大肠杆菌生理生化鉴定
细菌的生理生化试验
实验九细菌的生理生化试验
实验九细菌的生理生化试验
1 目的
1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理
1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法
2 原理
各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
3 材料
3.1 菌种
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种
3.2 培养基
葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）3.3 试剂
40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。
3.4 器具
超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。
4 流程
糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验
5 步骤
(一) 糖类发酵试验
1 目的
了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法．
2 原理
可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。
大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌（Escherichiacoli）是一种常见的肠道细菌，广泛存
在于自然环境中，同时也是人和动物肠道中的重要微生物。尽管大肠杆菌在人体和动物肠道中具有重要的生理功能，但在食品和饮用水中的污染却会给人们的健康带来威胁。因此，准确地鉴定大肠杆菌的方法对于食品和饮用水的安全至关重要。
一、鉴定大肠杆菌的生理特性
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，可以通过其生理特性进行鉴定。大肠杆菌是一种好氧菌，需要氧气才能生长，同时也可以进行厌氧呼吸。大肠杆菌在温度为37℃时生长最快，此时生长周期为20分钟左右。大肠杆菌可以利用葡萄糖和其他简单糖类作为碳源，同时也能够分解蛋白质和脂肪酸等有机物。此外，大肠杆菌可以产生酸和气体，这是鉴定大肠杆菌的重要特征之一。
二、鉴定大肠杆菌的培养基
鉴定大肠杆菌的第一步是选择合适的培养基。常用的培养基有MacConkey培养基、EC培养基、EMB培养基等。MacConkey培养基是
一种选择性培养基，其中含有普通细菌无法利用的普通糖类和有机酸，同时还含有一种选择性抑制剂，可以抑制大多数革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌的生长，而大肠杆菌则可以在此培养基上生长并产生红色颜色。EC培养基和EMB培养基也是常用的选择性培养基，可以选
择性地培养大肠杆菌。
三、鉴定大肠杆菌的生化反应
在培养出可疑的菌落后，可以进行一系列的生化反应来确认大肠杆菌的存在。常用的生化反应包括半乳糖发酵试验、气体产生试验、尿素水解试验、亚硝酸盐还原试验等。半乳糖发酵试验是通过观察菌落的气泡产生来判断大肠杆菌是否存在。气体产生试验则是通过观察菌落周围的气体产生情况来判断大肠杆菌是否存在。尿素水解试验则是通过观察菌落周围是否有碱性产生来判断大肠杆菌是否存在。亚硝酸盐还原试验则是通过观察菌落周围是否有红色颜色的产生来判断
微生物鉴定中常用的生理生化试验
一、实验目的
1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5.了解IMViC的原理。
二、实验原理
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下：
1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
微生物鉴定中的生理生化试验
微生物鉴定中的生理生化试验
一．实验目的
1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不
同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
4.了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二．实验原理
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下：
1.大分子水解试验
微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH 降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
2. 糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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（三）理化原因及生物原因对微生物影响
• 1.紫外线与杀菌试验
• 菌种： 大肠杆菌、枯草杆菌
• 方法：取营养琼脂平板2个，一个涂大肠杆菌，另一 个涂枯草杆菌。在其涂有细菌表面贴上以剪出不一 样图案硬纸片，然后在紫外灯下距离30厘米照射20 分钟，照射完成将硬纸片取走盖回原来平皿盖，于 37℃培养24小时观察结果。
• 培养基：葡萄糖高层琼脂、普通琼脂斜面、 水琼脂斜面、氧化-发酵培养基（小生化管）、 普通平板、麦康凯平板、淀粉平板、三糖铁斜 面、各类生化反应管等
• 器械：砂轮、试管架、接种环、接种针、灭 菌吸管、灭菌刻度移液管、灭菌棉签、胶头、 灭菌液体石蜡、酒精灯、废报纸等
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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2.药敏试验：圆纸片扩散法 菌种： 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 培养基：营养琼脂平板 方法：
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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• 3.消毒剂抑菌和杀菌试验 • 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 • 方法：与药敏试验方法是一样（纸片扩散法）
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
三、试验内容
（一）细菌生理生化试验
1、细菌对空气（氧气）需要 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 方法：用吸管将两种菌各加入两支己溶化葡萄糖深
肠杆菌科生化鉴定实验
肠杆菌科生化鉴定实验
肠杆菌科是一类常见的革兰氏阴性细菌，可以通过一系列
生化鉴定实验来进行鉴定。以下是一些常用的肠杆菌科生
化鉴定实验：
1. 硫代硫酸亚铁（TSI）琼脂糖培养基实验：在TSI琼脂
糖培养基上培养菌株，观察菌落的颜色和气体产生情况。
肠杆菌科细菌在该培养基上产生酸和气体，导致培养基中
的pH下降，产生黄色酸性反应。
2. 尿素水解试验：将菌株接种到尿素水解培养基上，观察
培养基的颜色变化。肠杆菌科细菌中的一些种类能够产生
尿素酶，将尿素水解为氨和二氧化碳，导致培养基变为粉
红色。
3. 大肠杆菌甲醛试验：将菌株接种到含有甲醛的培养基上，观察培养基的颜色变化。肠杆菌科细菌中的大肠杆菌能够
利用甲醛作为唯一的碳源，产生酸和气体，导致培养基变
为黄色。
4. 气体产生试验：将菌株接种到气体产生管中，观察管内
气体的产生情况。肠杆菌科细菌中的一些种类能够产生气体，如氢气和二氧化碳。
5. 青霉素酶试验：将菌株接种到含有青霉素的培养基上，
观察菌落的形成情况。肠杆菌科细菌中的一些种类能够产
生青霉素酶，使得培养基中的青霉素失活，导致菌落形成。
需要注意的是，肠杆菌科细菌的鉴定通常需要结合多个实验结果进行综合判断，单一实验结果可能不足以确定菌株的分类。此外，不同的肠杆菌科细菌种类可能在生化反应上有差异，因此具体的实验步骤和判断标准可能会有所不同。
大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌是常见的肠道细菌，广泛存在于自然环境中，包括土壤、水
体和动植物体内。它是引起人类肠道感染和食源性疾病的重要致病菌之一、准确鉴定大肠杆菌的方法对于食品安全和公共卫生至关重要。下面将介绍
常见的大肠杆菌鉴定方法。
1.外观和生理鉴定
大肠杆菌形态特征为革兰阴性，为短杆状细菌，常产生单一或双子。
在艾柯培养基上，大肠杆菌形成典型的金黄色、大且圆形的菌落，使用其
可以初步鉴定大肠杆菌。
大肠杆菌是革兰阴性细菌，可以通过革兰氏染色进行鉴定。大肠杆菌
的细胞壁含有脂多糖，染色后呈现红色。
2.纯培养和典型菌落的选择
将样品接种于含有葡萄糖和肉汤的液体营养培养基中，经过16-24小
时的培养后，利用墨汁培养基将菌液分带于增菌板表面，进行分离纯化。
然后选择培养在巴斯德固体琼脂培养基上呈金黄色，并有金属光泽的典型
菌落。
3.酶活性测试
大肠杆菌具有多种酶活性，常用的酶活性测试有氧化/发酵测试、甲
基红松解试验和呈色反应等。
（1）氧化/发酵测试：大肠杆菌通常以无氧产酸为代谢途径进行葡萄
糖发酵。将菌液接种于以葡萄糖为唯一碳源的气泡管中，通过产酸后的颜
色变化来鉴定大肠杆菌。气泡管中产生黄色的酸性底部，说明转化为酸性，即为大肠杆菌。
（2）甲基红松解试验：大肠杆菌代谢糖酸，产生酸性代谢产物，导
致菌落周围的甲基红转为黄色。通过添加甲基红指示剂，观察溶解指示剂
颜色的变化，由红色转为黄色可以初步鉴定大肠杆菌。
（3）呈色反应：大肠杆菌产生酶活性，能够将一些酶底物转化为有
颜色的产物。例如，大肠杆菌在聚糖中生成酶胆红素琼脂糖，呈现金黄色。这种特征可以用于大肠杆菌的鉴定。
大肠杆菌的分离鉴定PPT课件02
结果：培养液不变色----无变化（—）
培养液变为黄色----产 酸（+） 培养液变黄并有气泡----产酸产气（+）
2 硫化氢试验
原理：某些细菌能分离蛋白质中的含硫氨基酸， 生成硫化氢，遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑 色的沉淀物。
方法：将需要鉴别的细菌纯培养物，分别接种在 硫化氢培养基中，370C温箱内培养24h
结果判定
鲜桃红色或微红色，菌 落中心呈深桃红色
圆形，扁平，边缘整齐， 表面光滑，湿润
二、药敏试验
方法：取一菌种，用灭 菌的接种环致密划线 于琼脂表面（可重复 来回划线），用无菌 镊子，将各种抗菌药 物圆纸片，分别贴于 培养基表面。各片距 离相等，370C，24h 后，观察结果。
药敏结果判定
目的要求
熟悉鉴别培养基的原理 了解大肠杆菌的主要生理生化特性
一、鉴别培养
菌种 培养基类别 麦康凯培养基
大肠杆菌
红色菌落
沙门氏杆菌
无色或浅黄色菌落
SS琼脂培养基
红色菌落
浅黄色菌落
伊红美兰琼脂培养基
三塘铁培养基
紫红色或紫黑色并带有金 粉红色源自文库落 属光泽菌落
斜面和深层均为红色
斜面为红色；深层为黄色； 若产生H2S，为黑色
大肠杆菌检测原理
大肠杆菌检测原理
大肠杆菌检测是一种用于确定食品、水源或环境中是否存在大肠杆菌的常用方法。大肠杆菌是一种肠道菌群常见的细菌，其存在通常表明可能存在粪便污染或其他健康危害的风险。
大肠杆菌检测主要基于以下原理：
1. 培养方法：采集样品后，将其接种到含有适宜营养物质的培养基上，利用大肠杆菌特有的形态、生理生化特性以及产生的气体等特点进行初步鉴定。
2. 确认方法：通过进一步的生化试验，如颜色反应、形状、气体产生情况等，进一步确认被培养出的菌落是否为大肠杆菌。
3. 分子生物学方法：利用PCR技术或核酸杂交等方法，针对大肠杆菌特异的基因序列进行扩增或检测。
4. 免疫学方法：利用特异性抗原或抗体与大肠杆菌产生的免疫反应，进行检测和确认。
这些方法都可以用于大肠杆菌的初步筛查和确认，根据不同的检测需求和样品特性选择合适的方法进行检测。大肠杆菌检测的结果可以用于评估食品、水源、环境等是否存在粪便污染，从而采取相应的控制和预防措施。
大肠杆菌生理生化鉴定
1、氧化酶巴氏杆菌
1、原理：
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
2、试剂
盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。
3、方法
在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔，涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计，按阴性处理。
4、注意事项：
a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。
b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。
c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。
2、苯丙氨酸脱氨酶变形杆菌
1、原理：
某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。
2、培养基
酵母膏3g
NaCl 5g
Na2HPO4 1g
DL-苯丙氨酸2g
(或L-苯丙氨酸) 1g
蒸馏水1000 ml
pH为7.0，分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面。
3、试剂
10%(W/V)的FeCl3溶液
大肠杆菌的分离鉴定PPT课件02
结果判定
鲜桃红色或微红色，菌 落中心呈深桃红色
圆形，扁平，边缘整齐， 表面光滑，湿润
二、药敏试验
方法：取一菌种，用灭 菌的接种环致密划线 于琼脂表面（可重复 来回划线），用无菌 镊子，将各种抗菌药 物圆纸片，分别贴于 培养基表面。各片距 离相等，370C，24h 后，观察结果。
药敏结果判定
分离鉴定---麦康凯培养基
原理：在培养基中含有胆盐，可抑制大部分革兰氏阳性菌 的生长，培养基含乳糖，大肠杆菌能分离乳糖，使pH下 降（中性指示剂5.5--7.5，红--黄）形成红色菌落，而沙 门氏菌和志贺氏菌，不能分解乳糖，菌落小且为无色
术式
两试管斜面移植时，左手斜持菌种管 和被接种管，管口相齐，管底放在拇指和食 指间，松动两管棉塞，将管口进行火焰灭菌， 使其靠近火焰，将接种环深入管内，先在无 菌生长的培养基上接触使之冷却，再挑取少 量的细菌后，拉出接种环，立即伸入另一管 斜面培养基上，勿碰到斜面和管壁，直达斜 面底部，从底部开始划曲线，向上到斜面顶 端，管口火焰灭菌，塞好棉塞，接种完毕。 接种环火焰灭菌后，放下接种棒最后在斜面 管壁上注明日期、接种者。置370C，温箱培 养
结果：ຫໍສະໝຸດ Baidu养液不变色----无变化（—）
培养液变为黄色----产 酸（+） 培养液变黄并有气泡----产酸产气（+）
2 硫化氢试验
微生物生理生化鉴定
2021/10/10
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IMViC 试验
IMViC是吲哚试验（indol test）、甲基红试验 （methyl red test）、伏-普试验（Voges-Prokauer test） 和柠檬酸盐试验（citrate test）四个试验的 缩写。这四个试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气肠 杆菌，而且主要是用于水的细菌学检查，因为大肠 杆菌虽非致病菌，但在饮水中若大肠杆菌超过一定 数量则表示受粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在 于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。
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操作步骤
编号：用记号笔在各试管上分别标明培养基名称和所 接种的菌名。
接种：取盛有葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试 管各3支，分别按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种 普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。再将大肠杆 菌和产气肠杆菌分别接种于2支蛋白胨水培养基、2支 葡萄糖蛋白胨水培养基和2支柠檬酸盐斜面培养基中。
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结果观察
糖发酵试验：产酸：指示剂使培养基由紫色（pH6.8）
Baidu Nhomakorabea转变为黄色（pH5.2）；产气：倒置的德汉氏小管内 有气泡产生。
吲哚试验：在培养液中加入乙醚约1 ml，充分振荡，
使吲哚溶于乙醚中。静置片刻，待乙醚层浮于液面后 形成明显的乙醚层，再沿管壁加入吲哚试剂8-10滴。 如有吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色，为阳性反应。
大肠杆菌的生化反应鉴定
大肠杆菌的生化反应鉴定
大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，对人类和动物的肠道具有重要的生理功能。在实验室中，通过对大肠杆菌的生化反应进行鉴定，可以帮助我们了解其特定的生理特征和代谢途径。下面将按照步骤逐步介绍大肠杆菌的生化反应鉴定方法。
第一步：培养大肠杆菌
首先，需要从一个纯培养的大肠杆菌菌落开始。这可以通过在含有适宜营养物质的琼脂平板上接种一小部分细菌样本，并在37°C的恒温箱中培养过夜。
第二步：氧需求测试
大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，对氧的需求具有一定的特征。将大肠杆菌接种到含有牛肉膏和葡萄糖的气体管中，观察细菌生长的情况。如果细菌在管内生长，并形成红色沉淀物，则说明大
肠杆菌是一种兼性厌氧菌；如果细菌只在管的液体上层生长，则说明大肠杆菌是一种兼性好氧菌。
第三步：产气反应测试
大肠杆菌是一种发酵菌，通过产生气体来转化底物。将大肠杆菌接种到含有果糖、葡萄糖、乳糖等碳源的培养基中，观察培养液中是否有气泡产生。如果有气泡产生，则说明大肠杆菌具有相应的发酵酶。
第四步：酸碱反应测试
大肠杆菌的代谢产物可以使培养基的pH值发生变化。将大肠杆菌接种到含有葡萄糖、乳糖等碳源的菌落鉴定培养基上，观察培养基颜色变化。如果培养基变为黄色，则说明大肠杆菌产生酸性代谢产物；如果培养基变为红色或粉红色，则说明大肠杆菌产生碱性代谢产物。
第五步：氧化反应测试
大肠杆菌可以通过氧化代谢来利用一些特定的底
物。将大肠杆菌接种到含有柠檬酸盐、酒石酸等底物的特定培养基上，观察培养液的颜色变化。如果培养液变为蓝色，则说明大肠杆菌产生了相应的酶。
细菌鉴定中常用的生理生化反应
三、主要器材
1. 菌种：大肠杆菌（E. coli）、变形杆菌、枯 草杆菌
2. 培养基 ：淀粉培养基、明胶培养基 3. 试剂 ：碘液、甲基红试剂。 4. 器材 : 试管、小套管、培养皿、接种环、
酒精灯、恒温培养箱
四、操作步骤
（一）淀粉水解试验 1. 标记 ：取淀粉培养基平板1块，在其左右两边分
加标记大肠杆菌、枯草杆菌。 2. 接种：以无菌操作分别接种大肠杆菌、枯草杆
菌至以上各相应试管中。 明胶液化试验 某些细菌能分泌明胶酶分解明胶产生小分子物质，使培养基由凝固状态变成液态。
掌握细菌生化反应试验的基本方法。 了解几种细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。
3. 培养：置28℃培养48～120 h后观察结果。 培养基灭菌时要尽量排尽锅内冷空气，灭菌后要等锅内压力降到零再打开排气阀。
枯草杆菌。 器材 :Baidu Nhomakorabea试管、小套管、培养皿、接种环、酒精灯、恒温培养箱
淀粉水解试验 某些细菌能产生淀粉酶将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再吸收利用。
2. 接种：以无菌操作分别穿剌接种大肠杆菌、枯草杆 标记 ：取淀粉培养基平板1块，在其左右两边分加标记大肠杆菌、枯草杆菌。
coli）、变形杆菌、枯草杆菌 了解几种细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。
五、实验结果
1. 淀粉水解试验结果观察 打开皿盖，滴加 少量碘液于平板上，铺匀，若菌苔周围出无色 透明圈说明淀粉已被水解。透明圈的大小可说 明该菌水解淀粉能力的强弱。
微生物鉴定中常用生理生化试验
微⽣物鉴定中常⽤⽣理⽣化试验
微⽣物常规⽣理⽣化试验
摘要利⽤⼤肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）、铜绿假单
胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和⾦黄⾊葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进⾏淀粉和油脂实验，证明不同微⽣物对各种有机⼤分⼦的⽔解能⼒的不同，从⽽说明不同微⽣物有着不同的酶系统，掌握进⾏微⽣物⼤分⼦⽔解实验的原理和⽅法；使⽤⼤肠杆菌（Escherichia coli）和普通变形杆菌（Proteus vulgaris）进⾏葡萄糖和乳糖发酵试验，了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作⽤，掌握通过糖发酵鉴别不同微⽣物的⽅法；利⽤⼤肠杆菌（Escherichia coli）、产⽓肠杆菌（Enterobacter aerogenes）进⾏吲哚试验和甲基红试验，了解两个实验的反应原理以及在肠道细菌鉴定中的意义和⽅法。
关键词⽣理⽣化⼤分⼦试验糖发酵试验吲哚试验甲基红试验
前⾔微⽣物代谢与其他⽣物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微⽣物代谢重要特
征之⼀，就是代谢类型的多样性，因此使得微⽣物在⾃然界的物质循环中起着重要的作⽤，同时也为⼈类开发利⽤微⽣物资源提供更多的机会与途径。⼈们在微⽣物的分类鉴定⼯作中，常利⽤其⽣理⽣化反应作⽤作为重要依据。
微⽣物对⼤分⼦淀粉、蛋⽩质和脂肪不能直接利⽤，必须靠产⽣的胞外酶将⼤分⼦物质分解才能被微⽣物吸收利⽤。胞外酶主要为⽔解酶，通过加⽔裂解⼤的物质为较⼩的化合物，使其能被运输⾄细胞内，这些过程均可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
大肠杆菌的分离鉴定
整理课件
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结果判定
• 鲜桃红色或微红色，菌 落中心呈深桃红色
• 圆形，扁平，边缘整齐， 表面光滑，湿润
整理课件
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二、药敏试验
方法：取一菌种，用灭 菌的接种环致密划线 于琼脂表面（可重复 来回划线），用无菌 镊子，将各种抗菌药 物圆纸片，分别贴于 培养基表面。各片距 离相等，370C，24h 后，观察结果。
• 结果：再加试剂甲、乙各2滴，在30s内出现红色 即为阳性；若无颜色出现，加少量的锌渣，随后 出现红色，则是真正的红色
整理课件
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大肠杆菌的分离鉴定、药敏实 验及生化实验
整理课件
1
目的要求
• 熟悉鉴别培养基的原理 • 了解大肠杆菌的主要生理生化特性
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一、鉴别培养
菌种 培养基类别
麦康凯培养基
大肠杆菌
红色菌落
沙门氏杆菌
无色或浅黄色菌落
SS琼脂培养基
红色菌落
浅黄色菌落
伊红美兰琼脂培养基
三塘铁培养基
紫红色或紫黑色并带有金 粉红色菌落 属光泽菌落
在培养基中含有胆盐可一直大部分革兰氏阳性菌的生长培养基含乳糖大肠杆菌能分离乳糖使ph下降中性指示剂5575红黄形成红色菌落而沙门氏菌和志贺氏菌不能分解乳糖菌落小且为无色两试管斜面移植时左手斜持菌种管和被将接种琼脂斜面管使管口相齐管底放在拇指和食指间松动两管棉塞将管口进行火焰灭菌使其靠近火焰将接种环深入管内现在无菌生长的培养基上接触使之冷却再挑取少量的细菌后拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上勿碰到斜面和管壁直达斜面底部从底部开始划曲线向上到斜面顶端管口火焰灭菌塞好棉塞接种完毕
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1、氧化酶巴氏杆菌
1、原理：
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
2、试剂
盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。
3、方法
在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔，涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计，按阴性处理。
4、注意事项：
a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。
b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。
c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。
2、苯丙氨酸脱氨酶变形杆菌
1、原理：
某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。
2、培养基
酵母膏3g
NaCl 5g
Na2HPO4 1g
DL-苯丙氨酸2g
(或L-苯丙氨酸) 1g
蒸馏水1000 ml
pH为7.0，分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面。
3、试剂
10%(W/V)的FeCl3溶液
4、方法
适当浓度接种，37℃培养4h或8~24h测定。将试剂4~5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明己形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。
3、H2S(TSI) 变形杆菌鸡白痢沙门氏
1、原理：
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
2、培养基：
牛肉膏7.5g
蛋白胨10g
NaCl 5g
明胶100~120g(或琼脂15g)
10%FeCl2 (培养基灭菌后无菌加入) 5 ml
蒸馏水1000 ml
pH 7.0，112℃灭菌20min
在明胶培养基尚未凝固时，加入新制备的过滤灭菌的FeCl2，用无菌试管分装，培养基高度约为4~5 cm，立即置冷水冷却凝固。
3、方法
用穿刺法接种，30℃培养，1、3、7天，观察，变黑者为阳性，不变为阴性。
4、注意事项
①此方法适用于肠杆菌科细菌鉴定
②在实验过程中可用硫酸亚铁代替氯化亚铁
③可同时测定明胶液化，20℃培养
4、DNA酶金黄色葡萄球菌
1、培养基
酪朊水解物15g
大豆蛋白胨5g
NaCl 5g
DNA 2g
甲苯胺蓝0.1g
琼脂15g
蒸馏水1000 ml
除DNA和甲苯胺蓝之外，加热熔化后调pH至7.2，加入DNA和甲苯胺蓝，混匀后分装，121℃灭菌30 min
2、方法
①将培养基倒平板，点接幼龄种于培养皿上，适温培养2天
②结果观察：在接种部位周围出现粉红色晕圈为阳性，沙雷氏菌可作阳性对照
5、糖、醇发酵实验[乳糖、纤维二糖、D-阿东醇]
1、培养基：
蛋白胨水（pH7.6）100ml
需要的糖(醇)类1g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml （或0.2%溴麝香草酚蓝酒精溶液1.2ml）
制法：
1、将所需糖（醇、苷）1克，加入100ml蛋白胨水中，并按比例加入0.5%~0.7%
琼脂制成半固体培养基，加热溶解。
2、加入1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml （或0.2%溴麝香草酚蓝酒精溶液1.2ml），
摇匀。
3、分装于试管内，10 磅高压灭菌20 分钟，检验备用。
附：蛋白胨水培养基：
蛋白胨1 克氯化钠0.5 克
蒸馏水100ml
1、将以上成份混合，加热溶解，校正pH 至7.4~7.6。
2、过滤、分装试管，每管约3ml。
2、方法：
以18—24h幼龄菌种作种子，穿刺接种，每株2支。同时还要有标准株和不按种管作对照。37℃培养1、3、5天后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝（紫）则为阴性。
6、柠檬酸盐利用试验枯草芽孢杆菌
1、原理：
某些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳的唯一来源和无机磷酸铵作为氨的来源，因此能够在含有上述成分的合成培养基上生长，并且分解柠檬酸盐最后生成碳酸盐，使培养基变为碱性。在指示剂溴麝香草酚蓝溶液的存在下，培养基由绿色变为深蓝色。
2、培养基：Simmons培养基
氯化钠5g
硫酸镁0.2g
磷酸二氢铵1g
磷酸氢二钾1g
柠檬酸钠1g
蒸馏水1000ml
1％溴麝香草酚蓝10ml
琼脂20g
将除琼脂和溴麝香草酚蓝溶液处的各成分溶解后，调pH值为6.8~7.0，加入琼脂融化，再加入溴麝香草酚蓝溶液，分装试管，经121℃灭菌15 min，制成斜面备用。
3、方法
①取待检菌在培养基上先划线再穿刺，37℃培养观察2~4d
②结果判定：阳性者在培养基斜面上生长，并且Simmons培养基由草绿色变为蓝色
7、赖氨酸脱羧酶
1、培养基
蛋白胨5g
酵母膏浸3g
葡萄糖1g
蒸馏水1000 ml
0.2%溴麝香草酚蓝12 ml
待测氨基酸5g
将以上氨基酸和溴麝香草酚蓝溶液外的各种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调pH值至6.8，加入0.2%溴麝香草酚蓝溶液和待测氨基酸。
氨基酸应先溶解于NaOH溶液中，比例为0.5g L-α-赖氨酸+1.5% NaOH溶液0.5ml，再调pH至6.8，分装于小试管内，每管1ml，121℃灭菌10min.
2、方法
用幼龄培养物作为种菌，直针接种于培养基中，上面加一层灭菌的液状石蜡。将试管放在37℃培养4d，每天观察结果。培养液先变黄后又变为蓝色为阳性，黄色者为阴性。