Western Blot实验指导教程
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
Western Blot实验详细步骤
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
western blot实验步骤
一、提取组织蛋白新鲜肺组织取20-30mg，减去气管，组织匀浆机研磨，100W超声3S，12000r/min离心37℃孵育30min，测OD562。
按所得结果定量到50微升计算上样量，将20微升上清分装到一个1.5ml的EP管，加5微升上样缓冲液，-20℃冻存。
二、煮样95℃，煮10min,待温度降到室温关闭机器，煮后的组织离心7500r/min，1min备用三、安装玻璃板，倒入电泳缓冲液，拔梳子，用进样针吸取计算的上样量上样，装好正负极，倒满电泳液，设置80V，30min跑条带，结束后100V，60min，没跑到底酌情延长时间(30min)，准备转膜所需工具：1.剪好6片滤纸，转膜液湿润海绵及滤纸，赶气泡。
2.PVDF膜，准备甲醇激活膜2min，蒸馏水5min电泳时间到关闭电源，取出玻璃板，准备切胶，切好后，按形状切稍大一圈的PVDF膜，覆盖到切好的胶上，标记好上下。
安好夹子，放入电泳槽准备转膜，转膜需冰浴。
四、转膜结束后，将膜取下，TBST清洗3遍，每遍5min。
五、7%牛奶（1.75g，加TBST 25毫升）,封闭2小时，慢摇。
六、封一抗内参：β-actinα-SMA:1：10000配制波形蛋白：1：5000制备杂交袋，放入膜，滴入抗体，封口，4℃过夜七、将过夜的膜放入37℃恒温箱中孵育30min，结束后回收一抗，标记好第几次用，TBST清洗膜3遍，每遍10min。
八、封二抗：羊抗兔HRP(1：5000)稀释，配制10ml，慢摇1小时后回收二抗，标记好第几次。
TBST清洗膜3遍，每遍15min。
九、1：1配制发光液（避光保存），准备眼科镊、滤纸、托盘、曝光，先曝背景再报条带，先自动后手动。
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
Westernblot实验技术
Western blot试剂配制1. 30%丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺用温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水（超纯水）溶后定容到100ml，过滤后于棕色瓶中储存0.8gN, N’-亚甲双丙烯酰胺注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反映是光催化或碱催化的，故应核算溶液的pH值不超过7.0。
这一溶液置棕色瓶中贮存于4℃，每隔几个月须重新配制。
小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
2. 10%SDS：称5gSDS，超纯水溶解后，定容到50ml。
贮存液保存于室温。
3. 10%AP（过硫酸铵）：称1gAP，溶于8ml超纯水中，定容到10ml，小量分装（250ul/管）保存于-20℃，过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，每次使用均要用新鲜的。
4. 1.5MTris-HCl：称18.2gTris（Mr=121.14）加50ml超纯水溶解后，用浓HCl调pH值8.8，定容到100ml。
5. 0.5MTris-HCl：称3gTris（Mr=121.14）加25ml超纯水溶解后，调pH值6.8，定容到50ml。
6. TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
一旦加入TEMED，立即开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
7. 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液【10×（25mMTris+0.25M+0.1%SDS）】pH8.330.3g Tris 15.15g Tris187.65g Glycine 溶于超纯水中，定容到1000ml 93.825g Glycine 5×缓冲液10g SDS 5g SDS8. 2×SDS上样缓冲液：2×（50mMTrispH6.8+2%SDS+10%甘油+0.1%溴酚蓝+50mMβ-巯基乙醇）loading buffer10ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8)2g SDS10ml 甘油超纯水定容到50ml。
western blot实验步骤
蛋白质的提取（整个过程冰上进行）一．组织膜蛋白裂解液bufferA+1%蛋白酶抑制剂蛋白保存液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，1500转15min3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中（离心管事先用去离子水冲洗）用裂解液配平4.差速离心33000-35000转（45000g）30min5.弃上清，沉淀加入150μl左右蛋白保存液（根据沉淀的量调整）用枪来回吹打使沉淀溶解，枪头在液面下，尽量不要出沫6.将上述液体分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存二．组织总蛋白裂解液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗，用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，13500转30min3.取上清分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存三．细胞总蛋白裂解液RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.将培养瓶中培养液倒掉，加入PBS冲洗5-6遍，倒掉PBS，用枪吸出倒不尽的PBS2.每瓶加100-150μl裂解液，用细胞刮刀尽量将细胞刮下来（刮刀用前去离子水冲洗，用纸吸干水，用完一样处理）用200枪转入1.5ml离心管中3.超声破碎细胞，频率80-100间，超声探头（用前用纸擦，用后用纸擦并盖上盖）插入液面下，超声3-5s停3-5s，总共20s左右，停止5min左右4.重复上步4-6次5.4°C离心13500转15min6.取上清分装到0.5ml离心管中，每管40μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存。
western blot实验实验步骤
western blot实验实验步骤
Western blot实验步骤如下：
收集蛋白样品：使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。
然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
SDS-PAGE凝胶配制：参考一些文献资料进行配制。
样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
上样与电泳：将处理后的蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
Western blot步骤
Western blot操作步骤(一)BCA法测定蛋白质含量1.按照BCA方法，利用酶标仪建立蛋白标准曲线；2.测试样品蛋白含量，以计算出合理的上样量。
(二)SDS-PAGE凝胶电泳1.按装模具：取两块玻璃板（1.5 mm厚度），洗净风干后，安装玻璃板，确保下端对齐，不漏液。
2.制备分离胶，分离胶浓度依据所测蛋白分子量来确定。
3.分离胶的灌注：凝胶混匀后，灌入已安装好的玻璃板中，至玻璃板上缘约2cm左右止，缓缓加入超纯水，覆盖在分离胶顶部，防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应，室温聚合。
4.配制浓缩胶，待分离胶聚合后，倒去超纯水，并用滤纸吸干残留的液体，灌制浓缩胶。
5.浓缩胶灌到已聚合的分离胶之上，保持短玻璃板齐平，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，在此过程中应避免气泡的产生，室温聚合。
6.浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳子，凝胶玻璃板固定于电泳装置上，放入电泳槽内。
在内外槽内加入1×SDS电泳缓冲液，使电泳装置底部的电极丝完全浸入缓冲液中。
7.样品准备：样品中加相应的上样缓冲液，放入沸水中加热3-5min，然后上样。
8.电泳：上样完成后，接通电源。
浓缩胶部分保持恒压80 V，分离胶保持120V，电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部时停止。
(三)Western blot (免疫印迹法检)1.电泳结束后，从电泳装置上卸下玻璃板，取出凝胶。
去除上层的浓缩胶，将凝胶置于转移缓冲液中浸泡30 min；2.准备与胶同样形状、大小的PVDF膜和2张滤纸，将膜和滤纸置于转移缓冲液中浸泡20 min。
(PVDF膜必须先在甲醇溶液中浸泡激发)；3.湿转：将凝胶、PVDF膜、滤纸、棉垫在转移缓冲液中充分浸泡后进行三明治叠板（由负极到正极依次为，棉垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-棉垫）；4.接通电源，所转膜蛋白的分子量设置电压，开始转膜（转膜过程在冰浴环境中）。
(四)免疫检测1.将转好的PVDF膜放入培养皿中，加入适量的封闭液，在4℃冰箱中过夜（或室温封闭2 h）；2.按抗体的效价用5%的BSA（或封闭液）稀释抗靶蛋白特异性抗体(一抗)。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
Western blot具体实验操作步骤
一、提取总蛋白1.将皿中上清吸光后，用外用PBS将皿洗3遍，最后一遍将皿内液体吸光（否则会降低蛋白浓度）。
（亦可先将带有PBS的细胞刮入1.5ml EP管，离心后弃去上清）2.配制裂解液:1ml RIPA裂解液（4度冰箱棕瓶）(0.5M Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1%NP40, 0.5% 去氧胆酸钠, 0.1%SDS)加入5μl PMSF（-20度冰柜内矩形盒小管内）(蛋白酶抑制剂，防蛋白降解).根据皿中细胞团块大小加入100-300μl裂解液, 4℃摇床30min3.皿中液体吸至1.5mlEP管，离心机预冷后， 4℃，12000×g（RCF），离心15min后取上清(装于500μlEP管)（可分装后-20℃保存）。
二、BCA蛋白浓度测定1.按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；2.完全溶解蛋白标准品（存于-20℃冰箱第一抽屉），取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml；3.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的标准品孔中，用专用生理盐水补足到20微升;4.加1μL样品到96孔板的样品空中，加生理盐水19微升;5.各孔加入200微升BCA工作液，37℃孵箱放置30分钟;6. 570nm波长测定蛋白。
根据标准曲线计算出蛋白浓度EXCEL详细过程：标曲：上一行吸光度，下一行浓度（0，0.5，1，2，4，6，8，10），以此作标曲，标曲相关系数须达两个9，以这次的样品为例，算得两样品浓度分别为4.09和5.26 因为须上样100μg，所以算得须上样的蛋白体积=100/4.09=24.5μL所以上样须补水30-24.5=5.5μL及βme：6×SDS（2：3）为10μL现此样品蛋白体积足够煮10份，即按照245μL蛋白样品+55μL水+100μLβme：SDS（2：3）来配注意：SDS很粘，须涡旋再低速离心，使用枪时须慢吸三、煮蛋白：加样配制: 总体积:40μL（含蛋白液与dH2O混合物30μL+β-meSDS10μL）1.β-巯基乙醇（β-me）：6×SDS（2：3）样品缓冲液10μL2.蛋白取量取一组蛋白中,样品蛋白加的体积=蛋白浓度最低的浓度*30μL/每个样品浓度3.剩余的体积即30μL-样品蛋白加的体积，即为各管需补加水的体积4.多加一点防煮时蒸发部分混和后file22-start100℃煮沸5 min。
Western Blot 详细实验步骤
Western Blot protocol1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。
加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。
放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。
2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。
3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。
1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。
2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。
3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。
随后轻轻加3ml乙醇液封页面。
静置30min。
4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。
5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。
6）静置30min后拔掉梳子。
取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。
7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。
（TEMED在灌胶前加入）4，上样：1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。
2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。
5，转膜：1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。
2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。
3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。
4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。
(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。
WB-Western Blot实验步骤及讲解
概念
通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品 进行着色，通过分析着色的位置、深度获得特定蛋白质在 所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。 因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。
分类
➢ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
蛋白提取步骤
为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白 酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。
1. 于-20℃冰箱取出蛋白裂解液及PMSF等，常温下溶解；BCA测试盒、5×Buffer置冰 上备用；将已高压消毒的匀浆器及弯镊置冰上冷却备用；开启低温离心机调至4℃ 备用、烤箱调至37℃备用。
2. 组织样本于冰上冻融后，称取适量组织（约30-50mg）放入匀浆器中，准确记录所 夹取组织重量。
蛋白提取步骤
5. 上述裂解液于低温离心机内离心，12000rpm×15min，4℃。 6. 离心完成后，小心取出离心管，可见液体分成3层，上层为白色脂肪层，中层为 澄清蛋白质溶液，下层为组织沉淀，用适当量程的移液枪小心吸取中间层蛋白溶 液于1.5mlEP管中，记录所吸取体积（ul）。 注意：宁可少吸不可多吸！
实验步骤
5、一抗孵育 根据目的蛋白选择对应的一抗及合适的稀释比例，用封闭液对抗体
进行稀释。一抗孵育条件：4℃冰箱，过夜（＞12h）。
建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书， 了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。
实验步骤
6、洗涤一抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15 min或4次×10 min 。
选择二抗抗体取决于一抗抗体的种属来源。 例如，如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体，二抗抗 体必须是抗小鼠的抗体；如果一抗抗体是兔来源多克 隆抗体，二抗抗体必须是抗兔的抗体。
Western blot 实验步骤详尽版
Western bolt 实验步骤详尽版蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳实验目的：分离目的蛋白实验仪器：移液枪，玻璃瓶，胶模，垂直板电泳槽，电泳仪，水浴锅，通风橱，染色和脱色用器皿实验材料：ddH2O，30%丙烯酰胺溶液（Acrylamide-Bisacrylamide 29：1），1.5M Tris-HCl，0.5M Tris-HCl，10%SDS，10%APS，TEMED，1*蛋白上样缓冲液，5*蛋白上样缓冲液，考马斯亮蓝R250，0.2M KCl溶液，欲染蛋白marker，1*SDS-PAGE电泳缓冲液实验步骤：1.安装制胶模具。
2.调制5ml 12%的分离胶，立即灌注至模具高度的70%（绿杠下缘）。
5ml 12%分离胶的配方：1.8ml ddH2O，2.0ml丙烯酰胺溶液，1.3ml 1.5M的Tris-HCl缓冲液，0.05ml 10%SDS，0.05ml 10%APS，0.002ml TEMED。
3.加一层ddH2O，约30分钟后聚合（胶凝固），胶层和水层可见折光界面。
4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。
5.调制1ml 5%浓缩胶，立即灌注，插入梳子。
静置。
1ml 5%浓缩胶配方：0.55mlddH2O，0.17ml丙烯酰胺溶液，0.26ml 0.5M的Tris-HCl缓冲液，0.01ml 10%SDS，0.01ml 10%APS，0.001mlTEMED。
6.胶凝后装配垂直板电泳槽，向电泳仪倒入1*SDS-PAGE电泳缓冲液，内槽倒满，外槽倒至一半高度。
7.取16μl蛋白样品与4μl的5*蛋白上样缓冲液混合，水浴锅内煮沸5分钟。
取6μl蛋白marker与6μl 1*蛋白上样缓冲液混合。
8.加样电泳，每孔加样12μl。
电泳参数为：70V 15分钟左右，150V 30分钟左右。
（时间可以调整，以欲染Marker各条带清晰为准）9.卸下玻板，剥离凝胶放在盛有转膜缓冲液的器皿内，切下目的蛋白所在区域的凝胶，注意保留欲染Marker，且最好保留多条欲染Marker条带（因此电泳时间也不要太长，让Marker紧凑一些）。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
Western Blot 实验方法
WB Protocol准备：提前在-80冻装水冰袋，检查各项溶液，甲醇等。
1、SDS-PAGE2、Western Blot1）转膜（湿转）48 mM Tris，39 mM glycine，20% methanol。
(半湿转)25mM Tris，192 mM glycine，20% methanol。
（湿转）如果蛋白<100kD，加入200ml甲醇，如果>100kD，加入100ml甲醇。
如果蛋白较大（>100KD，可以加入SDS至终浓度为0.1%。
）配制好的转膜缓冲液，-20度预冷1h后使用。
配制10⨯转膜缓冲液（1000 ml）（半湿转）Tris 58.147g M Tris=121.14Glycine 29.289g M Glycine=75.1定容至1000 ml。
配制10⨯转膜缓冲液（1000 ml）（湿转）Tris 30.3g M Tris=121.14Glycine 144g M Glycine=75.1定容至1000 ml。
溶解后室温保存。
用时稀释10倍，并加入甲醇至20%通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。
（先加甲醇易产生沉淀）。
最好现配现用，-20度预冷1h后使用。
（1）将样品在SDS-PAGE 电泳,移去平板,将凝胶剪成适当大小以进行转印。
在凝胶上作记号以确定方向，浸泡在电转液中。
（2）剪 1 张PVDF膜和6 张吸附滤纸,其大小与凝胶相当。
（3）将PVDF膜放入甲醇中浸泡3min 然后将膜转入转印缓冲液中浸泡30min。
同时将支持垫和滤纸浸泡于1 转膜缓冲液中浸湿。
（4）组装转印夹层组合:依次为负极（黑色）-支持垫-3张滤纸-胶-膜-3张滤纸-支持垫-正极（红色）。
将组装好的夹层组合放入转印槽中,并使膜靠近正极。
注：1. 海绵、滤纸均用电转液浸湿；2. 胶用电转液清洗；3. 小心地将支持垫及滤纸与膜中的气泡用玻璃棒排出4. 膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
WesternBlot实验方法
WesternBlot实验⽅法⼀、溶液配制1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10 ml称取NaF 41.99mg，超纯⽔8ml溶解后定容⾄10ml2.30%聚丙烯酰胺凝胶液（交联度3%）：100ml丙烯酰胺29 gN,N'-甲叉双丙烯酰胺 1 g加去离⼦⽔⾄100 ml 混匀,棕⾊瓶中避光保存3.0.01mol/L ⼄酸钠NaOAc（pH 5.2）（MW=136.08）25ml136.08×0.01×25×10-3=34 mg，称取34 mg⼄酸钠，加⼊20ml蒸馏⽔，待其溶解后，⼄酸调pH值⾄5.2，再定容⾄25ml。
4.1M DTT 10 mlDTT(⼆硫苏糖醇) 1.545g0.01mol/L ⼄酸钠（pH 5.2）8ml溶解后定容⾄10ml，0.22µm滤膜抽滤。
5.4×SDS-PAGE Loading Buffer 10ml0.2M Tris-HCl(pH=6.8) 1M 4 ml8% SDS 10% 0.8 g0.4% 溴酚蓝40 mg40% Glycerol 4 ml三蒸⽔定容⾄10 ml0.4M DTT 临⽤前1M贮存液按400 µl/ ml⽐例加⼊上述溶液中。
6. 1.5M Tris(pH 8.8) 100 mlTris 18.171 g加⼊三蒸⽔80 ml，溶解后加⼊浓HCl调pH值⾄8.8，定容⾄100ml7.1M Tris(pH 6.8) 100 mlTris 12.114 g加⼊三蒸⽔80 ml，溶解后加⼊浓HCl调pH值⾄6.8，定容⾄100ml8.1×电泳缓冲液：1000 ml0.25M Tris 3 g0.19M Glycine 14.4 g0.1% SDS 1g三蒸⽔定容⾄1000 ml9.1×Transfer Buffer：1000 ml0.25M Tris 3 g0.19M Glycine 14.4 g三蒸⽔定容⾄900 ml使⽤前加⼊甲醇100ml10.PBS Buffer137 mM NaCl 8g2.7 mM KCl 0.2 g10 mM Na2HPO4 1.44 g2 mM KH2PO4 0.24 g三蒸⽔定容⾄1000 ml调节pH值⾄7.4，⾼压灭菌，4℃保存11.PBST Buffer500 ml PBS中加⼊250 µl Tween-20。
Western blot-实验操作
Western blot-生物素标记蛋白配方：1.1转移缓冲液（TB）（48mmol/L Tris，39 mmol/L甘氨酸，20%甲醇）甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW 121.14） 5.8g甲醇 200mlDDI H2O 800ml共计1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3-5次。
1.2TBS缓冲液（ 100 mmol/L Tris-HCl pH7.5，150 mmol/L NaCl）1 mol/L Tris-HCl （pH7.5）100ml 或12.1gNaCl 8.8gHCL调PH7.5DDI H2O 调至1000ml共计1000ml1.3 TBST缓冲液（含0.05%Tween20的TBS缓冲液）20%Tween20 1.65mlTBS 700ml1.4封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉 5gTBST 100ml溶解后4保存。
使用时，恢复室温，用量盖过膜面即可，一次性使用。
1、平衡将要转移的胶置于转移缓冲液TB中（配方见2.1），平衡10min。
2、根据膜的大小剪取滤纸片、膜。
装配时滤纸片若是进口厚片只需2片，国产滤纸片需要6片，放入转移缓冲液平衡10min。
如用PVDF膜则在甲醇溶液中泡3-5S。
3、装配3明治，黑色面开始依次放海绵、滤纸（进口1层、国产3层）、胶、膜、滤纸（进口1层、国产3层）、海绵。
锁紧夹子。
注意每层放好后滤去气泡，胶放于负极面（黑色面）。
4、将转移槽装配好后，黑色面与黑色面相对，倒入转移缓冲液TB，置于冰浴中（可在脸盆中加入冰袋），插入电极，100V 2h，（电流约为0.3A）。
注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5、转膜结束后，切断电源、取出杂交面。
6、免疫杂交与显色1)用25mlTBS（配方见2.2）洗膜5min、室温摇动。
2)把膜置于25ml封闭液（配方见2.5）中37o C，2h摇动。
3)15mlTBS/T洗3次（5min/T）。
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蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB）一、蛋白提取与样本制备（一）操作步骤1.提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化；2.根据样本数配制混合溶液：PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1：100，现用现配）；3.裂解组织：每个样品称取50mg，加1ml混合液，在冰上用组织剪剪减为碎屑，电动匀浆后4 ℃静置2h使其充分裂解，离心12000g，4 ℃15min，取上清；4.蛋白定量：1)取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；2)标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍比稀释（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul + 生理盐水80ul）；3)配制显色剂BCA混合液：a液：b液=50:1。
配制量=200ul*（孔数+6）；4)加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；5)贴上封口胶，37℃震荡混匀30min；6)562nm波长处测吸光度OD；7)根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。
5.样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度；6.样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）；7.100℃变性5min。
8.分装并存于-20 ℃，避免反复冻融。
二、配置相关试剂（一）10%的SDS（戴口罩称取）：试剂剂量SDS （g）10双蒸水（ml）80用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。
室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。
（二）1.5M Tris/HCl（pH8.8）试剂剂量Tris base （g）18.17双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH 8.8，最后定容至100ml。
室温下保存。
（三）0.5M Tris/HCl（pH6.8）试剂剂量Tris base （g） 6.06双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH6.8，最后定容至100ml。
室温下保存。
（四）丙/双丙（戴口罩称取）试剂剂量丙烯酰胺（Acr）（g）75亚甲双丙烯酰胺（g） 2去离子水（ml）230加热溶解后，定容至250ml，4℃棕色瓶避光保存。
使用时注意恢复至室温且无沉淀。
（五）10X电泳涤缓冲液试剂剂量Tris base （g）15甘氨酸（g）72SDS（g） 5去离子水（ml）500用HCl调pH至8.3。
已经配制了500ml的储存液。
室温保存。
（六）10X的TBS溶液配制试剂剂量Tris base（g）24.2NaCl（g）80去离子水（ml）1000用HCl调整PH为7.6，己经配制了1000ml的10X的TBS液。
室温保存。
（七）洗涤液的配制（TBST）试剂剂量10X TBS （ml）50TWeen-20 （ul）500去离子水（ml）450TWeen-20的体积为TBST的0.1%。
室温保存。
三、制胶（一）制作分离胶1.注意要点：(1) 下表中的数据为配制一板胶的用量；(2) 10%过硫酸铵溶液现用现配；(3) 根据所测蛋白分子量大小选择配制合适浓度的凝胶；(4)胶的凝固速度与10%过硫酸铵和IEMED的使用量呈正相关，冬天可适当加量或提高室温；(5) 加胶（水）时，从左上角沿着边缘缓慢匀速加入，避免混入气泡（或胶面不平整）；(6) 加入的胶中混有小气泡时可轻弹玻璃板使之浮出；2.操作方法：(1) 配制10%过硫酸铵溶液500ul：选用1.5ml的EP管，在微量天平上去皮，称取过硫酸铵粉末50mg，加入去离子水500ul，在振荡器上混匀至过硫酸铵完全溶解。
(2) 取酒精棉球擦拭干净玻璃板正反两面。
(3)固定玻璃板到底座上：先对齐下缘和左右缘，再夹左右的夹子(4)测试是否泄漏：向玻璃夹缝中加入约3ml的去离子水，静置1分钟，检查玻璃板下缘与胶条相交处是否有漏出的水。
无泄漏则连底座一起拿起向一侧倾斜倒掉玻璃夹缝中的水，并伸入干净的滤纸条吸干残留的水。
有泄漏则需重新固定玻璃板。
(5)按照下表中的剂量和顺序依次添加并混合均匀各种试剂。
适用蛋白分子量〈20 kDa 20 - 60 kDa 60 - 100 kDa 〉100 kDa 试剂胶浓度15% 12% 10% 7.5% 水（ml） 1.44 2.04 2.46 2.94 1.5M Tris (pH8.8)(ml) 1.5丙/双丙（ml） 3.0 2.4 1.98 1.5 10%SDS（ul）6010%过硫酸铵（ul）30TEMED（ul）9(6)加入配制好的胶，量为略高于两侧夹子上缘为宜（1mm玻璃板加4.3ml）。
(7)在分离胶上方加满水封闭（1mm玻璃板加1.6ml）。
(7)待可观察到明显的水胶分界线时，倒掉水并用干净的滤纸条吸干残留的水珠。
（二）制作浓缩胶1.注意要点：(1) 插入梳子时，注意正反面，上缘光滑的一面对着大玻璃插入(2) 待EP管内剩余的浓缩胶凝固后即可水平拔出梳子2.操作方法：(1) 按照下中的剂量和顺序依次添加并混合均匀各种试剂。
试剂剂量水（ml） 1.80.5MTris（pH6.8）（ul）750丙/双丙（ml）40210%SDS（ul）3010%过硫酸铵（ul）30TEMED（ul） 6四、加样（一）注意要点：1.加样前混匀各样本。
2.两侧靠边的孔加1倍的上样缓冲液，第二孔加marker,其他孔加入样本。
3.每加入以一次，加样针在外槽电泳缓冲液中抽吸冲洗3次。
4.加样量20-30ul，保证所加的样量中蛋白含量30—50ug。
五、电泳（一）电泳缓冲液的配制1.800ml 1倍电泳缓冲液的配制：试剂剂量10倍电泳缓冲液（ml）80水（ml）720（二）注意要点：1.固定玻璃板时，大玻璃板在外侧，小玻璃板在内侧。
2.只做一板胶时，另一侧用配套的塑料板固定，塑料板两侧有凹槽的一面向外。
3.加电泳缓冲液时，要保证内槽中加满，再加外槽。
外槽的电泳缓冲液量要足够淹没内槽底部的导线。
六、转膜（半干法）（一）转移缓冲液的配制1.1200ml转移缓冲液的配制：试剂剂量Tris base（g） 3.636甘氨酸（g）17.28水（ml）960甲醇（ml）240 转膜一次所需用量为1200ml。
4℃密封保存。
（二）蛋白转移至膜上1.注意事项：1)PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化（活化PVDF膜上面的正点基团，使它更容易跟带负电荷的蛋白质结合）。
2)夹板的前后两块的颜色与内槽前后的颜色要对应。
（转移方向：负极→正极，胶→膜，黑色夹板→红色夹板）3)转移缓冲液的量以能完全淹没海绵中的滤纸、胶和膜为宜，但不能淹没两侧的导线金属接头，以免发生短路。
2.操作方法：1)剪膜和滤纸，尺寸为8x4.5cm。
2)在膜的右侧边缘竖着用铅笔标记上日期。
3)倒约35ml甲醇到45ml的EP管中，把膜放入活化3-5min。
4)取出活化过的膜，与剪好的滤纸和海绵一起浸入装有转移缓冲液的容器中。
5)用小塑料板从下缘撬开玻璃板，切除胶上部的浓缩胶和下缘多余的分离胶。
6)用小塑料板把胶条移入容器中的转移缓冲液里。
7)转膜夹板的黑色面在下，其上按顺序摆放：海绵—4张滤纸—胶—膜—4张滤纸—海绵。
8)扣紧夹板放入内槽和外槽中，加满转移缓冲液。
9)调整电源，100mA，2h。
七、封闭（一）配制封闭液4%的BSA（Albumin bovine serum）1.40ml的BSA溶液配制：TBST 40ml + BSA粉末1.6g（二）膜的封闭1.把膜放入装有TBST洗涤液的盒中，放在振荡器上洗脱2次，5min/次。
2.把之前配制好的4%BSA封闭液倒入避光盒中，取出洗脱好的膜放入，4℃，封闭1h。
八、洗涤把膜放入装有TBST洗涤液的盒中，放在振荡器上洗脱3次，15min/次。
九、孵育（一）抗体的稀释1.一抗B-Actin：（1:1000）B-Actin Mouse Ab 3ul Solution 1 for primary 3000ul2.一抗Akt：（1:2000）Akt Mouse Ab 1.5ul Solution 1 for primary 3000ul3.一抗P-Akt：（1:1000）P-Akt Mouse Ab 3ul Solution 1 for primary 3000ul4.一抗IRS-1：（1:1000）ISR-1 Rabbit Ab 3ul Solution 1 for primary 3000ul5.一抗P-IRS-1：（1:3000）P-ISR-1 Rabbit Ab 1ul Solution 1 for primary 3000ul6.二抗山羊抗鼠IgG ：（1:5000）山羊抗鼠IgG 1ul 4%BSA溶液（封闭液）5000ul 7.二抗抗兔：（1:3000）抗兔二抗1ul 4%BSA溶液（封闭液）3000ul十、显影。