miR27a、miR146a在骨性关节炎患者滑膜组织中的表达及临床意义

ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ
ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ
ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ
Ｑ－ＲＴ—ＰＣＲ，ｔｈｅ
ｏｆ ｍｉＲ一２７ａ
ｈｉｇｈｅｒ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＡＣｔ ｗａｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｄ ｍｉＲ一１４６ａ ｉｎ ｓｙｎｏｖｉｕｍ ｏｆ ｋｎｅｅ
ｌｏｗｅｒ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｍｉＲＮＡ一２７ａ； ｍｉＲＮＡ．１４６ａ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｉＲ－２７ａ ａｎｄ ＨＥ Ｒｅｎ—ｈａｏ，ＷＡ ＮＧ
ｍｉＲ－１４６ａ ｉｎ
ｔｈｅ
ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ
ｏｆ ｋｎｅｅ
ｊｏｉｎｔ
ｗｉｔｈ
Ｗｅｉ—ｓｈａｎ，ＤＯＮＧ肋一ｂｏ，ＺＨＡ ＮＧ屈，ＳＨＩ
例，女１０例，年龄１６～５１岁，平均３６．６岁wenku.baidu.com非ＯＡ
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—５７２５．２０１３．０９．０１４
患者滑膜均来自于因外伤行截肢的膝关节和单纯 膝关节半月板损伤、前后交叉韧带损伤、游离体、 滑膜皱襞综合症行关节镜治疗的患者。本实验得 到患者本人同意和当地伦理委员会的支持。
ｃｈａｉｎ
ｉｎ ＯＡ ｇｒｏｕｐ，２３ ｉｎ
ｇｒｏｕｐ）ｗａｓ
ＭｉＲ－２７ａ
ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ— ａｌｌ ｔｈｅ ｋｎｅｅ ｔｈｅ ｉｎ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）．
ｔｏ
Ｒｅｓｕｌｔｓ
ａｎｄ ｍｉＲ－１４６ａ ｃｏｕｌｄ
０．０５）（表２、图２）。将目的基因的ＡＣｔ值经２拙转换
后即得到其表达差异的倍数改变值，即ＯＡ组中ｍｉＲ一 ２７ａ的表达是非ＯＡ组的ｏ．４８倍，ｍｉＲ一１４６ａ是０．５
１．３３此；Ｃｕｓｔｏｍ
ＴａｑＭａｎ＠
Ａｓｓａｙ（２０ｘ）１斗Ｌ；Ｔｏｔａｌ
Ｖｏｌｕｍｅ ２０ ＩｘＬ， １０ ｍｉｎ
每个样本均为３个复孑Ｌ。反应条件为：９５。Ｃ
２结果
３讨论
ｍｉＲ一２７ａ、ｍｉＲ一１４６ａ在滑膜组织中的相对表达 本实验通过实时荧光定量ＰＣＲ检测４６例 ＯＡ患者和非ＯＡ患者的滑膜组织中ｍｉＲ．２７ａ、 ｍｉＲ一１４６ａ的表达情况，其结果所有滑膜组织中目
２．１
ｍｉｃｒｏＲＮＡ是近年来发现的一种内源性非编码 单链小分子ＲＮＡ．长度２０～２２ ｎｔ．其通过介导特 异性基因沉默或激活特定靶基因以调控转录后的 基因表达来影响蛋白质的合成［６］。在ＯＡ疾病的相 关研究中学者们发现ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ在疾病发展过程
织１００ ｍｇ放于研钵中倒人液氮后迅速研碎．按照
Ｋｉｔ中的提取步奏提取 总ＲＮＡ，使用超微量紫外分光光度计测定ＲＮＡ浓 度和纯度。选取Ａ２６０／，４２８０比值在１．８～２．１之间
ｍｉｒＶａｎａＴＭ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
图１
ｍｉＲ．２７ａ、ｍｉＲ．１４６ａ的扩增曲线
的ＲＮＡ溶液作为后续试验样本。 １．３．２ 逆转录合成ｃＤＮＡ 按照ＴａｑＭａｎ＠ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ中操作要求配
置１５此反应体系，将稀释后的５汕ＲＮＡ样本和 ３此的目的基因引物及内参ｕ６加入预先按照说 明书中提供的试剂配成每份７此的混合液中，简
单离心后放进ＰＣＲ仪反应，反应条件为：１６℃３０
ｍｉｎ，４２ ｏＣ ３０ ｍｉｎ，８５℃５ ｍｉｎ。 １．３．３
ｍｉＲ一２７ａ、ｍｉＲ．１４６ａ的表达与ＯＡ疾病的关系 本实验荧光定量ＰＣＲ结果显示：２３例ＯＡ组中 ｍｉＲ一１４６ａ、ｍｉＲ一２７ａ的ＡＣｔ值分别为１．９１±１．７４、 １．１６±１．９３。２３例非ＯＡ组中的ＡＣｔ值为０．９１± １．１９、０．１３±１．３５，显示其相对表达量ＯＡ组高于非
倍，当２拙＜１时表示ＯＡ组滑膜组织中ｍｉＲ一２７ａ、
ｍｉＲ．１４６ａ的表达水平低于非ＯＡ组。
表２ ＯＡ组与非ＯＡ组滑膜组织中ｍｉＲ．１４６ａ、 ｍｉＲ．２７ａ的相对表达量
面±ｓ
叶（９５℃１５ Ｓ一６０℃１ ｍｉｎ）×４０个循环，荧光定 量ＰＣＲ的结果以每个反应管内的荧光信号到达设 定的阈值时所经历的循环数Ｃｔ表示．ｍｉＲＮＡｓ与 ｕ６相对表达量用Ｄｅｌｔａ Ｃｔ（ＡＣｔ）表示，其表达倍数 值的计算方法为２－ａａｃｒ值表示［５］。 １．３．４统计学处理实验所得数据采用ＳＰＳＳ １７．０ 统计软件进行统计分析，ｍｉＲ一２７ａ、ｍｉＲ一１４６ａ相对 表达量以面±ｓ表示，组间比较采用独立样本ｔ检 验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ
ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＯＡ，ａｎｄ ｍａｙ ｍｏｄｕａｈｅ ｕＰＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；
Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ；
图３
｛Ｎ－ⅡＩⅧＰｕ：导●ＨＩ目ｕｏ
６ｑＪ０
１ ５ ｌ Ｏ ０ ５ ０
注：与非ＯＡ组比较．｝Ｐ＜Ｏ．０５
ｍｉ．１４６ａ和ｍｉＲ．２７ａ的相对表达量
是由ＩＬ．１Ｂ引起；（２）影响ｄｉｃｅｒ酶的因素造成其合 成的减少；（３）滑膜细胞凋亡可直接或间接造成其 降解的增加。尽管分析其表达水平减少的原因很 多，但具体机制仍需进一步研究。 本实验证实了我们前期的猜想：ｍｉＲ．２７ａ和 ｍｉＲ一１４６ａ在ＯＡ患者滑膜组织中的表达较非ＯＡ 患者相比存在差异性表达，结合前期研究这两种 基因对ＯＡ软骨、滑膜中的ｕＰＡ可能存在某些特 定的调控作用．但其如何进行调控、以何种方式调 控，将是我们后续研究的重点。总之本实验首次证 实ｍｉＲ．２７ａ、ｍｉＲ．１４６ａ在ＯＡ患者滑膜组织中表达 水平较非ＯＡ患者减低。为我们后期实验奠定了实 验基础，也为研究ＯＡ滑膜组织病变发生发展机制 提供新的思路。
１４１６
塞旦医堂苤查！Ｑ！！生箜！竺鲞箜！塑
・临床研究・
ｍｉＲ．２７ａ、ｍｉＲ一１４６ａ在骨性关节炎患者滑膜组织中的 表达及临床意义
何仁豪王维山
摘要
董金波张杰
史晨辉
目的：检测骨性关节炎（ＯＡ）患者与非ＯＡ患者滑膜中ｍｉＲ一１４６ａ和ｍｉＲ．２７ａ的表达情况．并探讨
其与该疾病的相关性。方法：应用实时荧光定量聚合酶链反应检测４６例滑膜组织（ＯＡ患者２３例．非０Ａ患 者２３例）中ｍｉＲ．２７ａ和ｍｉＲ．１４６ａ的相对表达量。结果：ｍｉＲ一２７ａ和ｍｉＲ一１４６ａ在所有的滑膜组织中均能检测 到，根据ｑＲＴ．ＰＣ原理，ＡＣｔ值越高其目的基因在相应组织中的表达水平越低。即ＯＡ患者滑膜组织的ｍｉＲ． ２７ａ和ｍｉＲ．１４６ａ的表达水平较对照组呈低表达趋势（Ｐ＜０．０５）。结论：ｍｉＲ．２７ａ和ｍｉＲ．１４６ａ的差异性表达 与ＯＡ滑膜病理变化有关，可能调控ｕＰＡ的表达促进ＯＡ的发展。 关键词 骨性关节炎； 滑膜；
２．２
ＯＡ组，根据ｑＲＴ—ＰＣ原理，ＡＣｔ值（目的基因的相对 表达量）越高其目的基因在相应组织中的表达水平 越低，即ｍｉＲ。２７ａ、ｍｉＲ．１４６ａ在ＯＡ滑膜组织中的表 达水平低于非ＯＡ组。两组间采用独立样本ｔ检验 分析显示ｍｉＲ．２７ａ、ｍｉＲ．１４６ａ在ＯＡ患者和非ＯＡ 患者滑膜组织中的表达差异具有统计学意义（Ｐ＜
实时荧光定量ＰＣＲ检测ｍｉＲ一１４６ａ、ｍｉＲ．
ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｎｏ
２７ａ及Ｕ６严格按照反应体系配置说明配置反应
液，ＴａｑＭａｎ＠２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
Ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ＲＴ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ＠１ ０ ｐＬＬ；Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ７．７６斗Ｌ；
ｏｆ
Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２０００，Ｃｈｉｎａ Ｅ—ｍａｉＺ：ｓｃｈ７８９０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
Ｃｈｅｎ．Ｈｕｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ
Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ
Ａｆｆｉｌ础ｅｄ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＳＨＩ Ｃｈｅｎ－Ｈｕｉ
ｍｉＲ一２７ａ；
ｍｉＲ－１４６ａ
骨性关节炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＯＡ）是一种发病率 很高的以软骨退行性变和继发骨质增生为主的慢 性退行性骨关节疾病，多见于中老年人，目前研究 其发病机制的文献较多，但其确切发生机制仍未完 全阐明，而随着近年来对ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ研究的兴起， 越来越多的资料显示ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ在ＯＡ发病机制中 具有关键性调控的作用．有学者研究显示Ｅｌｌ在ＯＡ 患者的软骨中ｍｉＲ一１４０的表达随疾病的发展显现减 少趋势，并证明了当ｍｉＲ．１４０高表达时可防止软骨 的进一步退变。另外ｍｉＲ．１４６ａ和ｍｉＲ．２７ａ在ＯＡ中
ｊｏｉｎｔ
ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｅｏｐｌｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
ａ
ｏｆ ｍｉＲ－－２７ａ ａｎｄ ｍｉＲ－－１４６ａ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｍａｙ ｐｌａｙ
基金项目：国家自然科学基金项目（编号：８１１６０２２５） 作者单位：８３２０００新疆石河子大学医学院第一附属医院骨 一科 通信作者：史晨辉Ｅ－ｍａｒｌ：ｓｃｈ７８９０＠ｙａｈｏｏ．ＣＯＩｎ．ａｎ
万方数据
塞旦医堂苤查垫！！生筮至２鲞箜！塑
１．２主要仪器和试剂 主要仪器ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ超微量紫外分光 光度计（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ），ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７３００ 荧光定量ＰＣＲ仪（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ） １．２．２ 主要试剂 ｍｉＲＮＡ提取试剂盒ｍｉｒＶａｎａＴＭ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ公司，ＵＳＡ），反转录试剂
万方数据
Ｍ
８
塞旦医堂盘查！Ｑ！！生筮！呈鲞堡！塑
４ ０ ３ ５ ３ ０ ２ ５ ２ Ｏ
虑ＯＡ疾病过程中ｕＰＡ的表达可能受某些特定 ｍｉｃｒｏＲＮＡ的调控，我们经过生物信息学分析，发现 ｍｉＲ．２７ａ和ｍｉＲ一１４６ａ调控ｕＰＡ的可能性最大。本 研究通过实时定量ＰＣＲ检测ｍｉＲ．２７ａ和ｍｉＲ．１４６ａ 在ＯＡ患者和非ＯＡ患者滑膜组织的表达，发现其 在ＯＡ患者滑膜组织中的表达水平较非ＯＡ患者 相比减低，分析其原因我们考虑有以下几点： （１）其中最重要原因之一是滑膜病变后炎性因子 生成增加，间接或直接的导致其合成减少，如同 Ｙａｍａｓａｋｉ等［ｚ］研究证实的那样ｍｉＲ一１４６ａ表达减少
的表达也显现为减少趋势［２－３］，而滑膜组织中是否也 存在这样的趋势尚未见报道．本实验通过检测ＯＡ 患者和非ＯＡ患者滑膜组织中ｍｉＲ一１４６ａ和ｍｉＲ一２７ａ 的表达情况，探讨其与ＯＡ的作用及相关性。 １资料与方法 １．１ 一般资料实验中滑膜组织共４６例均来自 于２０１１年１１月至２０１２年４月石河子大学第一附 属医院骨一科住院患者，其中ＯＡ组２３例，男６ 例、女１７例，年龄４９～７８岁，平均６２．３岁，所有 ＯＡ患者均根据美国风湿病学会１９９５年确定的 ＯＡ诊断标准［４］进行纳入。非ＯＡ组２３例，男１３
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ａｎｄ
Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｏｆ ｍｉＲ一１４６ａ ａｎｄ ｍｉＲ一２７ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｋｎｅｅ
ｔｏ
ｊｏｉｎｔ ｏｆ ｐｅｏｐｌｅ ｗｉｔｈ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＯＡ）ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｏｐｌｅ，ａｎｄ
１．２．１
的基因及内参均能检澳０到，且扩增曲线良好，扩增 效率高。如图１。
盒ＴａｑＭａｎ＠ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＡＢＩ公司，ＵＳＡ），ＴａｑＭａｎ＠ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（ＡＢＩ 公司．ＵＳＡ）ＴａｑＭａｎ ２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ （１＂１０ ＵＮＧ）（ＡＢＩ公司，ＵＳＡ）。引物ｍｉＲＮＡ．１４６ａ和 ｍｉＲＮＡ一２７ａ及内参Ｕ６由美国ＡＢＩ公司合成。 １．３方法 １．３．１ 滑膜组织中总ＲＮＡ的提取取出滑膜组
ｍｉＲ－１４６ａ ａｎｄ ｍｉＲ－２７ａ ｆｒｏｍ ４６
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｉＲ・１４６ａ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ
ＯＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｎｏ
ｎｅ
ＯＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一２７ａ ａｎｄ
ｐｅｒｓｏｎｓ（２３