HPLCDADQTOFMS在线筛选鉴定牛蒡中的抗氧化成分

HPLC-DAD-Q-TOF-MS在线筛选鉴定牛蒡中的抗氧化成分郑振佳1，张瑞凌2，张敏敏2，邱志常1，张斌1，乔旭光1,*（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安 271018；2.齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东济南 250014）摘 要：建立高效液相色谱-飞行时间质谱联用在线筛选并鉴定牛蒡提取物中抗氧化活性成分的方法。

样品经在线色谱柱分离后进行分流，一路与稳定的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼-甲醇溶液混合，实现在线筛选自由基清除剂；另一路进入二极管阵列检测器-串联三重四极杆飞行时间质谱，用于化合物的快速鉴别。

负离子模式下，通过高分辨率质谱获得的相对分子质量结合化合物的紫外吸收特征，参考相关文献和部分对照品验证，从牛蒡乙酸乙酯相中筛选并鉴定出咖啡酸及衍生物19 种。

本方法可实现快速定向筛选和鉴定食品及中药等复杂体系中的抗氧化活性成分。

关键词：牛蒡；抗氧化；在线筛选；鉴定；高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联三重四极杆飞行时间质谱On-line Screening for and Identification of Antioxidant Compounds from Burdock Roots (Arctium lappa L.) by High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass SpectrometryZHENG Zhenjia1, ZHANG Ruiling2, ZHANG Minmin2, QIU Zhichang1, ZHANG Bin1, QIAO Xuguang1,*(1. Key Laboratory of Food Processing Technology and Quality Control in Shandong Province,College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China;2. Shandong Analysis and Test Center, Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology,Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250014, China) Abstract: A new method based on high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-DAD-Q-TOF-MS) was developed for the rapid screening for and identification of antioxidant compounds in burdock root extract. The sample was divided into two parts by the first HPLC; one part flowed through the second HPLC with the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) solution for on-line screening for the antioxidants; the other was flowed through DAD-Q-TOF-MS for on-line rapid identification. Caffeic acid and its 18 derivatives were identified by their relative molecular masses as determined by high resolution MS in the negative ion mode and by comparison of their UV absorption characteristics with literature data and reference standards. Overall, this method is a powerful tool for rapid screening for and identification of antioxidant compounds from complicated systems such as foods and Chinese traditional medicinal materials.Keywords: burdock (Arctium lappa L.); antioxidant compounds; on-line screening; identification; HPLC-DAD-Q-TOF-MS DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180201-014中图分类号：O657.72；TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2019）08-0175-05引文格式：郑振佳, 张瑞凌, 张敏敏, 等. HPLC-DAD-Q-TOF-MS在线筛选鉴定牛蒡中的抗氧化成分[J]. 食品科学, 2019, 40(8): 175-179. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180201-014. ZHENG Zhenjia, ZHANG Ruiling, ZHANG Minmin, et al. On-line screening for and identification of antioxidant compounds from burdock roots (Arctium lappa L.) by high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Food Science, 2019, 40(8): 175-179. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180201-014. 收稿日期：2018-02-01基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201503142）；国家自然科学基金青年科学基金项目（21506119）；郭兰萍泰山学者岗位平台；山东省2017年度农业重大应用技术创新项目第一作者简介：郑振佳（1985—）（ORCID: 0000-0003-3663-6273），男，副教授，博士，研究方向为天然产物化学。

E-mail: pengyou-jia@*通信作者简介：乔旭光（1965—）（ORCID: 0000-0002-7113-1345），男，教授，博士，研究方向为园产品加工与贮藏工程。

E-mail: xgqiao@牛蒡（Arctium lappa L.）为菊科两年生草本植物，《本草纲目》记载其“久服轻身耐老”[1]，现代研究证明牛蒡具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤、降血糖等活性[2-4]，对高血压、糖尿病、动脉硬化等疾病具有治疗作用[5-7]。

牛蒡提取物具有很好的抗氧化作用，可以有效清除自由基、提高超氧化物歧化酶活性、抑制脂质体和蛋白质的氧化损伤并与VE形成协同作用增强抗氧化性[8-13]。

牛蒡中具有抗氧化活性的化合物主要为咖啡酰奎宁酸类和黄酮类化合物，其中咖啡酰奎宁酸类化合物的报道远多于黄酮，是牛蒡中主要的次级代谢产物[14-17]。

咖啡酰奎宁酸类化合物属于咖啡酸的衍生物，主要存在牛蒡乙酯相中，该化合物具有明显的抗氧化作用[18-19]，对氧化应激引起的缺血性损伤、肝细胞脂质过氧化和胰岛素抵抗等症状具有明显改善作用[20-23]，是牛蒡中最重要的一类活性成分。

先前的研究通过高效液相色谱-质谱联用对牛蒡中该成分进行分析[24-25]，分析过程仅依据分子质量进行推断，并未经对照品进行验证，因此鉴定结果的准确性有待于进一步考证。

基于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）模型建立的高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱法已成为天然产物研究中抗氧化活性成分筛选的重要方法之一[26-29]，样品中的抗氧化活性成分与DPPH-甲醇溶液反应后进入紫外检测器，由于自由基的清除导致在517 nm波长处在线检测形成负峰。

通过DPPH模型中出现的负吸收峰结合化合物的紫外吸收和精准分子质量，可以快速、定向和准确鉴定样品中的抗氧化成分。

本研究以牛蒡提取物的乙酸乙酯相为研究对象，基于DPPH筛选模型建立高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联三重四极杆飞行时间质谱（high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC-DAD-Q-TOF-MS）在线筛选鉴别自由基清除剂的方法对牛蒡中天然抗氧化活性成分进行快速筛选和鉴定，为食品及中药等复杂体系中抗氧化活性成分的筛选提供技术参考。

1 材料与方法1.1 材料与试剂牛蒡购于江苏沛县轶伟食品有限公司，经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为菊科植物牛蒡（Arctium lappa L.）的根，品种为柳川理想。

DPPH 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）瑞士Oceanpak公司；纯净水娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备1260 HPLC仪（配置DAD）、G6520A Q-TOF-MS （配置电子电离源）美国安捷伦公司。

1.3 方法1.3.1 供试品溶液及DPPH-甲醇溶液制备牛蒡干燥粉碎后过80 目筛，称取2.0 g牛蒡样品，100 mL 50%乙醇溶液回流提取30 min，抽滤后低压浓缩至无明显醇味后用纯水定容至10 mL，依次用3 倍体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取相蒸干，分别用50%乙腈溶液定容至2 mL，过0.45 μm有机滤膜，备用。

准确称取DPPH标准品，配制成浓度为6×10－5 mol/L 甲醇溶液，置于4 ℃冰箱中避光保存，现配现用。