福林_酚试剂法测定蛋白酶活力的条件试验_王福荣
福林酚法测定酿酒白曲酸性蛋白酶活力的条件试验
驰，大米查发酵过多地消耗了淀粉，不利于二米查操作和发酵；二是大水份操作会导致酒寡淡、不醇厚，相对降低了酒中的酸酯含量，严重影响酒的质量；三是即使在流酒方面，也不见得尽是优势，冷季还可以，到了热季，如果因为水份大引起在制品酸败，不仅大米查不流酒，二米查也会因为底皮遭到了破坏，不能正常发酵而少流酒，严重时会直接影响到挑醅期间的生产任务。
所以，低温大水份是汾酒生产中不可取的操作方法。
在汾酒生产过程中，如果说高粱是汾酒的魂的话，那么水份就是汾酒的血液。
在实际生产的各个阶段中，如果能根据季节的变化结合发酵条件的要求把握好水份、合理地利用水份，保证在制品正常发酵，就能掌握生产的主动权，为优质高产提供根本的保证；反之，如果把握不好水份的大小、配比，就会影响在制品的正常发酵，导致出酒的减少和低质。
然而，汾酒生产是个复杂的过程，水份与发酵的关系、水份与发酵过程中微生物变化的关系都很复杂，这就需要我们在实践操作的基础上不断探讨和总结，进一步提高生产中水份利用的合理性，提高酒醅发酵过程的科学性和合理性，以保证汾酒生产的优质高产。
[参考文献][1]汾酒厂工人培训教材（酿酒岗）[Z].山西杏花村汾酒厂编印,1993年3月[2]《赵迎路文选》第一辑[Z].2012蛋白酶是一类能够水解蛋白质肽键的酶总称，以适宜于酶活力的pH ，可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
蛋白酶不仅可以从动植物组织中提取，也可以通过微生物发酵工艺产生。
在酿酒行业中，以霉菌和细菌产生的微生物蛋白酶应用最广，其次是酵母和放线菌。
由于生产工艺的特殊性，芝麻香型白酒在生产上应用最多的蛋白酶是河内白曲产生的酸性蛋白酶。
它能在较低的pH 条件下，依然保持较高的酶活性，并有效水解蛋白质，促进酿酒原料颗粒物质的溶解，其代谢产物氨基酸不仅是酿酒酵母生长过程中最好的营养物质和发酵促进剂，也是生成白酒香味成分的前提物质[4-5]。
白曲中酸性蛋白酶活力的高低对酿酒过程中的应用有一定的指导意义，同时也是白曲用量的主要参考依据之一。
三种消化酶测定
三种消化酶测定蛋白酶活力的测定[目的与原理]掌握蛋白酶活力的测定方法，测定鱼、虾、贝等水产动物主要消化器官肝胰脏、胃、肠等蛋白酶的活力。
动物消化器官内含有各种消化腺，这些消化腺分泌消化酶进行化学性消化作用，将机体摄入的大分子营养物质转变为可溶性小分子物质而吸收进入血液循环。
本实验采用福林—酚法测定机体内主要消化酶—蛋白酶活力。
福林—酚试剂（Folinphenol）在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物。
蛋白质中含有酚基的氨基酸包括（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福林－酚试剂成蓝色反应，可从蓝色的深浅测知酶活力多少。
[试剂与器材]试剂：1、福林试剂：在2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2 H2O）100g，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g，水700ml，35％磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10小时，然后加人硫酸锂50g，水50ml和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸15分钟，以除去多余的溴。
溶液呈金黄色，冷却后，定容至1000ml，过滤，滤液即福林试剂（试剂不应呈绿色，否则需重配）。
置于棕色瓶中保存，使用时用氢氧化钠标定，稀释至1N。
2、0.55M碳酸钠溶液3、10％三氯乙酸4、0.02M pH7.5磷酸缓冲液：0.02M 磷酸氢二钠溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O 3.561g (或Na2HPO412H2O 7.164g)，溶解于1L蒸馏水中。
0.02M 磷酸二氢钠溶液的配制：取NaH2PO4 H2O 2.76g (或NaH2PO4 2H2O 3.121g)，溶解于1L蒸馏水中。
将0.02M 磷酸氢二钠溶液84ml与0.02M 磷酸二氢钠溶液16ml 混合，即为0.02M pH7.5磷酸缓冲液。
5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5N NaOH 1ml湿润。
蛋白酶活性的测定方法
精品文档蛋白酶活性的测定方法（GB/T23527-2009）1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。
磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林 - 酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。
由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。
利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备2.1 分析天平：精度 0.0001g2.2 恒温水浴：精度土 0.2 C2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计：精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（ 80%-90%）1 0 .6g, 加水溶解并定容至 1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70% 16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液 8ml, 加乙液 1ml, 摇匀，稀释一倍，即成 0.05mol/L 乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（ Na2HPO3.12H2O）6.02 和磷酸二氢钠（ NaH2PO3.2H2O） 0.5g, 加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液（pH=10.5）适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g, 加水溶解并定容至 1000ml。
乙液：称取氢氧化钠 4.0g, 加水溶解并定容至 1000ml. 使用溶液：取甲液500ml, 加乙液 400ml, 摇匀，用水稀释至 1L。
3.4 0.4mol/L 碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠 42.4g, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml.3.5 0.4mol/L 的三氯醋酸液：准确称取 65.4 三氯醋酸, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml3.6 0.5mol/L 的 NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml 酪素溶液称取酪素 1.000g, 准确至 0.001g, 用少量的 0.5mol/L 的氢氧化钠溶液（若为酸性蛋白酶则用浓乳酸 2-3 滴）润湿,, 加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中 , 用适宜的缓冲液稀释至刻度 , 此溶液在冰箱内贮存 , 有效期为三天 .3.8 100卩g/ml酪氨酸标准溶液3.8.1准确称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸 60ml 溶解后定容至 100ml, 即为 1.00mg/ml 的酪氨酸溶液 .精品文档3.8.2 吸取 1.00mg/ml 酪氨酸标准溶液 10.00ml, 用 0.1mol/L 盐酸定容至100ml,即得100.0卩g/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取 1.000g 固体酶或移取 1ml 液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研 , 然后将上清液倒入 100ml 容量瓶, 沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次 , 最后全部移入容量瓶 , 稀释到刻度 , 用四层纱布过滤。
Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。
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一、实验目的1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。
2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。
二、实验原理Folin-酚反应是利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。
为了提高该反应的敏感度，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应。
1、双缩脲反应：在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。
由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。
即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。
2、Folin-酚显色反应：蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。
即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。
三、材料与方法：以流程图示意1、材料：①样品：健康人的血清（稀释300倍）②试剂：牛血清蛋白标准液（200μg/ml ）、碱性的硫酸铜溶液、蒸馏水、Folin-酚试剂③仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头2① 取6支试管编号1~6，按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min 。
表格 1 Folin-酚试剂定量蛋白质实验步骤② 往6支试管中分别加入Folin-酚试剂0.20ml ，在2s 内立即混匀。
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。
磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。
由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。
利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备2.1 分析天平：精度0.0001g2.2 恒温水浴：精度±0.2℃2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计: 精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。
3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。
蛋白酶活力的测定
实验三蛋白酶活力的测定一、目的掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。
二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。
三、试剂及仪器1．福林—酚试剂称取50g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。
使用时用2倍体积的水稀释。
2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。
3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。
4．2%酪蛋白溶液称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。
5．pH7.2磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)，用水溶解稀释至1000mL；0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)，用水溶解稀释至1000mL；pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。
6．标准酪氨酸溶液：准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。
7．仪器：分光光度计、试管四、操作步骤1．标准曲线绘制标准酪氨酸溶液(mL)[100 g/mL]稀释酪氨酸溶液浓度(g/mL)在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g 数，即为K 值。
蛋白酶酶活的测定方法(福林法)
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
福林酚法测蛋白
福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：(1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。
FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。
此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。
【仪器与用具】试管若干；刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套(带橡胶管)；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl 1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。
【试剂】NA2WO4·2H2O；NA2MoO4·2H2O；85％H3PO4；浓HCl；LI2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；NA2CO3；NAOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。
所用试剂均为化学纯或分析纯。
【方法】1试剂的配制(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4％碳酸钠(NA2CO3)溶液与0.2Mol／L氢氧化钠(NAOH)溶液等比例混合(2％NA2CO3，01Mol NAOH)；B液：1％硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5％CuSO4·5H2O，0.1％酒石酸钾钠)。
在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。
此为FolIn—酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(NA2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(NA2MoO4·2H2O)25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml 的圆底烧瓶中。
凝乳酶蛋白酶活力测定
【原理】：采用福林-酚试剂法测定酶的蛋白水解活力。
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
凝乳酶都具有一定的特异性，其特异性要通过凝乳活力/蛋白活力的比值体现。
【实验器材】：①试剂：pH=7.2和pH=6.4的磷酸缓冲液、1.2%的酪素溶液、0.44mol/L的三氯乙酸溶液、0.55mol/L的Na2CO3溶液、Folin试剂②器材：72型分光光度计【实验步骤】：一、溶液的配制（1）pH=7.2磷酸缓冲液的配制准确称取NaH2PO4·2H2O31.2g用蒸馏水定容到1L，配成0.2mol/L甲液。
称取Na2HPO4·12H2O71.63g用蒸馏水定容到1L，成0.2mol/L的乙液。
将甲液与乙液按28：72的比例混匀，用pH计校正到7.2后，加入等量体积的去离子水即配成1.0mol/L的pH=7.2的磷酸缓冲液。
（2）1.2%的酪素溶液的配制精确称取干酪素12g，用0.1mol/L的NaOH溶液50ml，在水浴加热溶解，用1.0mol/L的pH=7.2的磷酸缓冲液定容到1L，不用时放入4℃冰箱，防止染菌变质。
（3）0.44mol/L的三氯乙酸溶液的配制称取三氯乙酸72g，用去离子水定容到1L。
（4）0.55mol/L的Na2CO3溶液的配制称取无水Na2CO358.3g，用去离子水定容到1L。
（5）Folin试剂的配制（6）酪氨酸溶液的配制准确称取0.1g酪氨酸，定容到1L，配成100mg/L的酪氨酸标准溶液。
福林酚法测定蛋白酶活力原理
福林酚法测定蛋白酶活力原理1. 什么是福林酚法？福林酚法，这个名字听上去有点复杂，但其实就是一种测定蛋白酶活力的办法。
简单来说，它就像是蛋白酶的“测谎仪”，用来告诉我们这些酶到底有多能干。
要理解这个方法，我们先得知道什么是蛋白酶。
蛋白酶，顾名思义，就是能把蛋白质搞得七零八落的“拆家伙”。
它们在生物体内的作用可大了，像是消化酶，它们的“工作”就是分解我们吃下去的食物中的蛋白质。
2. 福林酚法的工作原理2.1 准备材料好，咱们先说说准备工作。
你得有几个“主角”，分别是蛋白质底物、蛋白酶、福林酚试剂和氢氧化钠。
底物就是我们用来测试的“蛋白质样品”，而福林酚试剂则是测定结果的“显色剂”。
氢氧化钠用来调整酸碱度，确保反应顺利进行。
2.2 反应过程这个过程就像是做菜一样。
首先，把蛋白质底物和蛋白酶混合，放在一定温度下孵育一段时间。
这时候，蛋白酶开始“拆解”蛋白质了。
接下来，加入福林酚试剂，它会和被分解出来的小分子反应，变成有颜色的化合物。
颜色的深浅，就像是菜的颜色一样，直接反映了反应的程度。
然后，我们用光度计来测量这个颜色，颜色越深，说明蛋白酶的活力越强。
3. 数据分析和结果解读3.1 数据分析有了测量数据后，我们得拿出计算器了。
通过比色计测得的光吸收值，可以告诉我们有多少蛋白质被分解了。
这时候，咱们要把这些数据代入标准曲线中，得出最终的结果。
标准曲线就像是我们的“食谱”，按照它来判断蛋白酶的活力高低。
3.2 结果解读结果解读这一步就像是看天气预报一样。
通过分析，我们可以知道蛋白酶的活力究竟如何。
如果蛋白酶的活力高，那说明它的“拆家”能力强；如果低，那可能就是“效率不高”了。
这样，我们就能了解蛋白酶的实际情况，为后续的实验提供依据。
4. 实际应用福林酚法可不仅仅是在实验室里用得上，它在很多领域都有实际应用。
比如，在制药行业，它能帮助我们评估药物的效果；在食品工业，它可以帮助检测食品中的酶活性，确保食品的质量。
蛋白质的定量测定――福林酚法(Folin―酚试剂法)
蛋白质的定量测定――福林酚法(Folin―酚试剂法)实验原理Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。
以后在生物化学领域得到广泛的应用。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
凡干扰双缩脲反应的基团，如 -CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响还要大得多。
此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。
本法可测定范围是25—250μg蛋白质。
试剂和器材一、试剂Folin—酚试剂:试剂甲：1) 4%碳酸钠溶液2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液3) 1%硫酸铜溶液4) 2%酒石酸钾钠溶液。
临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。
（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。
然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。
此试剂临用前配制，一天内有效。
试剂乙：称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。
充分混匀，使其溶解。
小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。
蛋白酶活力福林测定法
分别称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H2O)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5 g，加水溶解并定 容至1 OOO mL。 3.7.2 乳酸钠缓冲液（pH3.0）
取乳酸(80%～90%) 4.71 g和乳酸钠（70%）0.89 g，加水至900 mL，搅拌至均匀。用乳酸或乳酸钠 调整pH到3.0±0.05，定容至1 000mL。 3.7.3 硼酸缓冲溶液（pH10.5）
c) 利用回归方程，计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量(µg)，即为吸光常数 K 值。其 K 值应在 95～ 100 范围内。如不符合，需重新配制试剂，进行试验。
注：L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
4.2 样品的测定
4.2.1待测酶液的制备 称取蛋白酶样品1.0g，精确至0.0001 g。加入80mL相应缓冲溶液，搅拌溶解不少于30min，随后转
加酶液1.00 mL, 40℃±0.2℃，2 min
加三氯乙酸2.00mL(摇匀)
加酪蛋白溶液1.00 mL(摇匀)
40℃±0.2℃,10 min
加酪蛋白溶液1.00 mL(摇匀)
加三氯乙酸2.00 mL(摇匀)
取出静止10 min，过滤（慢速定性滤纸）
取l.00 mL滤液，加入碳酸钠溶液5.0 mL，福林使用溶液1.0 mL，40℃±0.2℃，显色20 min
Tirs 缓冲液 （pH=8.5）
称取6.06g 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇（Tris碱）于800mL水中，充分溶解后， 1mol/L盐酸溶液调节pH至8.5溶0.05，再加水定容至1000 mL。
3.8 底物溶液（10.0 g/L） 称取蛋白酶制剂专用酪蛋白底物1.000 g，精确到0.001 g，加入相应的缓冲溶液约80 mL，在沸水
福林-酚测定蛋白质
应用生化设计实验论文学院：漓江学院专业：生物技术组员： 吴玉芳 200913007010陆艺中 200913007009指导老师:刘晓灿2011年10月23日广西师范大学福林-酚试剂法测定鸡蛋中的酪蛋白含量吴玉芳,陆艺中摘要:本实验采用福林-酚试剂分光光度法测定鸡蛋中酪蛋白的含量。
试样用PH4.6乙酸钠缓冲液0.2mol/L将酪蛋白从鸡蛋细胞破碎液中分离出来,用体积比为1:1的乙醇、乙醚混合液提取,再用95%乙醇来将酪蛋白粗制品中的脂类杂质除去,在表面皿上摊开除去乙醚后即为酪蛋白纯品。
将酩蛋白纯品溶于蒸馏水后,取1ml样液先加入试剂甲，混合后于室温下放置10min，再加入试剂乙，混匀。
室温下反应30min，于500nm波长下测定其密度。
以牛血清蛋白标准溶液(250ug/ml)为标样,取6支试管将其进行梯度稀释后,各加入5ml试剂甲，混合后于室温下放置10min，再加入试剂乙，混匀。
室温下反应30min，于500nm波长下测定其密度，以OD500为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线,得曲线方程为y=0.2x+0.233。
从标准曲线查出1ml样品酪蛋白的含量为2.185mg。
计算出每100g鸡蛋中酪蛋白含量为43.70mg，从而对人体营养摄取进行指导。
关键词:酪蛋白、定量测定、福林酚试剂法、深蓝色复合物、标准曲线福林—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。
此后在生物化学领域得到广泛的应用。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即福林—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
福林—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
酪蛋白目前主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素与微量元素高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有VD 参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收。
生化实验：Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
试剂乙
深蓝色
(Folin试剂)
实验步骤
1．样品的稀释：准确取血清0.1ml (擦 慢 吹) ，置
于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，倒置摇匀。 2．取玻璃试管7支，
表1 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定血清蛋白质含量的测定步骤
3
实验结果
1 各管吸光值记录 2 制作标准曲线（坐标纸做，贴于实验报
Folin-酚试剂法（Lowry法）测 定蛋白质浓度
1
实验目的
1. 掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理及操作。 2. 掌握标准曲线的制作方法。
实验原理
碱性铜试剂 试剂甲
蛋白质（肽键）
铜-蛋白质络合物（双缩脲反应）
-CO-NH-
紫红色
铜-蛋白质络合物（酪氨酸，色氨酸）
磷钼酸-磷钨酸
磷钼蓝 + 磷钨蓝
标注于图中 文字说明：利用标准曲线求得待测蛋白浓度值
3 利用公式法求出待测蛋白浓度
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实验讨论与分析 实验结论 思考题：绘制标准曲线的意义及制作注
意事项？
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