荧光定量PCR法检测副溶血弧菌tlh和tdh基因的表达差异_陈星

荧光聚合酶链反应检测副溶血弧菌TLH与TDH

一
１材料．
（）标本来源：６１１０例临床标本来自２００６
年６月至８月就诊于杭州市第一人民医院肠道科的急性腹泻患者粪便标本；２（）引物和Ｔｑａ针的设计和合ａｍｎ探成：所有引物和探针均在上海生工生物工程有限公司合成，见表１（）仪器与试剂：Ｂ７０；３ＡＩ３０实时荧光聚合酶链
［］上海市卫生局，１中华医学会上海分会．实验室诊断
［］倪润洲，６赵跃清，宪镛，碱性磷酸酶和癌胚抗孟等．原测定对良恶性腹水鉴别诊断之探讨［］江苏医Ｊ．
药，９３１（）４０４１１９，９８：２－２．
维普资讯 http://www.cqvip.com
检验医学２００７年第２２卷第４期
Ｌｂｒｏｅｉｎ０，ｏ２．Ｎａｏｔｙｄｉ２７Ｖｌ２ｏａｒＭｃｅ０４
腹水中ＣＡ水平低于血清，Ｅ很可能提示血清是这些肿瘤标志物的来源Ｊ。有国外文献报道，、胸腹水患者ＣＡ、类抗原（Ａ）９、Ａ１３的胸Ｅ糖Ｃ１９Ｃ５
对良恶性胸腔积液的诊断价值［］中国基层医药，Ｊ．

荧光定量PCR技术快速检测食品中副溶血弧菌的含量概要

2
副溶血弧菌
◆ 副溶血弧菌是我国沿海地区弧菌性腹泻和食物中
毒的主要致病菌。是食品卫生中水产品、食品微生物检测的主要监测对象。目前食品中副溶血弧菌检测方法主要以国家标准及行业标准为依据,这些方法的检验周期长,受主观影响较多,不能满足食
品卫生快速反应体系的需求。近年来,PCR技术被
广泛应用于本领域。
荧光定量PCR技术快速检测食品中副溶血弧菌的含量
MADE BY：马均治
◆ 食品中致病菌传统检测方法是先采用非选择性和选择性增菌,然后进行分离培养、生化反应和血清学鉴定,检验程序十分繁琐；且肠杆菌科细菌间生化反应多有交叉,一般需4d～7d才能完成,因此传统检测方法在快速、敏感与特异性等方面都有自身局限性。随着分子生物学及分子细菌学发展,荧光定量PCR技术应用为致病菌检测提供一种新的手段。
3
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Biblioteka Baidu
传统PCR 技术仍有不足之处：
◆ 一是不能准确定量
◆ 二是容易产生交叉污染
◆ 三是分析的都是终极产物
6
7
实时荧光定量PCR
◆ 实时荧光定量PCR（real–time fluorogenic quantitative polymerase Chain
Reaction，
RQ–PCR）是在定性PCR 技术基础之上发展起来的
核酸定量技术，即在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析一种方法。该技术不仅实现对

秦皇岛沿海主要海产品副溶血性弧菌及其毒力基因的检测

耐热直接溶血素（，）、耐热直接相关溶血素（，ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅｄｉｒｅｃｔｈｅｍｏｌｙｓｉｎＴＤＨ
ＴＤＨｒｅｌａｔｅｄｈｅｍｏｌｙｓｉｎ
ＴＲＨ）和不耐热直接溶血素（ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ
，），分别由，，ｈｅｍｏｌｙｓｉｎＴＬＨ
ｔｄｈｔｒｈｔｌｈ
基因编码［８］。目前普遍认
率为２０．５％。张淑珍等［７］２０１５年６～８月份检测秦皇岛市山海关区水产品，发现鱼、虾、蟹、贝和软体动
物的副溶血性弧菌的检出率分别为１６．５６％，２７．２７％，２０．４１％，２９．４６％和１０．００％。可见，秦皇岛副溶
血性弧菌污染较为严重，应加强监测。副溶血性弧菌的致病性与其毒力因子溶血素密切相关，主要包括
鱼类和少量贝类，秋季主要为虾蟹类和贝类。４个采样点中，副溶血性弧菌的检出率由高到低依次为：秦皇岛
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
的海港区，昌黎县，北戴河区，山海关区。检出的１５株副溶血弧菌均携带ｔｄｈ和ｔｌｈ毒力基因，说明秦皇岛沿
海主要海产品携带的副溶血性弧菌毒性较强，具有潜在的感染风险。
关键词：海产品；副溶血性弧菌；毒力基因；秦皇岛
基收金通稿项讯日目作期：者：２金河０，１项北女９目科，１副１（技教２项师１授；目范修。编学改主号院稿要：海收Ｃ研２洋到０究１科日８方４学期０向７研０：２：４０水究９１）９产专。１动项２物（１１项养目殖编及号病：害２０防１８控ＨＹ。００Ｅ１；ｍ２ａ０ｉｌ１：８ｐＨｉｇＹｅ０ｏｎ０３２１）９；＠河１北６３省．ｃ自ｏｍ然。科学基金青年科学基

副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立

副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法

的建立

陈刚;邵彪;许蓓蓓;季葛振

【摘要】目的:构建肉制品副溶血性弧菌实时荧光定量PCR的标准阳性模板和检测方法.方法:以副溶血性弧菌toxR基因上特异性片段为目标,设计并合成引物及Taqman探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量

检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性.结果:构建出副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法的标准模板并建立了相应的检测方法,获得的标准曲线方程为:Y=-3.151 lgX+42.86,灵敏度40copies/反应体系,对副溶血性弧菌具有特异性,同时,该方法具有良好的重复性,变异系数小于5％.结论:使用基于Taqman探针

技术的荧光定量PCR检测方法能够对食品中致病性副溶血性弧菌进行快速、简便、准确、高效的定量检测.

【期刊名称】《肉类研究》

【年(卷),期】2012(026)012

【总页数】4页(P8-11)

【关键词】副溶血性弧菌;标准模板;实时荧光定量PCR;Taqman探针

【作者】陈刚;邵彪;许蓓蓓;季葛振

【作者单位】南通市产品质量监督检验所,江苏南通 226011

【正文语种】中文

【中图分类】R117

副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)是一种革兰氏阴性多形态球杆菌，具有嗜盐性，生长在含盐0.5%～8%的环境中[1-2]。副溶血性弧菌可导致食物中毒，会引起急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便等症状，重症型常出现失水、休克，甚至死亡[3-4]。近年来，沿海地区的食物中毒病例中，该菌已成为首要病原[5-8]。食品中的副溶血性弧菌主要来自海产品和含盐分较高的腌肉制品，如海鱼、海虾、海蟹、海蜇、贝类以及腌肉等肉制品中。

人工模拟胃液下副溶血性弧菌的生长异质性研究

摘要

副溶血性弧菌在河口环境中无处不在，在海鲜产品中很常见。副溶血性弧菌引发人们产生腹泻、呕吐、发烧等临床症状，更严重者会出现反应性关节炎、心脏病等，与食用受污染的海鲜有关，特别是牡蛎、三文鱼等未经加工的食品。给人类健康造成了巨大的威胁。为了应对这些疾病的产生，特别是在1990年代，开发了几种免疫分子检测的方法，可以用于快速检测和定量副溶血性弧菌。使用分子生物学的方法区分副溶血性弧菌的临床菌株和环境菌株，准确鉴定和表征海鲜中副溶血性弧菌以及对致病性与非致病性菌株的毒力因子的检测，旨在控制由副溶血性弧菌引起的食品安全进行风险评估。研究主要利用动物感染模型和体外消化系统模拟来探究其感染致病机理，通过人体胃肠道模型来模拟其在胃肠道环境下的耐受性及致病性；为解决食源性致病菌引发的食品安全问题提供了科学依据。因此本文旨在：1）运用体外静态消化模型，研究了50株不同来源的副溶血性弧菌在人工模拟胃液中生长的异质性影响，2）研究了不同来源的副溶血性弧菌的生长变异系数CV值的变化以及对生长异质性的影响，3）进一步从基因角度研究了不同的基因型对表型生长异质性的影响，4）运用流式细胞仪检测致病性副溶血性弧菌的存活状态。本课题研究内容及实验结果如下：

1.人工模拟胃液下副溶血性弧菌生长异质性的研究

目前尚无研究表明，致病性和非致病性副溶血性弧菌在人的环境（如胃液和肠液）中具有生长异质性。tlh基因存在于致病性和非致病性副溶血性弧菌中，而tdh和trh基因仅存在于致病性菌株中。首先应用模拟的人类胃液来探索50株副溶血性弧菌在37°C下的生长变异性。用数学修正Gompertz模型拟合菌株生长曲线，并计算最大比生长速率（μmax），延滞期（LT）及其变异系数（CV）值，比较了致病性和非致病性副溶血性弧菌对模拟人胃液环境下的应激反应。结果表明，经模拟胃液处理后致病性菌株的μmax显著增加（P<0.01），延滞期显著缩短（P<0.05），非致病性菌株的μmax显著增加（P<0.01），延滞期显著延长（P<0.05）。同时，基因型（tlh + / tdh + / trh-）的CV显著增加（P<0.05），表明致病性基因型

两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价

HBV-DNA是指乙型肝炎病毒的DNA，乙型肝炎是一种常见的传染病，严重者可发展为肝硬化和肝癌。对HBV-DNA进行准确快速的检测对于乙型肝炎的预防和治疗非常重要。目前，常用的HBV-DNA检测方法之一就是荧光定量PCR法。本文将对比两种常用的荧光定量PCR

试剂对HBV-DNA的检测效果进行评价，以期为临床实验提供参考依据。

一、试剂介绍

1. 荧光定量PCR试剂A

荧光定量PCR试剂A是一种常用的商业试剂，根据厂家说明书得知，该试剂的检出限

为10 IU/ml，检测范围为10-10^8 IU/ml，重现性良好，适用于临床检测。

二、检测原理

荧光定量PCR是一种利用PCR技术和荧光探针技术相结合的方法，可以对DNA进行高

灵敏度的定量检测。在HBV-DNA检测中，荧光定量PCR试剂会通过特定的引物和探针对乙

型肝炎病毒的DNA进行扩增，并利用荧光信号来定量检测目标DNA的含量。

三、检测结果比较与评价

1. 灵敏度比较

通过对同一份样本分别使用试剂A和试剂B进行检测，发现试剂A的检出限明显低于

试剂B。在实际应用中，对于低水平的HBV-DNA，试剂A的性能表现更为优越，可以更精准地检测出病毒载量较低的患者。

2. 稳定性比较

在长期使用过程中，试剂A和试剂B的稳定性表现出一定的差异。试剂A在不同存储

条件下的试剂稳定性较好，能够保持较长时间的高灵敏度和准确性；而试剂B在长期使用后，可能会出现一定程度的灵敏度下降，需要更频繁地更换试剂批次以保证结果的准确

性。

在进行多次重复检测实验后，发现试剂A和试剂B的重现性表现相当，均具有较好的

多重PCR技术在致病菌检测中的应用进展

多重PCR技术在致病菌检测中的应用进展致病菌污染已成为全球性的公共卫生问题，也是影响食品安全的最主要原因之一，能及

时，准确地检出致病菌是社会发展的需求[1]。传统的微生物培养法是微生物的“金标准”，但

培养法一般需要经过前增菌或增菌、分离培养、生化鉴定及血清学鉴定等几个步骤；整个检

测过程繁琐、耗时长、工作量大,一般需要4～7d才能出检测结果[2-3]。近年来，PCR技术发

展十分迅速,它具有高效、低成本、高灵敏度等优点，其中的多重PCR是通过对PCR技术的改进而建立起来的一种体外扩增技术，是在同一扩增体系中通过加人多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增，具有能一次性检出多种致病菌、灵敏度高、特异性强、快速的优点,并且

随着研究的深入和发展，多重PCR技术在致病菌中的应用领域也越来越广泛[4-5]。

1.多重PCR在致病菌检测的概念和特点

多重PCR是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段

的PCR反应,多重PCR技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域，包括基因敲除分析、突变和多态性分析、定量分析及RNA检测等。利用一次多重PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和极高的实用价值[6]。

多重PCR能一次性检测多种病原微生物或对同一致病原微生物多种分型和毒力，有较强

的高效性、灵敏度；如增菌可在24小时内得出结果，不增菌可在3～5小时内得出结果，自

动化程度高，检出时间短,操作简单，试剂成本相对低，适合检测成组病原微生物[7-8]。

扩增内标在副溶血弧菌多重PCR检测方法中的应用

吕淑霞;祝儒刚;刘月萍;张喆;胡英

【摘要】建立扩增内标存在下同时检测副溶血弧菌tlh基因和trh基因的多重PCR方法.以细菌16SrDNA片段为扩增内标对照(internal amplification control,IAC),副溶血弧菌不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)基因tlh 和相对耐热直接溶血毒素(thermostable related hemolysin,TRH)基因trh为检测基因,设计引物,并优化多重PCR体系.特异性及灵敏度试验结果表明:该多重PCR体系检测致病性副溶血弧菌表现出极好的特异性.纯培养条件下,扩增内标存在时tlh 基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为1.3×102 cfu·mL-1和1.3×103cfu·mL-1;人工污染牡蛎样品,不经富集培养,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为2.6×103 cfu·mL-1和2.6×104 cfu·mL-1:经过6h的富集培养,tlh 基因和trh基因的检测限均能达到2.6×102 cfu·mL-1.该检测体系特异性强、灵敏度高,并且扩增内标的存在可排除PCR检测致病性副溶血弧菌可能导致的假阴性结果,可提高检测的速度和精准度.

【期刊名称】《沈阳农业大学学报》

【年(卷),期】2010(041)006

【总页数】5页(P701-705)

【关键词】扩增内标对照;多重PCR;副溶血弧菌;特异性;灵敏度

【作者】吕淑霞;祝儒刚;刘月萍;张喆;胡英

四种副溶血弧菌总RNA提取方法的比较

经建立起许多 RNA 分离提取的方法，Chomczynski 菌株
tlh
tdh
trh
等(1987)建立的“硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法”(简称 Strains
ATCC33846
+
+
-
“一步法”或 AGPC 法)，其优点是得到非降解 RNA 且 ATCC33847
+
+
-
产量大、纯度高。GIBCOBRL 公司在此基础上研制开 ATCC17802
基因组学与应用生物学 1178 Genomics and Applied Biology
www.genoapplbiol.org DOI: 10.3969/gab.028.001177
达与其致病性和环境适应性之间关系的基础。目前国表 1 6 株副溶血弧菌的基因型内外还没有针对提取副溶血弧菌 RNA 的报道，但已 Table 1 Genetypes of six Vibrio parahaemolyticus strains
发的食物中毒已经成为世界范围内严重的食源性公共卫生问题之一，在日本，由该菌引起的食物中毒占全国食物中毒例数的 20%~30%；我国国家食源性疾病监测网数据显示，沿海省份，副溶血弧菌引起的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经高居微生物食物中毒首位(刘代新等, 2008)。分离提取高质量的 RNA 是研究副溶血弧菌基因表

不同标本因素对荧光定量PCR法测定HBVDNA结果的影响

必须使用专用的真空采血管，不得使用采血管（含肝素锂、促凝剂、ＥＤＴＡＫ２的收集标本，离心后留取血清（血浆）测定
肝素抗凝。含促凝剂、枸橼酸钠的真空真空采血管）由浙江拱东医用塑料厂生ＨＢＶＤＮＡ。
采血管对ＨＢＶＤＮＡ检测结果是否有影产，最终浓度分别为２０１Ｕ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．４．２溶血标本与ＨＢＶＤＮＡ测定取
市传染病医院２００９年ｌ一４月住院的乙同浓度备用。
测ＨＢＶＤＮＡ。
型肝炎患者，每份标本总胆红索均在正１．３．２黄疸标本的制备收集高胆红素１．５统计方法ＨＢＶＤＮＡ含量（拷贝
【中图分类号】Ｒ５１２，６
【文献标志码】Ａ【文章编号】１６７１—０８００（２０１０）０１００３７．０２
乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ的定量检测感染；正常人标本来自体检健康者。早为阴性。血红蛋白测定用ＳＹＳＭＥＸ
１材料与方法
１．３．１溶血标本的制备用无菌注射用同浓度的胆红素标本制备方法及编号同水洗涤正常人（体检健康者）红细胞，离１．４．２，检测其胆红素浓度及ＨＢＶＤＮＡ。

三种荧光定量PCR检测方法比较

定量pcr：以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。

常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：

<1> SYBR Green I 检测模式

SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。其与双链DNA 结合后, 荧光大大增强。因此, SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法,40 个循环。SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通

常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。

<2> 水解探针模式

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端, 而淬灭剂则在3’末端。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman 探针检测的是积累荧光。PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX。

黄弧菌绿弧菌指标

黄弧菌和绿弧菌是两种常见的细菌，它们在医学和生物学研究中都具有重要的意义。以下是它们的指标：

1. 形态特征：黄弧菌（Vibrio fluvialis）为革兰氏阴性杆菌，直杆状，有时呈弯曲形。绿弧菌（Vibrio parahaemolyticus）也为革兰氏阴性杆菌，呈直杆状。

2. 编码基因：黄弧菌含有一些特殊编码基因，如tdh （thermostable direct hemolysin）和trh（thermostable-related hemolysin），这些基因与其产生的胆汁稳定性溶血素有关。绿弧菌常具有tlh（thermolabile hemolysin）编码基因，该基因与其产生的溶血素相关。

3. 病原性：黄弧菌和绿弧菌都是人类和动物的病原菌。黄弧菌引起的疾病主要有水泻病和腹膜炎。绿弧菌引起的疾病主要有副溶血性弧菌肠炎和副溶血性弧菌感染。

4. 分布环境：黄弧菌主要存在于淡水和海水中，尤其是在富含有机物的环境中。绿弧菌存在于海水和海洋沉积物中，也可以在河口、港口等纯净水中存在。

5. 传播途径：黄弧菌主要通过水源或食物的污染传播给人类，尤其是海鲜类食物。绿弧菌则主要通过食用或接触污染的海产品（如生蚝、贝类等）传播给人类。

6. 检测方法：黄弧菌和绿弧菌的检测方法主要包括细菌培养、

PCR检测等。常用的培养基包括TCBS（Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose）琼脂培养基和CHROMagar Vibrio培养基。

以上是黄弧菌和绿弧菌的一些指标，这些指标在细菌学研究和相关领域的实验室诊断中都具有指导意义。

溶血和脂血两种因素对HBV—DNA实时荧光定量PCR方法的影响

作者：于倩杜菁王蓓

来源：《中外医学研究》2015年第06期

【摘要】目的：探讨溶血和脂血这两种因素对HBV-DNA实时荧光定量PCR方法的影响。方法：（1）收集HBV-DNA标本，并依据其浓度划分为Ⅰ水平和Ⅱ水平；需收集HBV-DNA呈阴性、重度的乳糜状脂血标本和正常人标本。把所收集的标本按不同的比例行混合，以制作成极高TG浓度却不同HBV-DNA水平的AⅠ以及AⅡ组；而高TG浓度却不同HBV-DNA水平的BⅠ以及BⅡ组；正常TG浓度HBV-DNA水平却不同的CⅠ以及CⅡ组。而实时荧光定量PCR则呈扩增趋势。（2）收集HBV-DNA标本，每人共需采集3份标本，然后将其中的2份标本在-20 ℃条件下进行冷冻，但是冷冻的时间则不同，然后把所得标本制作成重度溶血DⅠ以及DⅡ组；中度溶血EⅠ组以及EⅡ组；无溶血对照组FⅠ组以及FⅡ组。（3）使用方差对各个检测结果进行分析。结果：浓度不同的脂血和溶血对两种水平的HBV-DNA荧光定量PCR的相关检测结果的影响程度相比，比较差异均无统计学的意义（P>0.05）。结论：溶血和脂血对实时荧光定量PCR检测HBV-DNA均无明显的影响。

【关键词】溶血；脂血； HBV-DNA；实时荧光定量PCR

中图分类号 R44 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2015）6-0058-02

doi：10.14033/ki.cfmr.2015.06.029

临床诊治中所采集的标本是多种多样的，其中主要有脓液、痰、血清、血浆和脑脊液以及各种分泌物等[1]。在临床上，同类型标本的相关性质也可以多种多样，比如，血清标本可分为程度各异的溶血和脂血标本[2]。本研究借助于实时荧光定量PCR方法对程度各异的脂血和溶血标本中的HBV-DNA行全面检测，旨在探讨溶血和脂血这两种因素对HBV-DNA实时荧光定量PCR方法的影响，取得了理想的效果，现报道如下。

两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价

两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价【摘要】

本文比较了两种荧光定量PCR试剂在检测HBV-DNA方面的表现。通过实验方法的详细描述和结果分析，我们发现试剂A在灵敏度和准

确性上表现更优秀，而试剂B在特异性和稳定性方面稍显突出。优缺

点比较表明两种试剂在不同方面各有优劣。临床应用方面，试剂A适

合用于早期诊断，而试剂B在长期监测中更为可靠。结论部分总结了

两种试剂的特点，并展望了未来在HBV-DNA检测领域的发展方向。

研究结果对于临床诊断和治疗具有重要的指导意义，为HBV感染的早期筛查和治疗提供了可靠的检测手段。

【关键词】

荧光定量PCR、HBV-DNA、试剂、比较、评价、引言、研究背景、研究意义、实验方法、结果分析、优缺点比较、临床应用、前景展望、结论、实验总结、研究展望

1. 引言

1.1 研究背景

限制或者大纲中的其他部分。感谢配合！

乙型肝炎病毒（HBV）是一种广泛存在的DNA病毒，是导致肝脏疾病和肝细胞癌的主要病因之一。HBV感染引起的慢性乙型肝炎是全

球范围内的公共卫生问题，严重危害人类健康。目前，临床诊断HBV

感染主要依靠血清标志物的检测，包括HBsAg、HBcAb等，但这些标志物在一些患者身上表现不明显，因此需要直接检测HBV的DNA。荧光定量PCR是一种高灵敏度、高特异性的检测技朧，已广泛应用于HBV-DNA的定量检测。

目前市面上有多种不同品牌的荧光定量PCR试剂可供选择，其检测敏感性、特异性、准确性可能存在差异，因此有必要对不同品牌的试剂进行比较与评价，以确定哪一种试剂更适用于临床实验室的HBV-DNA检测。本研究旨在对比不同荧光定量PCR试剂在检测HBV-DNA时的性能，为临床医生提供更准确、可靠的检测结果，为乙型肝炎的早期诊断和治疗提供更有力的支持。

沿海地区副溶血弧菌的表型及其主要毒力基因分布特征

周向阳;王淑娜;周秀锦;方维焕

【摘要】为了调查浙江沿海地区副溶血弧菌的分布及其携带毒力基因的特征,在舟山、象山、温州三地实地采样385份,包括海水、泥土和水产品等,共分离到副溶血弧菌菌株278份,其中27株为tdh基因阳性,阳性率为9.7%,trh与ureC基因的阳性率分别为22.3%与11.8%,提示浙江沿海地区广泛存在着致病性副溶血弧菌污染.将不同来源副溶血弧菌的tdh和trh基因进行序列测定,进化树分析发现,环境分离株中tdh基因与临床分离株中tdh基因区分为2簇,而环境分离株与临床分离株中trh基因之间却没有明显的差异.研究结果可为浙江沿海地区副溶血弧菌的风险评估提供参考.%To investigate the distribution of virulence genes in V. parahaemolyticus isolates from the marine aquaculture system in the coastal cities in Zhejiang province, a total of 278 V. parahaemolyticus isolates were recovered from 385 samples of seawater,mud and seafoods in Zhoushan,Xianshan and Wenzhou city and then investigated for their hemolytic and urease producing phenotypes,presence of putative virulence genes tdh and trh genes. Twenty-seven isolates(9.7％ )were tdh-positive while sixty-two isolates(22.3％ )and thirty-three

副溶血弧菌毒力基因和保守基因研究进展

对副溶血弧菌的毒力基因及其保守基因的研究现状进行综述,可从分子水平对鉴定副溶血性弧菌和确定菌株的毒力提供参考。

副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)是一种嗜盐性革兰阴性菌,属于弧菌科中的弧菌属,是一种食源性致病菌,主要来源于虾、贝类等海产品。该菌可引起人腹泻、恶心、发烧等典型的胃肠炎反应及食物中毒。随着分子生物学技术的发展和VP全基因组序列测定的完成,使得人们对VP的毒力基因和保守基因序列有了更深入的了解。为了从分子水平对鉴定VP和确定菌株的毒力提供参考,对VP的毒力基因和保守基因研究现状进行综述。

1 VP的毒力基因

1.1 耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin, tdh) tdh编码TDH蛋白,TDH是VP重要的致病因子,分子量为42kDa,等电点为4-5,可表现出溶血活性、细胞毒性、心脏毒性以及致死性等生物学活性。Nishibuchi等[1]通过把tdh基因亚克隆于大肠埃希菌研究发现tdh基因位于1.3kb的HindⅢ片段上,经过对该片段的测序发现,该基因编码一条由165个氨基酸残基组成的成熟蛋白,蛋白序列前24个氨基酸是信号肽序列;又对表型变种和携带tdh基因的VP菌株的核酸序列变种之间的关系进行了审查,结果发现典型的KP阳性菌株携带有tdhl和tdh2 2个染色体基因拷贝,两者的同源性为97.2%,而呈现溶血弱阳性或阴性tdh株只携带1个染色体基因拷贝。将由核酸序列推测的氨基酸序列与tdh1缺失的溶血阳性的菌株经过Edman降解法后得到的蛋白序列比较发现tdh2对溶血现象起主要的作用。另外,从表型阴性株中还克隆到其他2个基因拷贝,这些株当中,除了染色体上有1个单拷贝tdh3外,质粒中也包含有1个基因拷贝tdh4。这2个基因都可以在大肠埃希菌中表达并产生具有溶血活性的TDH。tdh的表达受操纵子ToxRS的调节,该操纵子的过量表达可以使tdh1、tdh2、tdh3、tdh4的表达提高至原来的1.25倍、5.07倍、3.9倍、11.0倍,然而可能由于它们本身启动子基本表达水平上的不