大肠杆菌生理生化鉴定
大肠杆菌
大肠杆菌染色体DNA的复制
大肠杆菌染色体DNA的复制是从染色体的一 个特定位置，即复制起始区（oriC）开始的 双向复制，在环状染色体的相对位置上的 终止区（terC）终止。整个复制过程可划分 为3个阶段：复制的发动，复制叉的延伸和 复制的终止。首先是切口酶在复制起点将 一股超螺旋的DNA切开，在解旋酶的作用下 DNA双螺旋解旋形成一个复制泡，此时切口 被封闭，复制泡的两边各形成一个复制叉。 一个顺时针移动，另一个逆时针移动，在 复制叉处开始DNA的复制。
后随链合成的DNA中大部分是以小段形式存 在的称为冈崎片段。每个冈崎片段都由一 个RNA引物引发。当复制叉延伸到复制终点 时，由DNA聚合酶I除去RNA引物并由DNA添 补缺口，最后由DNA连接酶封闭切口，从而 形成两个与原来完全一样的双链DNA环状分 子。
由于大肠杆菌染色体是环形的，所以两个 复制叉汇合在起点对面距起点180°的终点。 这样一个包括复制起点和终点的独立的复 制单位叫复制子。大肠杆菌只有一个起点 和一个终点，整个染色体为一个复制子。 大肠杆菌染色体的复制速度很快，每分钟 复制105核苷酸，完整染色体在40min内完 成复制，从而为细胞的分裂做好了准备， 保证了遗传物质的稳定性和连续性。
肽聚糖层也分为两层，直至中央会合，形 成由细胞质膜和肽聚糖组成的隔膜。隔膜 完全形成后，两个子细胞分开，完成了一 次细胞分裂。
大肠杆菌DNA的复制方式
遗传信息通过实代DNA分子的复制，从亲代 传递给子代，从而保证了遗传的稳定性。 因此DNA的复制对生物的遗传具有重要的意 义。
双链DNA半保留复制
染色体环状复制
大肠杆菌的染色体为双链环形DNA，总长度为 4.6×106bp，DNA总长度可达1 100～1 400μm。凯恩斯通过精辟的实验证明了大肠杆 菌DNA是以环状方式复制的。首先将大肠杆菌 生长在含[3H]胸腺嘧啶的培养基中，这样在放 射性培养基上生长时所合成的全部DNA都是具 放射性的。培养接近两代时，分离出菌体的完 整DNA，可以从其放射自显影图上看到分枝的 环状图式。后来在有些病毒中也发现了环状复 制。因为复制环的图式象希腊字母θ，故称这 种复制为θ复制。
微生物鉴定中的生理生化试验
微生物鉴定中的生理生化试验一．实验目的1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
4.了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二．实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：1.大分子水解试验微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。
胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH 降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
2. 糖发酵试验糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。
例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。
当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。
实验八微生物生理生化试验
伏－普试验用于测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产 物的能力,如丙酮酸,丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇,此化合 物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的 精氨酸的呱基作用,生成红色化合物,即伏－普试验阳性,不产生红色化 合物为反应阴性,
实验八 微生物生理生化试验
一 实验器材 1 菌种 大肠杆菌,普通变形杆菌,金黄色葡萄球菌,产气肠杆菌 2 培养基 尿素琼脂试管,蛋白胨水培养基,葡萄糖蛋白胨水培养基,葡萄糖发酵管 和乳糖发酵管各3支, 3 溶液和试剂 甲基红指示剂,5％萘酚,乙醚和吲哚试剂 4 仪器和其他用品 接种针
二 目的要求 1 大分子物质水解试验
三 糖发酵试验 1 在发酵管上标明所接种的细菌名称, 2 取葡萄糖发酵管3支,分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌,第三支不接 种,作为对照,另取乳糖发酵管3支,同样操作, 3 将接种和对照的发酵管置37 ℃培养24－48h, 4 观察发酵管的颜色和有无气泡,
各试验需接种的菌种:
1 明胶水解试验：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 20 ℃ 2－5 d
3 尿素试验 1 取2支尿素培养基试管,用记号笔表面各管欲接种的菌名, 2 分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌 两种细菌对尿素的分解速
度不同 ,需要观察2次, 3 将接种后的试管置35 ℃培养24－48h, 4 观察培养基颜色变化, 尿素酶存在时为红色,无尿素酶时为黄色,
二 IMViC试验
1 接种与培养 1 用接种针将大肠杆菌和产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中
温15－30 min,红色为阳性,大肠杆菌阴性,产气肠杆菌阳性
思考题
1. 为什么尿素实验可用于鉴定变性杆菌属 细菌
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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5、甲基红（MR）试验
培养基：葡萄糖蛋白胨水
原理：甲基红试验： 分解葡萄糖产生丙酮酸， 深入分解为甲酸、乙酸、乳酸等使pH下降，含 甲基红指示剂培养基变红
6、VP试验：葡萄糖蛋白胨水
原理：一些菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经 多脱羧、氧化等反应生成二乙酰，其与蛋白胨 中精氨酸胍基作用产生粉红色化合物
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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2.药敏试验：圆纸片扩散法 菌种： 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 培养基：营养琼脂平板 方法：
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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• 3.消毒剂抑菌和杀菌试验 • 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 • 方法：与药敏试验方法是一样（纸片扩散法）
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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（三）理化原因及生物原因对微生物影响
• 1.紫外线与杀菌试验
• 菌种： 大肠杆菌、枯草杆菌
• 方法：取营养琼脂平板2个，一个涂大肠杆菌，另一 个涂枯草杆菌。在其涂有细菌表面贴上以剪出不一 样图案硬纸片，然后在紫外灯下距离30厘米照射20 分钟，照射完成将硬纸片取走盖回原来平皿盖，于 37℃培养24小时观察结果。
• 培养基：葡萄糖高层琼脂、普通琼脂斜面、 水琼脂斜面、氧化-发酵培养基（小生化管）、 普通平板、麦康凯平板、淀粉平板、三糖铁斜 面、各类生化反应管等
• 器械：砂轮、试管架、接种环、接种针、灭 菌吸管、灭菌刻度移液管、灭菌棉签、胶头、 灭菌液体石蜡、酒精灯、废报纸等
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
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3、细菌氧化型与发酵型（O/F）测定
菌种：大肠杆菌、枯草杆菌
培养基：加有葡萄糖和指示剂（1%溴麝香草 酚蓝）微型发酵管
分离鉴定粪便中的大肠杆菌的实验流程
分离鉴定粪便中的大肠杆菌的实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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微生物鉴定中常用的生理生化实验
球菌。
3.将接种后的试管置于20度中培养3~5天。 4.观察明胶液化情况。
穿刺接种
1)手持试管。 2)旋松棉塞。 3)右手拿接种针在火焰上将针 端灼烧灭菌接着把在穿刺中可能伸入 试管的其他部位，也灼烧灭菌； 4)用右手的小指和手掌边拔出 棉塞。接种针先在培养基部分冷却， 再用接种针的针尖沾取少量菌种。 5)将接种过的试管直立于试管 架上，放在37℃或28℃恒温箱中培 养。24h后观察结果 注意：若具有运动能力的细菌， 它能沿着接种线向外运动而弥散， 故 形成的穿刺线较粗而散、反之则 细而密。
运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，这过程可
通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
淀粉遇碘液会产生蓝色，在细菌水 解淀粉的区域，用碘液测定时不再 产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
2.明胶液化试验：
明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状
态，以固体形式存在，而在25℃以上明胶会液化。
(三)、尿素实验
1.取2支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。 3.将接种后的试管置于35°C中培养24~28小时。 4. 观察培养基颜色变化。
（四）、硫化氢试验
1.用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培 养基中。 2.置于37度培养48小时后，观察有无黑色硫化铅的产生。
丙酮酸等，使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
6.柠檬酸盐试验：
柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸是否被利用。
有些细菌利用柠檬酸盐作为碳源；而另一些细菌不能利用柠
檬酸盐，如产气肠杆菌。
大肠杆菌生理生化鉴定
1、氧化酶巴氏杆菌1、原理：氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
2、试剂盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。
3、方法在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔，涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计，按阴性处理。
4、注意事项：a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。
b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。
c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。
2、苯丙氨酸脱氨酶变形杆菌1、原理：某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。
本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。
2、培养基酵母膏3gNaCl 5gNa2HPO4 1gDL-苯丙氨酸2g(或L-苯丙氨酸) 1g蒸馏水1000 mlpH为7.0，分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面。
3、试剂10%(W/V)的FeCl3溶液4、方法适当浓度接种，37℃培养4h或8~24h测定。
将试剂4~5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明己形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。
3、H2S(TSI) 变形杆菌鸡白痢沙门氏1、原理：有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
大肠杆菌的检测方法
大肠杆菌的检测方法大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）是一种常见的细菌，它存在于人和动物的肠道中，同时也是一种重要的指示性微生物，可以用来评估环境和水源的卫生状况。
对大肠杆菌的检测具有重要的意义，可以帮助预防细菌感染和传播，保障公共卫生安全。
现在，我将详细介绍大肠杆菌的检测方法。
大肠杆菌的检测方法主要分为传统培养法和分子生物学方法两大类。
传统培养法是最常用的大肠杆菌检测方法之一。
其基本原理是将样品在含有大肠杆菌生长所需的培养基上孵育，然后观察培养基上是否有典型的大肠杆菌形态和生长特征。
具体步骤如下：1. 准备样品：样品可以是水、食品、环境表面等。
2. 分装样品：将样品分装到培养基培养皿或试管中。
3. 孵育培养：将分装好的样品在适当的温度和时间条件下进行培养，通常是在37摄氏度下孵育24小时，有时也需要采用其他不同的条件。
4. 观察结果：在培养基上观察是否有大肠杆菌形态和生长特征的典型菌落，如红色菌落、金属光泽等。
5. 进一步确认：对观察到的典型菌落进行进一步的生化和生理测试，如大肠杆菌产气试验、甲烷气生成试验等，以确认是否为大肠杆菌。
传统培养法有着较长的检测时间和较低的检测灵敏度，但由于其成本较低且操作简单，仍然是大肠杆菌检测的常用方法。
另一种常用的大肠杆菌检测方法是分子生物学方法。
相对于传统培养法，分子生物学方法具有更高的检测灵敏度和特异性，且检测速度更快。
以下是一些常用的分子生物学方法：1. PCR扩增法：该方法利用特异性引物和酶的作用，通过对大肠杆菌特定基因（如16S rRNA基因）进行扩增，可以检测到极少量的大肠杆菌DNA。
2. 实时荧光PCR法：该方法是PCR扩增法的改进，可以同时进行扩增和检测，通过实时监测荧光信号的产生来判断样品中是否存在大肠杆菌。
3. 基因芯片技术：这种技术利用微阵列芯片，含有大肠杆菌的特异性探针，可同时检测多个基因和多个大肠杆菌菌株。
细菌生理生化鉴定
细菌生理生化鉴定
细菌生理生化鉴定是通过对细菌在特定生理和生化条件下的反应进行观察和分析，以确定其种类和特性的过程。
这通常包括一系列实验，涉及对细菌代谢途径、酶活性、生长条件等方面的研究。
以下是细菌生理生化鉴定的一些常见方法和实验：
1.形态学观察：
形状：观察细菌的形状，可以是球形（球菌）、杆状（杆菌）、螺旋形等。
结构：使用显微镜检查是否有胞壁、胞膜、纤毛、鞭毛等结构。
2.生理特性：
生长条件：观察细菌在不同温度、pH值和氧气条件下的生长情况。
营养需求：测试细菌对不同营养物质（碳源、氮源、矿物质等）的利用能力。
3.生化反应：
大肠杆菌的IMViC测试：Indole（吲哚）测试、Methyl Red（甲基红）测试、V oges-Proskauer（V-P）测试、Citrate（柠檬酸）测试、
4．氧化还原反应：观察细菌对不同氧化还原指示剂（如甲基红、溴亚甲蓝）的反应，推断其对氧化还原条件的适应性。
5.酶活性测试：
氧化酶：使用氧敏感指示剂观察酶的活性。
淀粉酶：利用淀粉琼脂板，观察菌落周围是否发生淀粉分解带。
蛋白酶：使用明胶板检测细菌对蛋白质的分解能力。
6.抗生素敏感性测试：确定细菌对不同抗生素的敏感性，通过纸片扩散法或肉汤稀释法进行。
7.分子生物学方法：16S rRNA测序：通过测序菌株的16S rRNA基因，进行分子水平的种类鉴定。
8.培养基选择：利用特定培养基，如MacConkey琼脂培养大肠杆菌等，根据细菌在培养基上的生长情况进行初步鉴定。
微生物鉴定中常用的生理生化实验
微生物鉴定中常用的生理生化实验摘要：大分子物质水解试验中，将所要检测的菌种（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）接种到淀粉培养基和油脂培养基上，培养一段时间后在淀粉培养基滴上碘液，通过比较透明圈来判断各微生物水解淀粉能力的强弱；观察油脂培养基上是否有红斑点产生来判断微生物是产生脂肪酶。
糖发酵试验中向葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管中各接种大肠杆菌和变形杆菌，并留一空白培养基试管对照。
经过一段时间培养后对试管中的颜色变化和产气情况进行观察。
IMVIC 试验中向蛋白胨培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基中各接种上大肠杆菌和产气杆菌，经过一段时间培养后，向葡萄糖培养基的培养物中滴上甲基红试剂，通过颜色变化来判断微生物生长代谢产物中是否有有机酸产生；向蛋白胨培养基中先加入适量的乙醚后再沿壁加入对二甲基氨基苯甲醛试剂，根据产生红色反应层与否来判断微生物生长代谢中是否有产生吲哚，进而来判断微生物对色氨酸是否有分解能力。
关键词接种无菌操作前言微生物必须依靠包外酶对大分子物质进行水解后才能被其加以利用，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
淀粉遇碘液时显蓝色，当滴有碘液后不显蓝色则说明细菌产生了淀粉酶；脂肪水解后会产生脂肪酸降低培养基的PH值，使培养基中含有的中性红试剂由淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生的有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气。
大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖并产酸产气；变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
当发酵产酸时，培养基试管中的培养液会由紫色转变为黄色，当产气时，试管中的倒置德汉氏小管中会有气泡。
有些细菌能产生分解蛋白胨中色氨酸的色氨酸酶，分解产生吲哚和丙酮酸。
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。
在细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变使加入培养基中的甲基红指示剂变红。
微生物鉴定中常用的生理生化试验
一、实验目的1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5.了解IMViC的原理。
二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。
酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
三、实验材料1.菌种大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn），产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。
大肠菌群测定步骤
食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。
3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。
按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。
等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。
对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。
报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。
大肠杆菌的分离鉴定
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11
斜面和深层均为红色
斜面为红色；深层为黄色； 若产生H2S，为黑色
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3
分离鉴定---麦康凯培养基
• 原理：在培养基中含有胆盐，可抑制大部 分革兰氏阳性菌的生长，培养基含乳糖， 大肠杆菌能分离乳糖，使pH下降（中性指 示剂5.5--7.5，红--黄）形成红色菌落，而 沙门氏菌和志贺氏菌，不能分解乳糖，菌 落小且为无色
大肠杆菌的分离鉴定、药敏实 验及生化实验
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1
目的要求
• 熟悉鉴别培养基的原理 • 了解大肠杆菌的主要生理生化特性
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2
一、鉴别培养
菌种 培养基类别
麦康凯培养基
大肠杆菌
红色菌落
沙门氏杆菌
无色或浅黄色菌落
SS琼脂培养基
红色菌落
浅黄色菌落
伊红美兰琼脂培养基
三塘铁培养基
紫红色或紫黑色并带有金 粉红色菌落 属光泽菌落
在培养基中含有胆盐可一直大部分革兰氏阳性菌的生长培养基含乳糖大肠杆菌能分离乳糖使ph下降中性指示剂5575红黄形成红色菌落而沙门氏菌和志贺氏菌不能分解乳糖菌落小且为无色两试管斜面移植时左手斜持菌种管和被将接种琼脂斜面管使管口相齐管底放在拇指和食指间松动两管棉塞将管口进行火焰灭菌使其靠近火焰将接种环深入管内现在无菌生长的培养基上接触使之冷却再挑取少量的细菌后拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上勿碰到斜面和管壁直达斜面底部从底部开始划曲线向上到斜面顶端管口火焰灭菌塞好棉塞接种完毕
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4
术式
两试管斜面移植时，左手斜持菌种管 和被接种管，管口相齐，管底放在拇指和食 指间，松动两管棉塞，将管口进行火焰灭菌， 使其靠近火焰，将接种环深入管内，先在无 菌生长的培养基上接触使之冷却，再挑取少 量的细菌后，拉出接种环，立即伸入另一管 斜面培养基上，勿碰到斜面和管壁，直达斜 面底部，从底部开始划曲线，向上到斜面顶 端，管口火焰灭菌，塞好棉塞，接种完毕。 接种环火焰灭菌后，放下接种棒最后在斜面 管壁上注明日期、接种者。置370C，温箱培 养
大肠杆菌的测定方法
大肠杆菌的测定方法
致病性大肠杆菌是病原体，它的筛选、鉴定以及测定是病原微生物的重要步骤。
本文将介绍大肠杆菌测定的一般方法，其中包括细菌的培养、鉴定与测定流程。
一、细菌培养
大肠杆菌的培养，首先要选择利于细菌生长的培养基，培养基需要含有必须的养分和活性，具有适宜的pH值，用于维持细菌的生长。
常用的培养基包括牛油硫磺琼脂（MacConkey）、牛油硫磺琼脂（SS agar）、牛油硫磺琼脂棕榈酸（MSA）、牛油硫磺琼脂乳酸（MSL）以及甲氧苄啶琼脂（MMB）等。
培养的大肠杆菌会产生具有细胞膜抗原特性的抗原。
细胞膜抗原可以形成抗原抗体复合物，从而产生免疫反应。
将样本装置在具有合理浓度的抗原抗体复合液中，将有助于调节抗体与抗原的反应，使抗体与抗原之间形成稳定的结合，增强抗体的特异性，同时也可以提高测定的准确性，提高测试的灵敏度。
二、细菌鉴定
通过培养可以初步判断大肠杆菌的类型，但要确定其种类，可以采用血凝试验（血清凝集），该试验可用于识别各种凝集素。
另外，培养过程中产生的生化特性也可以帮助在识别大肠杆菌中发挥作用。
微生物生理生化鉴定
了解细菌生理生化反应原理以及在细 菌鉴定中的重要作用
掌握通过生理生化反应鉴别不同细菌 的基本方法
基本原理
糖发酵试验：是鉴别肠道细菌的常用生化 反应。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳 源和能源，但是它们在分解糖的能力上有 很大的差异，例如大肠杆菌能分解乳糖和 葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌分解葡 萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
甲基红试验
大肠杆菌：+ 产气杆菌： –
阳性 阴性
伏-普试验原理
产气杆菌： V.P.试验阳性 大肠杆菌： V.P.试验阴性
V.P试验
大肠杆菌：– 产气杆菌：+
阳性 阴性
IMViC 试验
柠檬酸盐试验：用来检测细菌利用柠檬酸的 能力。有些细菌能分解柠檬酸形成CO2，由 于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使 pH升高，当用溴麝香草酚蓝作为指示剂时， 培养基颜色发生变化。溴麝香草酚蓝变色范 围为，pH6.0-7.6呈绿色，pH＞7.6时呈蓝色。
糖发酵试验
大肠杆菌：产酸产气
大肠杆菌分解糖类产生多种有机酸，使培养液呈 酸性；产生的甲酸在酸性条件下可进一步裂解生 成H2和CO2
发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂由紫色(pH6.8)变为 黄色(pH5.2)；气体的产生可由倒置的德汗氏小管 中有无气泡来证明。
乳糖发酵试验
大肠杆菌：+ 变形杆菌： –
IMViC 试验
结果观察
柠檬酸盐试验：观察培养基颜色变化，含有 溴麝香草酚蓝的斜面呈蓝色者为阳性反应， 呈绿色者为阴性反应。
H2S试验
IMViC是吲哚试验（indol test）、甲基红试验 （methyl red test）、伏-普试验（Voges-Prokauer test） 和柠檬酸盐试验（citrate test）四个试验的 缩写。这四个试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气肠 杆菌，而且主要是用于水的细菌学检查，因为大肠 杆菌虽非致病菌，但在饮水中若大肠杆菌超过一定 数量则表示受粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在 于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。
实验九微生物生理生化实验
• 2CH3COCOOH
CH3COCHOHCH3十2CO2
丙酮酸
乙酰甲基甲醇
• CH3COCHOHCH3
CH3COCOCH3
乙酰甲基甲醇
NaOH 丁二酮（二乙酰）
具体操作：
❖接种及培养方式如同吲哚实验
❖取出塞子， 加10滴VP试剂，振荡混合后， 置沸水浴中保温，5分钟后观察实验结果。 出现红色这位VP试验阳性。
3. 吲哚（indole）试验：（含氮化合物的 分解利用）
色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚 ↑
吲哚试剂
-+
具体操作：
（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌 于蛋白胨水培养基中。
（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养7d。以未接种 的作为对照（全班1-2支试管即可）。
（3）观察结果时，在培养液中加入乙醚约1毫升（使呈 明显的乙醚层）。充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静 置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入 吲哚试剂10滴。如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色。
具体操作：
（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌BS或 大肠杆菌EC于葡萄糖、蔗糖、乳糖商品化发 酵管中。以未接种的作为对照（全班1-2支试 管即可）。
（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养7d。
（3）观察结果时，看各管颜色变化及小管顶部 有无气泡。产酸产气用“⊕”表示；只产酸不 产气用“+” 表示；不产酸也不产气用“-”表 示。
5 . 石蕊牛乳试验：（利用蛋白质酪素的能力）
牛乳的主要成分为乳糖，蔗糖，蛋白质和酪素等成分。 牛乳中加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原的指示剂 （中性为黄色，酸性为红色，碱性为蓝色，石蕊被还原 时，则部分或全部脱色）。由于各种细菌对牛乳的利用 不同，引起培养基的变化也就不同，主要变化为：
大肠杆菌的鉴定
大肠杆菌的鉴定
大肠杆菌的鉴定可以通过以下步骤进行：
1. 首先进行菌落形态观察：大肠杆菌的菌落多呈灰白色，透明、光滑亮泽、边缘整齐，直径通常为2-3mm。
2.进行生理生化试验：大肠杆菌有多种特殊的生理生化特性，如青霉素酶、酸性等，可以通过对其代谢产物的检测来鉴定。
3.进行免疫学鉴定：使用大肠杆菌的特异免疫学反应的方法来鉴定。
4.进行分子学鉴定：应用PCR技术来分离和鉴定大肠杆菌中的鉴别性基因序列。
以上是大肠杆菌鉴定的基本步骤，可以通过不同方法相结合的方式进行准确鉴定。
细菌生化实验报告
一、实验目的1. 了解细菌生理生化反应的基本原理和实验方法。
2. 掌握常见细菌生理生化反应的检测方法，如糖发酵、吲哚产生、甲基红反应等。
3. 学会通过生理生化反应对细菌进行初步鉴定。
二、实验原理细菌生理生化反应是指细菌在生长繁殖过程中，利用酶催化底物发生的一系列化学反应。
通过检测细菌对特定底物的利用能力、酶的产生以及代谢产物的生成，可以判断细菌的种类和特性。
三、实验材料1. 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌等。
2. 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）、吲哚试剂、甲基红试剂等。
3. 仪器：酒精灯、接种环、培养皿、试管、试管架、滴管等。
四、实验方法1. 糖发酵实验：将待测菌接种于糖发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
观察菌落周围是否出现透明圈，判断细菌是否能发酵该糖。
2. 吲哚产生实验：将待测菌接种于蛋白胨水培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
取培养液滴加吲哚试剂，观察是否产生红色沉淀，判断细菌是否能产生吲哚。
3. 甲基红反应实验：将待测菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
取培养液滴加甲基红试剂，观察颜色变化，判断细菌是否能产生有机酸。
五、实验结果与分析1. 糖发酵实验结果：- 大肠杆菌：葡萄糖发酵阳性，乳糖发酵阴性。
- 金黄色葡萄球菌：葡萄糖发酵阳性，乳糖发酵阴性。
- 枯草芽孢杆菌：葡萄糖发酵阳性，乳糖发酵阴性。
- 变形杆菌：葡萄糖发酵阳性，乳糖发酵阳性。
2. 吲哚产生实验结果：- 大肠杆菌：吲哚产生阴性。
- 金黄色葡萄球菌：吲哚产生阳性。
- 枯草芽孢杆菌：吲哚产生阴性。
- 变形杆菌：吲哚产生阳性。
3. 甲基红反应实验结果：- 大肠杆菌：甲基红反应阴性。
- 金黄色葡萄球菌：甲基红反应阴性。
- 枯草芽孢杆菌：甲基红反应阳性。
- 变形杆菌：甲基红反应阳性。
根据实验结果，我们可以初步判断：- 大肠杆菌为革兰氏阴性菌，发酵葡萄糖，不产生吲哚和有机酸。
大肠杆菌和沙门菌的鉴别
大肠杆菌和沙门菌的鉴别大肠杆菌和沙门菌是常见的细菌之一，它们在细菌学中有着重要的地位。
本文将从鉴别大肠杆菌和沙门菌的角度进行介绍。
大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门菌（Salmonella）都属于革兰氏阴性菌，形态相似，但在生物学特性和致病性上有明显的差异。
鉴别这两种菌的方法主要包括生理生化特性、血清学反应和分子生物学技术。
从生理生化特性上来看，大肠杆菌和沙门菌在某些反应上有一定的差异。
大肠杆菌能够产生大量的酸和气体，而沙门菌则产生的较少。
在发酵乳糖能力上，大肠杆菌产生酸，而沙门菌则无法产生酸。
此外，大肠杆菌对氧和温度的要求较低，能够在无氧条件下生长，而沙门菌则对氧和温度有一定的要求。
血清学反应也是鉴别大肠杆菌和沙门菌的重要方法之一。
大肠杆菌和沙门菌在O抗原、H抗原和Vi抗原等方面有不同的特点。
O抗原是细菌细胞壁上的一种多糖物质，大肠杆菌的O抗原较为单一，而沙门菌的O抗原则较为复杂。
H抗原是细菌鞭毛上的一种蛋白质，大肠杆菌和沙门菌的H抗原也存在差异。
Vi抗原是沙门菌特有的一种抗原，通过Vi抗原的检测可以鉴别沙门菌。
分子生物学技术也被广泛应用于大肠杆菌和沙门菌的鉴别上。
通过PCR扩增特定基因片段，可以检测大肠杆菌和沙门菌的存在与否。
此外，基于DNA序列的比对分析也可以鉴别这两种菌的差异。
需要注意的是，在实验室中鉴别大肠杆菌和沙门菌时，需要严格遵守无菌操作规范，以免造成交叉污染。
同时，应注意使用正确的培养基和培养条件，确保实验结果的准确性。
大肠杆菌和沙门菌在生物学特性和致病性上有明显的差异，通过生理生化特性、血清学反应和分子生物学技术的综合应用，可以准确鉴别这两种菌。
在实际的临床和食品安全检测中，对大肠杆菌和沙门菌的鉴别具有重要的意义，能够为疾病的预防和控制提供有力的支持。
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1、氧化酶巴氏杆菌
1、原理：
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
2、试剂
盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。
3、方法
在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔，涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计，按阴性处理。
4、注意事项：
a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。
b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。
c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。
2、苯丙氨酸脱氨酶变形杆菌
1、原理：
某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。
本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。
2、培养基
酵母膏3g
NaCl 5g
Na2HPO4 1g
DL-苯丙氨酸2g
(或L-苯丙氨酸) 1g
蒸馏水1000 ml
pH为7.0，分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面。
3、试剂
10%(W/V)的FeCl3溶液
4、方法
适当浓度接种，37℃培养4h或8~24h测定。
将试剂4~5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明己形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。
3、H2S(TSI) 变形杆菌鸡白痢沙门氏
1、原理：
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
2、培养基：
牛肉膏7.5g
蛋白胨10g
NaCl 5g
明胶100~120g(或琼脂15g)
10%FeCl2 (培养基灭菌后无菌加入) 5 ml
蒸馏水1000 ml
pH 7.0，112℃灭菌20min
在明胶培养基尚未凝固时，加入新制备的过滤灭菌的FeCl2，用无菌试管分装，培养基高度约为4~5 cm，立即置冷水冷却凝固。
3、方法
用穿刺法接种，30℃培养，1、3、7天，观察，变黑者为阳性，不变为阴性。
4、注意事项
①此方法适用于肠杆菌科细菌鉴定
②在实验过程中可用硫酸亚铁代替氯化亚铁
③可同时测定明胶液化，20℃培养
4、DNA酶金黄色葡萄球菌
1、培养基
酪朊水解物15g
大豆蛋白胨5g
NaCl 5g
DNA 2g
甲苯胺蓝0.1g
琼脂15g
蒸馏水1000 ml
除DNA和甲苯胺蓝之外，加热熔化后调pH至7.2，加入DNA和甲苯胺蓝，混匀后分装，121℃灭菌30 min
2、方法
①将培养基倒平板，点接幼龄种于培养皿上，适温培养2天
②结果观察：在接种部位周围出现粉红色晕圈为阳性，沙雷氏菌可作阳性对照
5、糖、醇发酵实验[乳糖、纤维二糖、D-阿东醇]
1、培养基：
蛋白胨水（pH7.6）100ml
需要的糖(醇)类1g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml （或0.2%溴麝香草酚蓝酒精溶液1.2ml）
制法：
1、将所需糖（醇、苷）1克，加入100ml蛋白胨水中，并按比例加入0.5%~0.7%
琼脂制成半固体培养基，加热溶解。
2、加入1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml （或0.2%溴麝香草酚蓝酒精溶液1.2ml），
摇匀。
3、分装于试管内，10 磅高压灭菌20 分钟，检验备用。
附：蛋白胨水培养基：
蛋白胨1 克氯化钠0.5 克
蒸馏水100ml
1、将以上成份混合，加热溶解，校正pH 至7.4~7.6。
2、过滤、分装试管，每管约3ml。
2、方法：
以18—24h幼龄菌种作种子，穿刺接种，每株2支。
同时还要有标准株和不按种管作对照。
37℃培养1、3、5天后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝（紫）则为阴性。
6、柠檬酸盐利用试验枯草芽孢杆菌
1、原理：
某些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳的唯一来源和无机磷酸铵作为氨的来源，因此能够在含有上述成分的合成培养基上生长，并且分解柠檬酸盐最后生成碳酸盐，使培养基变为碱性。
在指示剂溴麝香草酚蓝溶液的存在下，培养基由绿色变为深蓝色。
2、培养基：Simmons培养基
氯化钠5g
硫酸镁0.2g
磷酸二氢铵1g
磷酸氢二钾1g
柠檬酸钠1g
蒸馏水1000ml
1％溴麝香草酚蓝10ml
琼脂20g
将除琼脂和溴麝香草酚蓝溶液处的各成分溶解后，调pH值为6.8~7.0，加入琼脂融化，再加入溴麝香草酚蓝溶液，分装试管，经121℃灭菌15 min，制成斜面备用。
3、方法
①取待检菌在培养基上先划线再穿刺，37℃培养观察2~4d
②结果判定：阳性者在培养基斜面上生长，并且Simmons培养基由草绿色变为蓝色
7、赖氨酸脱羧酶
1、培养基
蛋白胨5g
酵母膏浸3g
葡萄糖1g
蒸馏水1000 ml
0.2%溴麝香草酚蓝12 ml
待测氨基酸5g
将以上氨基酸和溴麝香草酚蓝溶液外的各种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调pH值至6.8，加入0.2%溴麝香草酚蓝溶液和待测氨基酸。
氨基酸应先溶解于NaOH溶液中，比例为0.5g L-α-赖氨酸+1.5% NaOH溶液0.5ml，再调pH至6.8，分装于小试管内，每管1ml，121℃灭菌10min.
2、方法
用幼龄培养物作为种菌，直针接种于培养基中，上面加一层灭菌的液状石蜡。
将试管放在37℃培养4d，每天观察结果。
培养液先变黄后又变为蓝色为阳性，黄色者为阴性。