线栓法大鼠局灶性脑缺血模型制作要点及进展

#综述#讲座#线栓法大鼠局灶性脑缺血模型制作要点及进展田莹余化霖=摘要>目前认为大脑中动脉(M CA)为临床上缺血性脑损伤的易患部位,故线栓法大鼠局灶性脑缺血模型的制作以大脑中动脉的阻塞(M CA O)为主,并被认为是标准的局灶性脑缺血动物模型。

虽经过多专家学者的努力使得模型制作的方法得到了更新,稳定性得到了提高,但其难度大、影响因素众多、死亡率高等不足之处仍是事实,本文就制作过程中的主要方面和一些关键问题做一综述和探讨。

=关键词>脑缺血线栓法大鼠模型缺血性脑损伤是目前发病率、致残率和死亡率均较高的严重疾病之一。

据统计,我国每年新发脑卒中病例超过200万,其中缺血性脑血管病占80%以上,而大脑中动脉闭塞(middle cerebra l ar tery occlusion,M CA O)占血管闭塞的43%[1],因此建立一种稳定、可重复、损伤小的动物脑缺血模型,对于研究缺血性中风病理机制及治疗评价的研究具有重要价值。

1模型制作的原理及进展在M CA O时,血流的减少量呈现梯度性变化,即靠近梗塞部位的血流量少,远离梗塞部位的血流逐渐增多。

脑组织按损伤的不同可分为梗塞区、半影区和正常脑组织。

如果脑血流不能及时恢复,梗塞及坏死将从梗塞中心向外扩展至半影区[2]。

几十年以来,国内外报道过许多有关制备局灶性脑缺血动物模型的方法,如颞下或经眶入路的开颅机械闭塞法、内皮素-l(ET-1)灌注诱导血管收缩法、化学刺激诱导血栓性闭塞法、杨氏[3]的光化学诱导血栓形成法、微栓子栓塞阻断法等。

1986年K oizum等和1989年Lo ng a等[4-5]分别运用顶端涂胶尼龙线和顶端烫成球形的尼龙线经颈内动脉(ICA)插入,成功地制成了M CA O局灶性脑缺血再灌注模型。

1996年Belayev等以多聚赖氨酸处理尼龙线来提高模型的成功率。

M CAO因其具有不开颅、可重复、损伤小、可复灌、缺血部位恒定、还可在同一脑切片水平进行自身缺血侧与非缺血侧的比较等特点受到了国内外学者的高度重视。

但是,据国外文献报道,此模型制作成功率不高,且模型的神经功能评分变异较大[6]。

鉴于此,在参考大量文献和进行多次预实验后我们对模型制作过程中的一些重要方面进行了探讨。

2动物的选择制作脑缺血模型选用的实验动物有:小鼠、大鼠、蒙古沙土鼠、猫、狗、猪、羊以及灵长类动物猕猴等。

大鼠具有种系内纯性好、同系大鼠间遗传差异小、有超强的抗感染能力和生命力、成本低等优点,而且它的基因与人类的基因有98%的同源性,神经系统发达,其脑血管结构与人类非常相似,血管闭塞后缺血范围恒定、重复性好,所以目前被广泛使用。

2.1鼠种和种系在几种鼠种之间,M arkraf等[7]研究发现基金项目:云南省教育厅基金项目(编号:09Y0163)作者单位:昆明医学院第一附属医院通讯作者:余化霖邮编650032收稿日期2010-12-21F ischer-334大鼠的模型效果最为理想,但因鼠源问题,目前多选用性情温和、生长快、价格便宜的SD大鼠。

2.2鼠龄和体重虽然脑卒中多发生在中老年人群,但是在模拟人类脑血管疾病的发病过程中,专家建议不宜盲目选用老年大鼠制备该模型,除非特别需求,鼠龄选择上仍以250~ 350g的青年健壮为宜,超过该范围的大鼠则不宜选用该模型或需要建立新的实验方法及标准[8]。

3麻醉剂的选择麻醉剂的正确使用可以在同样的手术时间内最大限度地减少对动物生理状态的影响,并可以减少不必要的时间浪费,是实验成功的重要因素。

卜碧淘[9]用W istar-K yot o大鼠对常用的几种麻醉剂进行实验,结果表明戊巴比妥钠腹腔注射对大鼠的生理状况影响最小,仅有轻度降温作用,对大鼠的生理指标(呼吸、肛温、脑温、心电图、动脉血压及血气等)影响最小[10],故在M CA O模型制备的麻醉中,用2%戊巴比妥钠45mg/kg进行大鼠腹腔麻醉效果好。

但是戊巴比妥钠的水溶液不稳定易分解,分解后的溶液毒性较大,因此最好现用现配,或者将配置好的麻药放在冰箱中冷冻保存。

4线栓的制备目前对线栓的材质及其制备并无统一的标准。

材质方面,多选用单股手术尼龙线或优质鱼线。

制备上不外乎对线栓直径长度的选择和对其头端的处理。

4.1线栓的直径及插入的长度线栓直径的选择要根据动物大小而定,动物间体重差异不宜太大。

线栓直径需要和ICA系统的内径相适应才能阻断ICA中栓线周围的血流,最大限度地阻断进入M CA的血流。

辛世萌等[11]的研究结果说明最佳造模方案是大鼠体重250~300g、线长17mm或18mm、线直径0.28mm,以该方案制作的M CA O模型成功率高,重复性好。

徐佳等[12]测量了大脑中动脉起始部与颈内动脉起始部的距离在1.55~1.65cm,与大鼠体重无相关关系。

线栓法制作大鼠M CA O模型的插线深度起码在1.65cm,且1.65~2.00cm是有效安全范围。

4.2线栓头端的处理对线栓头端的处理是为了让阻断更加彻底、可靠,同时减少对血管壁的机械性损伤。

张成英等[13]报告栓线头端球体直径以0.2mm比较适宜,但在实际操作中不易测量。

线栓法的倡导者Ko izumi和Zea L onga均采用4~0单股尼龙线,但依其线栓前端的加工方式不同,从而衍生出两大流派。

K o izumi流派的主要特点是在尼龙线前端的表面覆盖各种化学材料,如硅树脂、多聚赖氨酸等;Zea#256#Journal of Qiqihar U niver sity of M edicin e,2011,Vol.32,No.2Lo ng a流派制作线栓比较简单,就在线栓前端加热烫成一光滑而膨大的球形。

Ho lland[14]认为涂过硅树脂的线头在试验中会存在一些负面影响,如易造成颅内蛛网膜下腔出血(SA H)或尼龙线卡在颈内动脉而难以推进、存在缺血实验偏差。

王耀明等[15]采用固体石蜡经加热熔化后处理线栓,具有很好的一致性,制作非常简便。

L aing等研究认为,覆以硅胶的栓线较头端教烧成光滑圆球的栓线柔软度好,栓塞成功率高,重复性好[16]。

Zar ow等在对比研究中发现:用硅胶涂层的尼龙线比用同样规格的不涂硅胶尼龙线产生的脑梗死体积更稳定,更有利于缺血后再灌注研究。

近年来一些学者将Lo ng a方法进行改进,将4~0的尼龙线烧成小的圆头,浸入0.1%多聚赖氨酸溶液中,然后取出放在60e条件下烤箱中干燥备用,结果全部成功阻塞,出现一致梗死[17]。

目前尽管对线栓头端的处理方法很多,但还没有一种最为标准理想的方法,需要进一步研究探讨。

5手术术前24h禁食、不禁水。

5.1手术部位Ro binson等[18]报道,SD大鼠左右侧大脑中动脉栓塞后蓝斑内的去甲肾上腺素及黑质内的多巴胺水平变化不一样,这种左右半球脑缺血后行为和生化改变是大脑解剖和生理功能不对称的结果。

左侧迷走神经直接分布于心脏,因此可能对心脏功能产生较大的影响,甚至往往会造成血压的波动。

因此,要根据研究的目的确定栓塞的侧别,而不能随意选择一侧,若出于尽量减少脑外影响因素的考虑,做急性大鼠脑缺血实验时建议尽量选择右侧大脑中动脉栓塞[19]。

5.2手术入路早期线栓法采用颈部正中切口,后续的学者亦采用此法并逐步成为经典的手术入路。

该手术入路要经过颌下腺、颈部淋巴结;需要暴露、分离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌、胸骨乳突肌等肌肉;气管、迷走神经、交感神经等需要在手术中分离并保护,因而具有一定的手术难度和风险。

陈春富等[20]则采用由颈部旁侧入路,其优点有:手术视野暴露较充分,易于分离肌肉和血管,特别是深在的翼腭动脉,出血少。

对气管刺激性小,不需要辅助呼吸,从而降低了手术难度和动物死亡率。

5.3插线方式关于插线的方式主要有两种,一种是参考Zea Lo ng a等[6]的方法,从颈外动脉插入,暂时夹闭颈总、颈内,经颈总分叉处进入颈内动脉,封闭大脑中动脉的血流,过程中分离结扎翼腭动脉,可称之为传统法;第二种方法是从颈总分叉处上方剪口插入,直接进入颈内动脉及其颅内段直至大脑前动脉,过程中不结扎翼腭动脉,可称之为改良法。

孙宇等[21]将传统法和改良法做了对比,认为改良线栓法是稳定和可靠的M CA O造模方法。

在线栓法发展史中对翼腭动脉是否结扎有着激烈的争论,形成了结扎派和非结扎派,他们都有自己的证据理由。

早期的线栓法倡导者,如K oizum i和L on-g a都认为翼腭动脉贯穿颅底的分支为基底节区提供侧支血流,因此,要实现大鼠额顶皮层和基底节区的梗死,必须闭塞该动脉。

然而,随着线栓法研究的深入,亦有更多的学者认为无需闭塞翼腭动脉。

王耀明、辛世萌等认为翼腭动脉位置深在,若结扎该动脉,神经肌肉损害严重,引起进食困难,给大鼠造成极大伤害,增加死亡率,故不提倡结扎PP A。

刘亢丁等发现:无论结扎或开放PP A,在梗死体积和神经缺损体征方面无明显差异,而且翼腭动脉结扎后可见颈动脉内的栓线周围有血栓形成,致管腔闭塞,提示在缺血-再灌注研究中不宜结扎该动脉。

因此,我们认为不必强求永久闭塞翼腭动脉,只需暂时闭塞,这可兼顾脑缺血大鼠造模和再灌注研究,同时也明显降低手术难度。

此外,颈总动脉鞘表面有丰富的神经襻,要想不破坏该鞘单独分离颈外动脉是不太现实的,况且从颈外进入的方法还需暂时夹闭颈总、颈内。

所以采用哪种插线的方式要按实验的实际需要及操作者的熟练程度而定。

5.4术后护理术后动物可放入笼中,但仍需监测体温,并注意保暖,可用60W的白炽灯距离大鼠50cm高度持续照射,待清醒后再撤除。

过夜应将室温稳定在25e左右为宜。

另外笼中应保持干燥,没有积水及粉尘、防止动物误吸而窒息。

6制模成功的标志6.1眼球颜色右侧缺血侧眼球发暗灰白,左侧正常侧眼球红色。

6.2主动或被动行为测评如观察自发运动、前肢外展实验、姿势反射、爬行实验、爬绳实验、gr id-w alking、ro ta-rod 等。

评分参照Beder so n、Zea longa[22-23]的五级4分评分方法并改进。

0分:未见神经病学征象,即无神经功能缺损症状;1分:轻微的神经功能缺损,大鼠被提尾悬空时病灶对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直;2分:中度局灶性神经功能缺损,有向瘫痪侧旋转征象,大鼠被提尾悬空时脑缺血对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直;3分:重度局灶性神经功能缺损,有向病灶对侧跌倒征象;4分:无自发活动及意识水平下降。

6.3神经行为功能测试大鼠脑缺血梗死后可能出现神经行为功能的异常,表现为原有习性将发生改变或发生一定程度的功能缺陷。

6.4前庭运动功能测试大鼠脑缺血梗死后前庭功能受损,出现平衡功能失常。

对造模前后大鼠的平衡功能进行量化评分和统计学分析,可补充判断模型制备的成功率和稳定性。

6.5其它方法M emezawa等研究认为可以通过术中脑电图监测判断阻塞成功与否,而Elsaesser研究认为术中双侧激光多普勒血流监测对判断M CA0更敏感,更有效,当血流降到基础值的10%~20%即认为模型制备成功,且可以用来判断是否并发蛛网膜下腔出血SA H。