的缺陷。
超声波提取法超声波提取法是一种新兴的蛋清溶菌酶提取技术，该方法通过超声波的力量使细胞壁破裂，从而使蛋清溶菌酶易于释放。
相比传统的提取方法，该方法具有操作简单，提取效率高，提取速度快，产物纯度优等明显优点。
微波提取法微波提取法是另一种新兴的提取技术，该方法主要是通过微波辐射使蛋清细胞壁被加热；随着温度升高，蛋清溶菌酶会逐渐释放。
该方法具有提取速度快、提取效率高等优点，但是同时由于微波剩余辐射等原因，该方法的应用还存在一些安全隐患。
总结综上所述，提取蛋清溶菌酶是目前相关行业中的重要问题之一，选择适合的提取方法具有重要的实际应用价值。
传统的方法虽然操作简单，但存在许多问题，因此越来越多的新技术被应用到该领域。
超声波提取、微波提取是比较新兴的技术，在提取效率，产物纯度等方面都具有很大的优势。
我们需要深入研究新技术在蛋清溶菌酶提取中的应用，不断探索新的提取方案，为相关行业的发展贡献力量提取蛋清溶菌酶是一个重要的问题，不仅在生命科学研究中有广泛应用，而且在食品工业、医药等领域也有着重要的应用价值。
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为⼀个⼩组，同时两个⼩组共同进⾏试验）新鲜鸡蛋打⼊烧杯然后⽤矿泉⽔瓶⼦吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得⼩于8.0），量其体积（量筒50ml），加⼊两倍蛋清体积的（可⽤双蒸⽔替代）去离⼦⽔，边加边缓慢搅拌，拌匀后⽤两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后⽤1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值⾄7.0 左右，再⽤脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离⼦交换树脂的再⽣及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加⼊32 g再⽣的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，⽤去离⼦⽔反复冲洗，以去除杂蛋⽩，滤⼲树脂，⽤等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加⼊等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第⼆天，有⽩⾊沉淀析出，离⼼（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋⽩：4℃条件下，⽤去离⼦⽔透析24 h 左右（1天）直到透析完全（⽤BaCl2与透析液发⽣反应直到没有浑浊产⽣为⽌）。
离⼼去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加⼊1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升⾄8．0～9．0，如有⽩⾊沉淀，即离⼼去除；（碱性蛋⽩在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚⼄⼆醇浓缩：盐析物⽤1 倍去离⼦⽔溶解成稀糊状，装⼊透析袋，在装有聚⼄⼆醇的试管中吸⽔浓缩，收集浓缩液；3·冷冻⼲燥：⽤3 mol ／L 盐酸调pH值⾄5．0，冷冻⼲燥，即得⽩⾊⽚状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：⽤30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏⽔、10％APS 溶液配制⽽成；②溶菌酶的处理：⽤磷酸缓冲液制成50 µg ／mL 的溶液，取10~80 µL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染⾊和脱⾊：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染⾊液中浸泡10～30 min，⽤⽔漂洗⼲净，再⽤脱⾊液脱⾊。
鸡蛋清溶菌酶提取工艺的改进
鸡蛋清溶菌酶提取工艺的改进
鸡蛋清溶菌酶(Egg White Lysozyme)是存在于鸡蛋清中的一种蛋
白质，具有抗菌作用，是一种重要的工业用产物，具有广泛的应用前景。
为了从鸡蛋清中有效提取鸡蛋清溶菌酶，近年来，许多改进鸡蛋
清溶菌酶提取工艺的研究工作得到了不断推进。
首先，有研究表明，改变提取工艺中的温度因素可以极大提高鸡
蛋清溶菌酶的提取率。
研究表明，不同的温度和抽提时间对鸡蛋清溶
菌酶的提取有着很不一样的影响，特别是当温度和抽取时间相结合时，提取效率更高。
此外，人类文化测序技术也可以改进鸡蛋清溶菌酶提取工艺。
例如，通过分析染色体和核苷酸序列，可以研究出最适合提取鸡蛋清溶
菌酶的温度和pH值，以最大程度地提高提取效率。
最近，研究人员还利用数学和计算机模拟技术，结合蛋白质化学
技术，开发了基于仿生策略的改进工艺，以达到适当温度和pH值调节
提取鸡蛋清溶菌酶的目的。
总之，为了改进鸡蛋清溶菌酶提取工艺，近年来，科学家借助数学、计算机模拟等技术，调节提取过程中的温度、时间和pH值，使抽
取的鸡蛋清溶菌酶的效果最佳化，有效提高提取效率，为鸡蛋清溶菌
酶工业化生产奠定良好的基础。
南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清中提取溶菌酶南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。
并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。
关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE研究材料与实验方法1.柱层析前的准备工作实验材料：树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。
1.1预处理724型阳离子交换树脂碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。
1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。
1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。
1.4平衡离子交换树脂0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。
2.柱层析法提取溶菌酶实验材料：起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液）再生溶液：0.5M NaOH溶液仪器：磁力搅拌器等其他材料：新鲜鸡蛋2.1样品的预处理取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定
进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。
国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目 前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发 达国家的鲜蛋加工业可以加工较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰 而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的 氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶， 或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。 缺点： 由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它 在工业上的大规模利用。
目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意 大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。 近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了 其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模 约为700吨。
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。
（2）非酶学测定法： 电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活 性及失去活性的溶菌酶总量。
免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高， 为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验 条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应 用。
盐析法
1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重 要方法之一。
价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓 度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。 盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或 1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。
从蛋清浓厚蛋白中提取溶菌酶技术的研究
ｕｔ ｆｔ ｔ ｎ ｔｍｐ ｒｔｒ ５ ｏ ， ｍａｅｉｌ ｉｕｄ ｐ ８５， ｉｉｃｉｎｐ ｅｓ ｒ ．８ ＭＰ ｎ ｅ ｈ ａ ｈ ｒｃ ｎ ｅ ｔａｉｎ Ｕｌ— ｌ ａ ｌａｉ ｒｉ ｒ ｏ ｅ ｅａｕｅ ３ Ｃ ｔｒ ｑ ｉ Ｈ ． ａｌ ｎｅｔ ｒｓｕ ｅ００ ａａ ｄ ｔ ｎｕ ｒｆ ｅ ｏ ｃ ｎｒｔ ． ｔ ｏ ｈ ｉ ｏ ｉ
ｍａｏ ｒ ｐ ．Ｔｈ ｏ ｉ ａ ｈｒｆｈｒｔｏ ｘｒ ｃｉｎ ｃ ｎ ｔｏ ｓ ｆｒ ｅ ｇ ｗｈｔ ｙｓｚ ｍｅ ａ ｅ ｏ ｔ ｉｅ ｓ ｆｌｏ ｔｇ ａ ｈｙ ｅ ｐｔ ｌｕ ａ ｍ ｉ ａｉｎ ｅ ｔａ ｔ ｏ ｄｉｉｎ ｏ ｇ ｉｅ ｌ ｏ ｙ ｒ ｂ ａｎ ｄ ａ ｌｗｓ： ｄｌ ｉｎ ｉ ｅ ， ｏ ｏ ｉ ｏ ４ ｔ ｓ ｕｔ ｍ
ｍａ ｅｙ ｌｓ ｚ ｍｅ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｔ ｉ ａｅ ｉ １ １９ ％ ， ｔｅ ｌ ｓ ｚ ｍｅ ｔ ｎ ｍｉｓ ｉ ｓ ７ ． ７ ％ ， ｔ ｅ ｌ ｓ ｚ ｍｅ ａ ｔ ｉ ｆｓ ｍｐ ｅ ｔｌ ， ｙ ｏ ｙ ｎ ｙ ｃｉ ｔ ｒ ｔ ｓ ３ ． ３ ｖｙ ｈ ｙ ｏ ｙ ｒ ｓ ｓ ｉ ｔ ｉ ３５ ａ ｖｙ ｈ ｙ ｏ ｙ ｃ ｉ ｔ ｏ ａ ｌ ｖｙ
Ｋｅ ｒ ｓ ｅ ｇ ｗｈｔ ；ｌ ｓ ｚ ｍｅ；ｕ ｔ ｆ ｔ ｔ ｎ ａ ｉ ｉ ｙｗｏ ｄ ： ｇ ｉ ｅ ｙｏｙ ｌ ａｉ ｒ ｉ ； ｆ ｎｔ ｒ ｌａ ｏ ｙ
溶 菌 酶 在 酶 学 研 究 中是 一 种 有 重 要 意 义 的酶 ，
但我 国 目 前缺乏适合工业化生产高质量溶菌酶 的可 行 性 工 艺 。 目前 ，直 接结 晶法 、超滤 法 、离 子 交 换 树脂吸附法 、亲和层析等常被用来提取溶菌酶 。超 滤 法 是 利 用控 制 超 滤 膜孔 径 大小 来 滤 过 杂质 ，水 及 小 分 子 物 质 可 以通 过 ，从 而获 取 产 物 。 亲 和层 析 法 是 根 据 作 用 酶 与底 物 有 特 异 亲 和力 的特 性 ，利 用 酶 分 子独 有 的专 一性 结合 位 点或 结 高 活 性 、高纯 度 溶 菌酶 的分 离 纯 化方 法 的主 要研 究 方 向 ，这 也 是本 研 究 的主要 研究 方法 之一 。 利 用 超 滤 法 与 亲 和层 析法 相 结 合 方 法 对鸡 蛋 清 溶 菌酶 进 行 适 合 工业 化 生 产 的 提取 精 制 研 究 。期 望 研 究 成 果 可 应 用 于 大规 模 的 工业 生 产 ，提 高 生 产效 益 ，从而促进我 国溶菌酶产业的快速发展。
鸡蛋中溶菌酶的提取
鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings Li Huay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术2010-03-01 点击数：327华南理工大学食品学院郑建仙鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3.5％，是提取溶菌酶的方便来源。
但不同产地的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。
工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤和亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。
●直接结晶法在鸡蛋清中加入5%的NaCl，调节pH到10左右，加入溶菌酶晶种，在0℃—5℃静置结晶，分离蛋清，得到结晶物，经纯化后再进行重结晶。
●离子交换法溶菌酶是一种阳离子型蛋白质。
它由阴离子交换树脂吸附，使其从蛋清中分离出来，然后用0.3mol/L以上食盐水洗脱树脂，洗脱液经透析、超滤、冷冻干燥便得粉状产品。
●亲和色谱法利用酶与底物专一性结合形成复合物的特点，以羧甲基甲壳素（CM-CH）为底物专一性结合溶菌酶，然后用水和稀醋酸洗脱，洗脱液经透析、超滤、喷雾干燥或真空干燥便得粉状产品。
利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。
Stermberg等1974年报道了应用聚丙烯酸（PAA）形成PAA-溶菌酶聚电解质复合物。
Chern等于1996年应用pH敏感的亚微粒丙烯酸胶浆以及Eudragit L100作为溶菌酶的沉淀剂。
最近Vaigya等报道采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到90％的收率。
他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH敏感聚合物具有更多的优点，因为后者通常只有较低的得率。
●其他方法用水或稀酸将鸡蛋清稀释2.5—10倍，调整液体pH至2.5—7.0，在此弱酸性水溶液中加入少量钙并加热，使溶菌酶以外的蛋白质大部分凝固，从分离出的上清液和凝固物的洗净液中提取溶菌酶。
Owen等1997年报道，使用连续逆流、膨胀床吸附系统分离溶菌酶，该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题，诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。
Ghosh等报道，采用小型的中空纤维超率系统从蛋清干粉中分离溶菌酶。
实验3 溶菌酶分离提纯
（一）分离提纯
【目的和要求】 目的和要求】
1.了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法 2.了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般 了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般 原理和操作方法。 原理和操作方法。
【实验方法】 实验方法】
1．取20ml ddH2O，用醋酸调pH值为 ，水浴加热 ℃。 ． 值为3.5，水浴加热85℃ ，用醋酸调 值为 加入10ml新鲜蛋清，在搅拌条件下加热 分钟。 新鲜蛋清， 分钟。 加入 新鲜蛋清 在搅拌条件下加热5分钟 2．将所得液体10000g 离心 ．将所得液体 离心10min，收集上清液，由此得到 ，收集上清液， 溶菌酶粗提液。 溶菌酶粗提液。 3．装柱：取聚丙烯层析柱（1ml），关闭层析柱出口。自 ．装柱：取聚丙烯层析柱（ ），关闭层析柱出口 ），关闭层析柱出口。 顶部徐徐加入2ml CM Sepharose FF悬浮液，待凝胶颗粒沉降 悬浮液， 顶部徐徐加入 悬浮液 放出过量的溶液。 倍柱床体积） 柱床， 后，放出过量的溶液。用ddH2O（5-8倍柱床体积）冲洗柱床， （ 倍柱床体积 冲洗柱床 去除乙醇。冲洗完毕，关闭柱子出口， 去除乙醇。冲洗完毕，关闭柱子出口，保持液面高出凝胶表面 1cm。 。
【实验原理】 实验原理】
【实验原理】 实验原理】
1. 溶菌酶的粗提 鸡蛋清液
酸性条件， 酸性条件，85℃
溶菌酶带正电荷，与酸根负离子生成可溶性盐 溶菌酶带正电荷，与酸根负离子生成可溶性盐 溶菌酶耐热性较高 溶菌酶耐热性较高，而其它杂蛋白在高温下变性沉淀 耐热性较高，
离心
使溶菌酶与其他蛋白质分开， 使溶菌酶与其他蛋白质分开，得到溶菌酶的粗提液
鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化
四、实验材料和方法
四、实验材料和方法
1、实验材料：新鲜鸡蛋、磷酸缓冲液（PBS）、乙酸乙酯、正丁醇、蛋白酶 抑制剂、透析袋。
四、实验材料和方法
2、实验设备：高速离心机、真空泵、氮气仪、色谱柱。 3、实验方法： （1）鸡蛋卵清的收集：将新鲜鸡蛋打破，分离出卵黄和卵清， 收集卵清备用。 （2）粗提：将收集的卵清加入磷酸缓冲液（PBS），搅拌均匀 后进行高速离心，取上清液即为粗提液。 （3）沉淀：向粗提液中加入等体积的 乙酸乙酯，充分混合后静置分层，取下层沉淀。 （4）
鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与 纯化
目录
01 一、背景介绍
03 三、实验原理
02 二、研究目的 04 四、实验分析
07 参考内容
06 六、结论与展望
一、背景介绍
一、背景介绍
溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的天然抗菌酶，具有抗菌、抗炎、抗病毒 等多种生物活性。近年来，随着人们对食品安全和药物研发的度不断提高，从天 然生物资源中提取和纯化溶菌酶成为了一个热门领域。鸡蛋卵清作为一种丰富的 天然资源，具有较高的溶菌酶含量，因此成为了提取和纯化溶菌酶的重要来源。 本次演示旨在探讨鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化方法，以期为相关领域的研究 提供参考。
四、实验材料和方法
复溶：将沉淀物真空干燥后，加入适量正丁醇溶解，再加入透析袋中透析去 除小分子杂质。 （5）色谱分离：将透析后的溶液通过色谱柱进行分离，收集流 出液，检测其中溶菌酶的纯度和含量。 （6）鉴定：采用光谱分析、分子量测定 等方法对纯化的溶菌酶进行鉴定。
五、实验结果及分析
五、实验结果及分析
二、研究方法与技术
1、材料与设备
1、材料与设备
本研究采用新鲜鸡蛋作为原料，使用离心机、分光光度计、电泳仪等设备进 行实验。
鸡蛋清溶菌酶的提取纯化工艺研究
点沉淀相结合的方法可除去大部分杂蛋 白，去除
蛋清的粘度 ，使溶菌酶得到初步的分离和纯化 。 鸡蛋清 溶壁小球菌 ７ ４ ２ 大孔弱酸性阳离子 ２１ ．２预处理条件的确定 ． 清 整 ： 鱼 上清液 垫变 上清 交换树脂 羧甲其纤维素Ｃ ＭＣ 标准溶菌酶 （ 酶活 原蛋 垫 旦 叠登 力＞１０ ０ ０ ０单位／ ｇ 牛肉浸膏 蛋白胨 Ｎ Ｃ（ ｍ ） ａＩ 分 析纯）琼脂 其它试剂均为分析纯 １ 主要仪 器 ． ２ 超净工作 台 隔水式电热恒温培养箱 恒温振荡器
山 东 食 晶 发 苕 莩
２１．（ ０ １４总第１３ ６ 期）
鸡蛋清溶菌酶的提取纯化工艺研究
李书丰
（ 州职业 技术 学 院粮油 食 品系 山东 德州 ２３ ３ ） 德 ５ ０４
摘
要 ：以新鲜 鸡蛋 清为原料 ， 以溶壁小球 菌的茵悬液 为底 物检 测溶茵酶 的活 力。 根据 溶茵酶具有耐热性 、 电点较 高的 等
特点， 用１ ａ Ｉ 先 ％Ｎ Ｃ进行盐溶 ， 再采 用热 变性 （５Ｃ ３ ｉ ７ 。， ｍｎ 等电点沉淀 （．） ）和 ４５ 法除去蛋 清 中大量杂蛋 白， 然后 用７ ４ ２ 弱酸阳
离子树 脂从蛋 清液中吸 附提取 溶 茵酶 ， 起始 缓冲液为１ １ ｍ ｌＬ 、 Ｈ ．４ ／ ｏ ） ｐ ６６ 的磷 酸缓冲液 。 ５（ ／ 再用１％ （ ｉ） Ｏ溶液进行 ｏ Ｎ ｌ Ｓ
２１．（ ０１４总第１３ ６期）
一
山 东 食 晶 发 酵
失活 ，选择以下参数为最佳：
表 ２预 处理最佳条件
合 并洗 脱 峰 处 的洗 脱 液 ，浓 缩 ｌ倍 后 进行 真 ０ 空 冷冻 干燥 。
３ ． ２离子交换树脂的使用
７ ４ 孔 弱 酸 性 阳离 子 交 换 树 脂 的预 处 理 、 ２大 ２１ ．－ 验步 骤 ３实 ２１ ． 鉴别 质 量 ：鸡蛋 清 的稠 度是 最重 要 的指标 ．． １ ３ 转 型
蛋清溶菌酶的提取分离与活性研究
据文献报导，蛋清溶菌酶在较宽的温度范围 内都可以保持活性，鸡蛋白溶菌酶的最适ｐＨ值 比其它植物溶菌酶都略高在ｐＨ６左右。本实验 所得的最适ｐＨ值基本接近。（见图５） ２．６温度对酶比活性的影响
在２０～９０℃的温度范围内，溶菌酶均有一 定的活性。以６０℃时活性最高，约为２０ｃｃ时的
由图２及图３分析可得，在盐浓度为４％，
１２
中国食品学报
ｐＨ值为１０．５时酶的提取率可以达到最高。 据文献参考，蛋清提取率约为４．６３％０， 本
实验的酶提取率有一些偏低。
３．６倍；在３５—８５。Ｃ的范围内，活性为６０℃时的 ５０％以上，可见蛋清溶菌酶在很宽的温度范围内 均能起作用（见图６）。
３·５５
一！竺里生堕鱼堕里旦望堕！生坐堡堕！旦鲤墅！塑旦塑堕墅！地塑竺墅
！１
１０ｍＬ加入ＮａＣｌ ０．５９，滴加１Ｍ ＮａＯＨ溶液调ｐＨ 值至９．５—１０．０，置４０Ｃ冰箱中，结晶析出即 成）。在４℃下静置，溶菌酶结晶将慢慢析出， 不加晶种两周左右结晶率最高，反之７２—９６ｈ最 高。数天后，结晶完全时倾去上清液并离心即可 得到粗酶液，干燥后即得溶菌酶酶粉。 １．２．３溶菌酶的活力测定 将溶壁微球菌菌体 置入无菌水中，轻轻振荡使其溶解呈悬浮状。菌 体悬浮液移植于适宜的琼脂斜面，备用［６Ｊ６。将溶 壁微球菌接种到液体培养基上（牛肉膏Ｏ．５％、 蛋白胨１．０％、ＮａＣｌ ０．５％，调ｐＨ值至７．５）。摇 床温度３７。Ｃ，摇床转速２００ｒｐｍ，培养时间２０～ ４０ｈ。将培养的溶壁微球菌接种至固体培养基上 （液体培养基中加琼脂２．Ｏ％，调ｐＨ值至７．５）， 在２８℃下培养４８ｈ后用去离子水将菌体洗下，离 心（４ ０００ ｒｐｍ，２０ ｍｉｎ）收集菌体，反复洗涤， 离心数次，将菌体干燥后至低温下保存待用［７｜。
离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶
!"#"#
渗析目的液可采用回流循环式， ’() 液 则 不
食 品 添 加 剂
断补充输送新液或经处理的回流液，并注意盐析废 液回收利用装置应与超滤废液隔开不串通。
#%! #%#
本试验充分考虑废液综合利用I超滤废液!渗析， 本试验提取效率尚 不 足 >85 ， 工艺条件与设备
可大大减少生产过程中生物污染源。 渗析废液!盐析， 有待进一步研究完善。
!"#$%&’$ !" #$%& ’()*’#+ ,-&*.-/( 01& (2#’13#(4 5’*/ (66 0$%#( 7- 8&%"6 0(19,- 13%4%3 31#%*" (23$1"6( ’(&%": ;$( ’(&%" *5 <1 = 1"4 > = 0(’( /%2(4 #* 14&*’7 ,-&*.-/( 1"4 (,8#(4 0%#$ 1//*"%8/ &8,51#( &*,8#%*":;$( (,8#( 01& &1,#(4 *8# #* *7#1%" ,-&*.-/(&:?@@ /A (66 0$%#( 3*8,4 )’*483( @:B 6 ,-&*.-/(& 0%#$ 13#%C%#- *5 17*8# ?@@@@D E /6: ;$%& /(#$*4 ’(483(& 4("1#8’(4 1,78/%" 1"4 4(3’(1&(& %/)8’%#- *5 ’(&%48( (66 0$%#( #$1# 31" 7( ’(8&(4 %" %"48&#’-+ &* )’*483#%*" 3*&# %& ,*0(’(4: ()* +,%-# ,-&*.-/(F (66 0$%#(F 31#%*" (23$1"6( ’(&%"
鸡蛋清溶菌酶的提取纯化工艺研究_李书丰
冷冻后的酶制品必须迅速进行真空升华干 燥，在升华过程中，由于酶制品中的溶剂不断升 华将热带走，因此，在整个升华过程中需要给升 华供热，来维持升华温度不变。
泵速
10×10（约 2.5mL/min）
8×10
吸附时间 （min）
77
95
最大吸附量 （mL）
76
90
221
6×10
142
97
由上表可知，流速越慢，吸附效果越好，可
是耗时越长，所以在实验中确定吸附时泵速为
8×10mL/min。
3.4 洗脱
洗脱步骤：洗脱前应先用足够量的起始缓冲
液洗去未吸附的组分，然后才用10%(NH4)2SO4 开始正式洗脱，用部分收集器收集洗脱液，每管
参考树脂的类型与性能表，确定选择724弱 酸性大孔阳离子交换树脂作为本次实验的交换 剂，其官能团为－COOH，形状为球状，粒度为 16~50目，含水量≥60%，全交换量≥9mmol/g，最 高操作温度（Na＋与H+）150~190℃，允许pH范 围5~14，树脂母体或原料为聚丙烯酸；缓冲液选 择1\15(mol/l)，pH为6.64的磷酸缓冲液。
5 实验结果及讨论
表格3 溶菌酶的提取分离结果
测定项目
纯 化 步 骤
总 体 积
mL
酶浓 度 mg/
mL
蛋白 质浓 度
mg/
mL
酶活 力 U/
mg
总酶 活力
U
总蛋 白量
mg
比活 力
回收 率
%
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术2010-03-01 点击数：327华南理工大学食品学院郑建仙鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3.5％，是提取溶菌酶的方便来源。
但不同产地的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。
工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤和亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。
●直接结晶法在鸡蛋清中加入5%的NaCl，调节pH到10左右，加入溶菌酶晶种，在0℃—5℃静置结晶，分离蛋清，得到结晶物，经纯化后再进行重结晶。
●离子交换法溶菌酶是一种阳离子型蛋白质。
它由阴离子交换树脂吸附，使其从蛋清中分离出来，然后用0.3mol/L以上食盐水洗脱树脂，洗脱液经透析、超滤、冷冻干燥便得粉状产品。
●亲和色谱法利用酶与底物专一性结合形成复合物的特点，以羧甲基甲壳素（CM-CH）为底物专一性结合溶菌酶，然后用水和稀醋酸洗脱，洗脱液经透析、超滤、喷雾干燥或真空干燥便得粉状产品。
利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。
Stermberg等1974年报道了应用聚丙烯酸（PAA）形成PAA-溶菌酶聚电解质复合物。
Chern等于1996年应用pH敏感的亚微粒丙烯酸胶浆以及Eudragit L100作为溶菌酶的沉淀剂。
最近Vaigya等报道采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到90％的收率。
他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH敏感聚合物具有更多的优点，因为后者通常只有较低的得率。
●其他方法用水或稀酸将鸡蛋清稀释2.5—10倍，调整液体pH至2.5—7.0，在此弱酸性水溶液中加入少量钙并加热，使溶菌酶以外的蛋白质大部分凝固，从分离出的上清液和凝固物的洗净液中提取溶菌酶。
Owen等1997年报道，使用连续逆流、膨胀床吸附系统分离溶菌酶，该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题，诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。
Ghosh等报道，采用小型的中空纤维超率系统从蛋清干粉中分离溶菌酶。
南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清中提取溶菌酶南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。
并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。
关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE研究材料与实验方法1.柱层析前的准备工作实验材料：树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。
1.1预处理724型阳离子交换树脂碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。
1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。
1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。
1.4平衡离子交换树脂0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。
2.柱层析法提取溶菌酶实验材料：起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液）再生溶液：0.5M NaOH溶液仪器：磁力搅拌器等其他材料：新鲜鸡蛋2.1样品的预处理取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。