第五章园艺植物制片方法

亮叶忍冬叶片解剖构造
韭菜根横切面
女贞茎横切 面（皮孔）
南瓜茎横切面局部
第四节
电镜制片
电子显微镜（简称电镜）大体上分两类，一是扫描 电镜，二是透射电镜。扫描电镜能直接观察到样品表面
的三维立体结构，如植物的花、叶、果实的表面结构等；
投射电镜可观察到植物组织的超微结构，如叶绿体的膜 结构韧皮部疏导组织结构等等。它们的制片方法有很大
可保存1-2周或更长时间。
第二节
压片及涂片
涂片和压片是进行植物染色体观察研究常用的制
片方法。
涂片是将新鲜的材料或者是经过固定的材料于载
片上，托涂成均匀一层，经染色后盖上盖玻片镜检。
压片是将处理后的材料于载片上分散后加盖片，
用拇指或镊子轻轻挤压盖片，使组织分散成一片，然
后镜检。
进行染色体观察时注意，若进行染色体数目测定
的水滴中，加上盖玻片制成临时制片进行观察。
在试验中，有时因各种情况所取材料无法马上进行
制片。可以将其保存在固定液中，常用的固定液为
F.A.A固定液，它不但是优良的固定液也是优良的保存 液 ，其配方为：5ml福尔马林（甲醛）：5ml冰醋酸： 50-70%的乙醇90ml。
用徒手切片的材料不宜过大，一般以表面不超过5-
（三）固定
目的是 尽量完善的稳定和保存样品细胞内的各种成分和结构，使 其接近生活时的状态。 常用的方法是戊二醛—四氧化锇双固定法。先
用1-3%的戊二醛/缓冲液固定数分钟至数小时，再用1%锇酸/缓冲液在
4℃下固定30-60min。 （四）脱水和置换 采用系列乙醇或丙酮逐级脱水，一般为： 30%→50%→70%→80%→95%→100%，每步15-20min。
切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。
9.脱蜡、染色、脱水透明和封片：粘片后要经过脱蜡、 染色、再次脱水透明，然后封片永久保存。
脱蜡、染色和脱水透明的过程仍采用等
级法逐渐进行。最后加拿大树胶封片，然后
贴标签镜检及保存。
以上是石蜡制片的一般步骤；为了获得
良好的制片效果，需要制片者的大量实践并 在实践中不断摸索、积累经验方可。
载玻片一侧向材料轻轻吹气，使组织分散成一薄层。
8. 火焰干燥：将载片于酒精灯上微微加热烤干。
9．染色：用40:1的Giemsa染液染色4-30分钟或更长，
蒸馏水清洗，空气干燥后可用树胶封片。 10. 镜检：于显微镜下观察。
第三节
石蜡制片
石蜡切片是光学显微镜的制片技术中最常用的一种 方法，属于永久制片。一般的植物材料都可以用此法制 片。但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬 或发脆等缺点。
（五）干燥
是制片关键一步。目的是去除样品中的游离水或已取代游离水的 脱水剂，使样品中不含有液态物质 。临界点干燥法是目前公认的较好
方法。
（六）粘样 将干燥好的样品用导电胶将样品粘在样品台上，并做
好标记。常用的有银粉导电胶、石墨粉导电胶、双面胶带、
普通胶水等。 （七）镀膜（喷涂） 是把粘贴到样品台上的样品和样品台表面同时喷涂上 一层金属膜，使样品具有良好的导电性，以便下一步观察。
切片刀准备：超薄切片刀有两种，一是金刚刀，二是玻
璃刀。前者价格昂贵、质地坚硬、经久耐用；后者制作方
便、价格低廉、但刀刃较脆、不耐用、不能切硬质材料。 制刀用玻璃为硬质玻璃，含硅量72-75%以上。
切片：是用超薄切片机切出50nm后左右的超薄切片，
以供观察。 展片与捞片：切下的超薄切片漂浮在刀槽液面上，需
封于蜡块上，以免样品混淆，以备切片。
7.修块和切片：将已包埋好的蜡块切成小块，每一小块
包含一块材料。然后按照所需的切面，进行修整。把蜡
块粘接在载蜡器上，用切片机将蜡块切成连续的蜡带。 8.粘片：将切下来的切片粘在洁净的载玻片上。粘片时 先在载玻片上滴上一小滴粘片剂，加几滴蒸馏水，然后 用镊子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用拨针将
要将它捞至于铜网上，才能染色和电镜观察。由于切片很
薄，在切片过程中易皱褶，使样品结构重叠，因此在捞片 前需进行展片。捞片后，用滤纸吸去多余水分，然后将载 网放入样品盒，至于干燥器中保存，待染色。
液、富民隆。预处理的时间一般为2-12小时。
3. 固定：把细胞迅速杀死，使蛋白质变性沉淀，
尽量保持材料结构的原有状态，以备进一步处理。 常用的固定液为卡诺固定液，即3：1的纯酒精:冰 醋酸溶液。固定时间一般为1-24小时。 4.解离：根尖、茎尖等体细胞组织，需经过某些 处理，除去细胞之间的果胶层并使细胞软化，这种细 胞分离和软化后的组织才便于压片。最常用的是酸水
（3）以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇
指应低于食指，以免切伤手指；材料高出指尖。
（4）右手执刀，将刀平放在食指上，刀口朝
内，刀面与材料断面平行，然后以均匀快捷的动
作自左前方向右后方以臂力带动刀片水平切割移
动，不要用腕力。同时还要注意，切时动作要迅
速，材料一次切下，切忌停顿或拉锯式切割。
（5）连续切数片后，将切下的薄片轻轻移入盛水的培 养皿中备用。然后挑选薄而透明的切片，放在载玻片上
要求取样个体数在5个以上，细胞总数在30个以上；若 进行染色体核型分析（组型分析)则要求取样应是来源 于不同个体的5个细胞。 一、常规压片法
1.取材：于细胞分裂旺盛时期取样。一般取根尖、茎
尖。 2.预处理：防止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中 期阶段；使染色体收缩变短，便于观察统计。常用药 剂有秋水仙碱溶液、8-羟基喹啉、对二氯苯饱和水溶
8mm²为宜。对于过于柔软或微小的材料（如叶片、细小
的根尖等）需要借助一些夹持物方可进行切片，如果临 时制片需保存一段时间，（1）将材料封在水中，每隔 20-30分钟再加一滴水，此法可保持数小时；（2）用 10%-30%的甘油水溶液代替清水封片，并将制片放在铺有
湿滤纸的大培养皿中保存，或用石蜡或指甲油封边保存，
解和酶处理两种。
５．染色：常可用孚尔根染色法或醋酸洋红等核染色 剂进行染色。
６．压片：将材料移至载玻片上，盖上盖玻片，用解
剖针或用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞 分散，再用拇指轻挤压盖片使组织成为一薄层。 ７．镜检：将压片置于显微镜下观察，选择染色体分 散、清晰的细胞进行统计记数，并可照相绘图，以便 进行核型分析。同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上 分别做记号，以便再次观察和照相。
８．封固：好的压片，可采用冷冻干燥后，用光学树
胶封固保存。也可进行脱水透明等步骤制成永久切片。
若临时保存，可以用石蜡封边，放于培养皿中于冰箱 冷冻室内短期保存。
二、去壁低渗法（涂片法）
1.取材：同上述常规压片法。
2.预处理（前处理）：同上述常规压片法。
3.前低渗：将处理后的材料防灾0.075M KCl低渗液中， 在20-25℃条件下处理30分钟左右.
具B染色体的黑麦基因组核型
4．去壁：倒去KCl溶液，加入2.5%混合酶液（纤维素酶
与果胶酶各占2.5%），在温度25-30℃下处理2-5小时左
右。酶液与材料的比例适当，酶液不能过少。
5. 后低渗：倒去酶液，用蒸馏水冲洗2-3次，然后在蒸
馏水中停留5-10分钟左右后进行后低渗。 6. 固定：用甲醇:冰醋酸（3:1）固定液固定。 7. 涂片：将去壁固定的材料放在载玻片上，加一滴固 定液，然后用镊子将材料夹碎，去掉大块残渣，然后从
（三）脱水
常用的脱水方法是逐级脱水，即采用的脱水剂浓度梯 度为30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（100% 浓度 中换3次），常用的脱水剂为乙醇或丙酮。每一级脱水剂 中停留时间为10-20min，脱水剂用量一般为样品体积的 10倍以上。 （四）渗透与包埋 将脱完水的组织先后经过脱水剂和环氧树脂渗透液 （是常用的包埋剂，目前常用的型号为Epon812），比例 分别为3：1→1：1→1：3，每步30-60min。将渗透好的 样品块放到适当模具中，灌上包埋液包埋，经过加温聚 合形成一种固体基质（也叫包埋块），已备切片。
不同。
一、扫描电镜常规制片方法 （一）取材 基本要求是 ：动作应迅速、部位要准确 ；刀片 要锋利；尺寸不宜过大 ；采取易分散的材料，要注 意防尘、样品分散；数量必需取够。
（二） 清洗
共清洗3次。 清洗掉样品表面杂质等附着物；
除掉没有和样品成分发生反应的固定剂。常用的清洗
液有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液以及含酶的清洗 液，可依具体情况选择 。
中常用的一些基本方法和原理。
第一节
徒手制片
一、徒手制片（切片）及特点
徒手制片一般指徒手用刀片把新鲜的植物材料切成薄
片的制片方法。 此制片法主要优点是：（1）能及时观察研究植物生 活组织的结构和天然色彩；（2）方法及用具简单，不需 切片机等机械设备，短时间即可完成。主要缺点是（1） 对于微小、柔软、水分过多以及坚硬的材料，难以用徒手 切成薄片；（2）对于操作不熟练者，往往切成厚薄不匀 或不完整的切片。
（一）取样 要求取样要有代表性、迅速、准确、及时、体积小、 低温、防损伤。一般要求体积0.5-1.0mm2。 （二）固定
目的是要在分子水平上真实的保存细胞超微结构的 每一细节。常用的方法是化学固定法，目前大部分植物 材料采用的固定方法是戊二醛—锇酸双固定法，即先用 戊二醛作预固定，然后用锇酸作后固定。对于一般植物 叶、幼茎、幼根可用3%的戊二醛固定2小时，用1-2%四 氧化锇固定2-3小时。
操作程序如下：
1. 材料的采集与分割：根据制片的目的和要求采集 材料，材料要有代表性。材料采后应尽快进行分割固 定。为使固定液能迅速的渗透材料，要进行材料分割。 分割块宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀
死固定。
2. 杀死与固定：利用药剂迅速把细胞杀死，以保持 材料本来的状态和结构。常用的固定液有F.A.A固定 液、卡诺固定液等，前者还可作保存液。
是逐级进行，可减少材料收缩。
5.浸蜡：逐渐除去透明剂,并为包埋剂所代替。常用
的包埋剂是石蜡。浸蜡过程是使石蜡慢慢溶于浸有 材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深入 到材料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代， 以便切片。 6.包埋：将浸蜡后的材料包埋在石蜡中。此步骤要 迅速，且不要使石蜡块中有气泡。注意将样品编号
二、徒手制片的方法及注意事项
徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用单面保安刀
片。要获得良好的切片，首先要保持刀口的锋利。切片方
法及步骤为： （1）准备工作（盛好清水的培养皿、显微镜、载玻片、 盖玻片、刀片等用具）。 （2）拿取材料进行切片，材料可以是新鲜的材料，也 可以是经过固定的材料（切片时，将欲切材料断面和刀片 上滴上清水以保持材料湿润）。
一般喷涂10-20nm厚的金属膜，常用的金属有金、铜、铝、
金-钯。
（八）观察
喷好的样品就可以用扫描电镜进行观察了
（一般20kv）。如果一时不能观察，需把样品 放入干燥器中保存，以防受潮或被污染。
OK！
扫描电子显微镜
苹果花粉粒
蜀 葵 花 粉 粒
一 串 红 花 粉 粒
二、透射电镜制片基本方法（超薄切片）
（六）超薄切片 标准的超薄切片应该是厚度适中、均匀、平整、无刀痕、 无颤纹和皱褶。基本步骤为：准备切片刀和铜网→修整包 埋块→切片→捞片。 铜网准备：超薄切片要放在载网上才能进行染色等操作， 并最终放到电镜中观察。载网是用无磁性金属材料做成的， 厚50微米，直径一般为3mm，一般用铜材料，所以又叫铜网。 铜网要经过清洗，方可使用。目前清洗方法主要有：超声 波清洗法、酸碱清洗法。 支持膜的准备：铜网的网孔很小，但对于放置超薄切片 及其他样品来说，网孔还嫌大，不足以平坦地支持切片， 所以要在铜网上覆一层透明的膜——支持膜。
3.脱水：除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包
埋等步骤的进行。常用的脱水剂为酒精。脱水采用
等级脱水（系列脱水），即从较低浓度酒精开始， 逐渐替换到高浓度酒精。 4.透明：将脱水剂从材料中除去，使材料透明，增 加折光系数；便于下步的浸蜡和包埋等程序。透明 剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的 药剂。常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也
第五章
园艺植物制片Βιβλιοθήκη Baidu法
植物制片是进行园艺植物科学研究所需用的一种 基本方法，比如进行植物各个器官的解剖构造观察、花
芽分化研究、授粉受精观察、贮藏营养观测以及染色体
观察等都需要进行制片。通过对切片结果的分析，可以 比较不同试验处理的效果以及了解不同树种和品种相应 的生物学特性等。植物制片技术是一个相对独立的体系， 内容繁多。在本章内容中，将介绍在园艺植物科学研究