pH区带逆流色谱技1
逆流色谱技术1
分离机理
• TR=V[(1+(K-1)SF]Fc • • • • • TR—保留时间 V—柱体积 K—被分离组分的分配系数 SF—固定相保留率 Fc—流动相流速
逆流色谱的溶剂系统 卤代烷-水系列 烷烃-水系列 乙酸乙酯-水 非水相系列 双水相系列
卤代烷系列
氯仿 - 0.2mol/L磷酸钾缓冲液 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 0.5%盐酸 氯仿 - 甲醇 - 1％乙酸 氯仿 - 甲醇 - 0.5%乙酸 氯仿 - 甲醇 - 0.5%氢溴酸 氯仿 - 甲醇 - 正丁醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 正丙醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 异丙醇 - 水 氯仿 - 甲醇 - 异丁醇 - 水 氯仿 - 苯 - 甲醇 - 水 四氯化碳 - 甲醇 - 水 四氯化碳 - 甲醇 - 水 四氯化碳 - 氯仿 - 甲醇 - 水 四氯化碳 - 二氯甲烷 - 甲醇 - 水 二氯甲烷 - 甲醇 - 水 二氯甲烷 - 己烷 - 甲醇 - 水 二氯甲烷 - 己烷 - 甲醇 - 水 二氯甲烷 - 己烷 - 甲醇 - 水
的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，
此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂反复进行着混 合和静置的分配过程。流动相不断穿过固定相，随流 动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配 系数的大小次序被依次洗脱。
逆流色谱
逆流色谱基础
• 逆流色谱仪器体系
1) 重力作用 2) 流体静力学平衡体系 (HSES) 特征：a) 由一系列腔体或小室组成 b) 一个旋转轴，离心力恒定 3) 流体动力学平衡体系 (HDSE) 特征：a) 缠绕的聚四氟乙烯管 b) 两个旋转轴，离心力可变
逆流色谱基础
• 逆流色谱的基本色谱理论
CCC是一种特殊的液相色谱技术，利用特殊的 色谱柱实现液态固定相的有效保留。作为一种 色谱技术，遵循基本的色谱塔板数理论和经典 的色谱公式。
甲醇，正丙醇 ，异丙醇 甲酸，乙酸
高速逆流色谱
• 洗脱方式 1) 等度洗脱 2) 梯度洗脱
a) 三元溶剂体系 b) 多元溶剂体系
3) 双向洗脱
高速逆流色谱
• 检测 1) 紫外-可见光检测器 2) 蒸发光散射检测器 3) 傅里叶红外光谱检测器 4) 薄层色谱检测器 5) 质谱检测器
高速逆流色谱
• 优点
高速逆流色谱
• 简介
高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography, HSCCC)是20世纪80年代，由Ito教授研究和发展起来的一 种现代色谱分离制备技术，HSCCC建立在一种特殊的流体 动力学平衡基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的 不对称离心力场，实现两相溶剂体系的充分保留和有效混 合及分配，从而实现物质在两相溶剂中的高效分离。
1) 两相的界面张力 2) 比重差 3) 输液管的口径 4) 分离管的材料
液滴逆流层析
• 装置：三部分组成 1) 输液部分：微型泵、贮液槽、进样器 2) 分离管部分 3) 样品收集部分：检测器、自动收集仪 • 应用实例 柴胡皂苷a, d (C-16羟基端基异构体) 人参皂苷的分离 • 与逆流分配比较：优点
pH区带精制逆流色谱法在中药成分分离中的应用-上海中医药杂志社
·８ ８ ·
Ａ Ｃ Ｔ ＡＵＮＩ Ｖ Ｅ ＲＳ Ｉ Ｔ Ａ Ｔ Ｉ ＳＴ ＲＡ Ｄ Ｉ Ｔ Ｉ ＯＮＩ ＳＭＥ Ｄ Ｉ Ｃ Ａ Ｌ Ｉ ＳＳ Ｉ ＮＥ ＮＳ Ｉ ＳＰ ＨＡ ＲＭＡ Ｃ ＯＬ ＯＧ Ｉ Ａ Ｅ ＱＵＥＳ ＨＡ ＮＧ ＨＡ Ｉ Ｖ ｏ ｌ ． ３ ０Ｎｏ ． ２Ｍａ ｒ ． ， ２ ０ １ ６
［ ８ ］
不同配比， 以不同浓度的三乙胺和甲酸或盐酸分别 ０ ０ｍ ｇ 夹竹桃提取物中分 作为保留碱和洗脱酸， 从２ ７ｍ ｇ３ 马 蹄 叶 碱、 ２ ２ｍ ｇ异 利 血 平 灵 和 离得到 １ α
１ ５ ］ ４ ０ｍ ｇ 利血皮林碱 ［ 。
采用溶剂体系氯仿 －醇 －水和石油醚 －乙酸 乙酯 －正丁醇 －水也可以 达 到 很 好 的 分 离 效 果。 采用溶剂体系氯仿 － 甲醇 － 水（ ４ʒ ３ʒ ３ ） ， 有机相中 加入 ５ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ三 乙 胺 作 为 保 留 碱， 水相中加入 ６ ０ｍ ｍ ｏ ｌ ／ ＬＨ Ｃ ｌ 作为洗脱酸， 从 １ｇ 的黄连粗提物中 提取分离得到 ５ ． ４ｍ ｇ 非洲防己碱、 ６ ． １ｍ ｇ 药根碱、 ５ ８ ． ３ｍ ｇ 黄连碱、 ２ ５ ． ６ｍ ｇ 巴马丁和 ５ ０ ３ ． ９ｍ ｇ 黄连
别加入 １ ０ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 氨 水、 １ ５ｍ ｍ ｏ ｌ ／ ＬＮ ａ Ｃ Ｏ ２ ３ 和 １ ５ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｎ ａ Ｈ Ｃ Ｏ ， 分别对掌叶大黄的粗提物进行 ３ 分离， 从１ ． ２ ５ｇ 、 １ ． ５ ３ｇ 、 １ ． ４ １ｇ 的三份粗提物中共 分离得到 ０ ． ７ｇ 大黄酸、 ０ ． ８ １ｇ 大黄素、 ０ ． ４ １ｇ 芦荟 大黄素和 ０ ． ９ ４ｇ大 黄 酚， 纯度分别可达 ９ ９ ． ０ ％、 ９ ８ ． ５ ％、 ９ ８ ． ２ ％和 ９ ７ ． ８ ％。丹参多酚酸 Ｂ具有抑制 抗动脉粥样硬化的炎症反应
pH区带精制逆流色谱制备钩吻素子工艺参数的研究
２４ ５
福建 医科 大学学报
２ １ 年 ８月 第 ４ ０１ ５卷第 ４期
ｐ Ｈ区带精制逆流色谱制备钩 吻素子工艺参数的研究
苏燕评ｈ ，郑 宓 。 ，俞 昌喜
摘 要 ： 目的 研 究 ｐ 区 带 精 制 逆 流 色谱 制 备 钩 吻 素 子 的 工 艺 参 数 。 方 法 在 选 定 的 溶 剂 体 系 下 ， 用 Ｈ 采
试 剂有 限公 司市售 分析 纯 。
收稿 日期 ： ０ １０－２ ２ １－５１ 基金项 目： ． １ 福建省改革与发展 委员会产 业技术开 发项 目［ 闽发改
度为 １ ｍｏ Ｌ作为流动相 ， ０ｍ ｌ ／ 分别超声 ３ ｉ， ０ｍ ｎ 备
Ｎ ＯＨ至 ｐ １氯仿萃取 ３次， ａ Ｈ １， 合并氯仿层 ， 减压
蒸干得 钩 吻总生 物碱 ２ ４ｇ９。 ． ［ ］
１２２ Ｈ Ｌ ．． Ｐ Ｃ分析钩吻素子对照品 制备１ ｇ ｍ ／Ｌ ｍ 的钩吻素子对照品贮备液并进行 ＨＰ Ｃ分析 ， Ｌ 色谱
逆流色谱技术
消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失， 在实验中只要调整好分离条件，一般都有离效果的因素
1. 固定相的保留值
在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的 一个重要因素，高保留量将会大大改进峰分离度。（仪器 因素和溶剂系统因素）
二、两相溶剂的选择
经典溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己 烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和 正丁醇-甲醇-水等
二、两相溶剂的选择
乙酸乙酯:水（1：1）
大部分目标化合物集中在上相
乙酸乙酯:乙醇:水
化合物的分配比得到了改善，但 是化合物的分离时间又过长
正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:5:5:5) 正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:5:7) 正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:6:6)
日本学者Ito等首先在日本，随后在美国的国家 医学科学研究院发现了一种有趣的现象：不互 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小口径管子里能 在重力场的作用下实现物质在两相溶剂间的连 续分配。而当螺旋管柱在一离心力场内转动时， 随着转速的增加，两相溶剂的混合程度，分配 效率，管柱的利用率及物质在固定相的保留值 也随之增加。如果把待分离样品从管子的入口 引入，连续分配传递过程就会在管柱里进行， 从而实现连续的液一液分配分离，并由此设计 制造了多种逆流色谱仪。
液滴逆流色谱仪
DCCC仪器的工作原理示意 a. 上行方式；b. 下行方式 1．储液器；2泵；3．样品室；4分离管柱；5．收集器
离心式DCCC的工作原理示意图
旋转腔室逆流色谱仪示意图
回旋腔室逆流色谱示意图
－
环绕螺旋管离心分离仪
同步螺旋管行星式逆流色谱
高速逆流色谱
高速逆流色谱(HSCCC)是一种液 -液色谱分离技术，它的固定相 和流动相都是液体，没有不可 逆吸附，具有样品无损失、无 污染、高效、快速和大制备量 分离等优点。由于HSCCC与传统 的分离纯化方法相比具有明显 的优点，因此己被广泛应用于 中药成分分离、保健食品、天 然产物化学、有机合成、环境 分析等领域。
逆流色谱技术
•
当一切包括检测器基线都稳定时，该柱系统即准备就绪，可以
进样了。
二、基本步骤
3. 样品溶液的准备和进样 • 样品混合物可溶解在分离所用的溶剂体系中制备 成样品溶液。当样品量较小时，可以将样品溶解在 流动相中。 • 当样品量较大时，可以将样品溶解在相同体积的 上相和下相中。 • 逆流色谱对样品的要求不高，甚至允许有悬浮物 的样品溶液进入； • 进样体积可以达到柱体积的10－15％。
二、基本步骤
1. 溶剂系统的准备 分离的溶剂系统，应该满足以下要求： • 不造成样品的分解与变性； • 足够高的样品溶解度；
• 样品在系统中合适的分配系数值；
• 固定相能实现足够高的保留。
二、基本步骤
2. 柱系统的准备 首先在仪器不旋转的状态下，以较高的流速将固定相注入螺旋 管柱内；此时可同时开启检测器预热； • • 注满固定相后，停泵。然后使仪器以选定的转速开始转动； 将流动相以合适的流速泵入柱内，直到流动相开始流出，此时 说明柱体系已达到平衡；
二、基本步骤
4. 洗脱方式
• 等比例洗脱
• 阶跃梯度洗脱
• 梯ห้องสมุดไป่ตู้洗脱
•
•
双向洗脱
清洗柱体
二、基本步骤
5. 检测器
• 紫外-可见光检测器
• 蒸发光散射检测器
• 质谱检测器
三、特点
1、没有固体载体 • 空心管代替了填料柱； 相应地，溶剂体系选择代替了分离柱选择。 由于不用固体支撑体，避免了样品在分离 过程的不可逆吸附、分解等可能的样品变 性问题。
一、基本原理
一、基本原理
以A螺旋管为例，在内 侧，两个离心力方向相 反，这样离心力使得两 相液体混合，就像分液 漏斗的摇匀。在外侧， 两个离心力同向，这样 离心力使得两相液体分 离，就相当于分液漏斗 静止分层。这样的分离 混合每分钟可达1400多次。
逆流色谱的技术-2013
半制备型逆流色谱法分离番茄红素
Chromatogram of the crude extract from marigold petal by preparative HSCCC. Solvent system: n-hexanedichloromethane-acetonitrile (10:3.5:6.5/v:v:v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: 800 rpm; sample:200 mg dissolved in 20 ml lower phase; retention of the stationary phase: 62.5%. Peak:5. lycopene
五、用途广，适应能力强
原则上，凡能进行萃取分离的体系，都能 用逆流色谱法分离
几乎任何互不相溶的两相溶剂系统都可以 使用，只是有的溶剂体系可能在一些特殊 型号的HSCCC仪器上可以取得更好的分离 效果。因此，可以通过改变溶剂体系的极
性，实现对不同极性物质的分离。
六、有制备能力
全球科学工作者正为之努力； 已有几个方案；
二、收率高
理论收率为 100％
滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱 方式予以完全回收
三、高效能
单个物质的基线分离
粗样可以直接上样而不会对柱子造成任何 损害；柱子可以用合适的溶剂（如甲醇） 很容易地清洗，然后注入新的溶剂后构成
新的柱体，重复使用。
四、工作条件温和
基本上是常温低压（液体定量泵 的压力）的液相操作
基本两相溶剂系统
辅助溶剂
非极性或弱极性物质 正庚(己)烷－甲醇
逆流色谱技术
操作复杂，需要高电压和特殊缓冲液。
03 逆流色谱技术的优势与局 限性
优势
分离条件温和
逆流色谱技术的分离条件相对温和，可以 避免一些对温度、压力敏感的化合物的分 解和变性。
高分离效率
逆流色谱技术采用连续分离的原理，可以 在一次分离过程中获得高纯度的产品，具 有较高的分离效率。
节约试剂
由于逆流色谱技术采用流动相作为分离介 质，不需要使用大量的固定相，因此可以 大大节约试剂成本。
工作原理
原理
基于液液分配平衡的原理，利用不同 组分在两相溶剂中的分配系数不同实 现分离。
过程
将两相溶剂在旋转的分离柱中连续流 动，样品注入其中，各组分因分配系 数差异在两相间进行反复分配，从而 实现分离。
应用领域
生物医药
用于分离和纯化生物活性物质 、药物中间体和药物成分等。
天然产物
用于分离和纯化植物、动物和 微生物中的次生代谢产物，如 色素、香精油、生物碱等。
食品中营养成分的分离
逆流色谱技术可用于分离食品中的营养成分，如脂肪酸、维生素、矿物质等，有 助于了解食品的营养价值和功能。
食品添加剂的检测
逆流色谱技术可以用于检测食品中的添加剂，如色素、防腐剂等，保障食品的安 全性和质量。
在其他领域的应用
环境样品的分析
逆流色谱技术可以用于分离环境样品 中的污染物和有害物质，如重金属、 农药残留等，有助于环境监测和污染 控制。
原理
利用物质在固定相上的吸附能力差异实现物质的分离。
应用
适用于分离具有不同吸附能力的物质，如黄酮类、皂苷类等。
优点
分离效果好，分离范围广。
缺点
固定相的制备较为困难，且重现性较差。
逆流电泳法
《逆流色谱技术》课件
广泛应用
在中药、生物医药、食品添加剂 等领域，逆流色谱技术被广泛应 用于天然产物的分离和纯化。
在药物分离中的应用
药物分离
逆流色谱技术在药物分离中具有重要作用，能 够分离和纯化药物中的有效成分。
药物质量控制
该技术可用于药物质量控制，确保药物的有效 性和安全性。
药物研发
逆流色谱技术还可用于药物研发，帮助研究人员发现新的药物候选物。
逆流色谱技术的应用范围
01
逆流色谱技术在生物医药领域应用广泛，可用于分离纯化蛋白 质、酶、核酸等生物大分子。
02
此外，逆流色谱技术在天然产物提取、食品分析、环境监测等
领域也有广泛应用。
由于逆流色谱技术具有分离效率高、样品回收率高、操作简便
03
等优点，因此在科研和工业生产中得到了广泛应用。
02
逆流色谱技术的分类
原理
基于溶质在固定相和流动相之间的水动力学 作用进行分离。
优点
分离效果好，可实现连续分离。
应用
适用于分离和纯化大分子化合物，如DNA、 RNA和蛋白质等。
缺点
操作条件较为严格，有时需要大量有机溶剂 。
03
逆流色谱技术的实验设备
分离柱
分离柱是逆流色谱技术中的核心部件，其作用是提供固定相和流动相的相 对运动，从而实现混合物的分离。
素。
03
泵的性能参数如流量、压力等对分离效果有很大影响，需 要精确控制。
检测器
检测器的作用是检测和记录 分离过程中各组分的浓度变
化。
常用的检测器有紫外可见光 检测器、荧光检测器、电导 检测器等。选择合适的检测 器需要考虑被分离物质的性
质和检测灵敏度。
检测器的性能参数如检测限 、线性范围等对分离效果有 很大影响，需要合理选择和 使用。
化学分离中的逆流色谱法原理
化学分离中的逆流色谱法原理化学分离是化学分析、工业生产等领域中的一个重要过程，其中，色谱法作为一种常用的分离技术，其原理和应用也备受关注。
在色谱法中，逆流色谱法作为一种高效、准确的分离技术备受推崇。
本文将详细讲解逆流色谱法的原理和应用。
一、逆流色谱法的概念逆流色谱法是一种速度较快、分离效果良好的体积计数法，适用于分离中小分子有机化合物和离子。
其原理是将流动相（溶液）通过逆流器后，在固定相（色谱柱）与流动相的作用下，溶液中的样品分子与固定相发生相互作用，使样品分子在色谱柱中发生分离，最后从出口处依次流出。
二、逆流色谱法的基本原理逆流色谱法的基本原理可以分为三大部分：逆流器、色谱柱、检测器。
（一）逆流器逆流器主要是利用多级电离器、离子对撞机等离子体设备对样品分子进行离子化，然后通过溶液进行循环，并利用固体捕获物质将其在离子源中分离，从而实现样品分子的准确分离。
它的主要作用是将样品分子与溶液分离，达到分离提纯的效果。
（二）色谱柱色谱柱是逆流色谱法中最为重要的一部分，其主要作用是分离各种组分及其含量。
其分离过程主要是通过化学亲和力异常及矩阵材料的物理吸附、化学反应来实现的。
从而实现最终样品的分离。
色谱柱的种类很多，不同的柱子有着不同的分离效率和特点。
（三）检测器检测器通常是用来对色谱柱中的有机物和离子物质进行检测，常用的方法有滴定法、荧光法、紫外-可见吸收法、电导率法、荧光差动压力法等。
其中，紫外-可见吸收法检测结果较为准确，受到广泛应用。
三、逆流色谱法的应用（一）分离样品逆流色谱法可以分离出样品中的不同组分，达到分离提纯的目的。
比如，如果在样品中含有多种不同的氨基酸或者蛋白质等杂质，逆流色谱法可以将其分离出来，提炼出目标化合物。
（二）制备纯度高的化合物逆流色谱法不仅能够分离出类似结构的分子，而且还可以提高目标化合物的纯度，降低不纯物质的含量。
因此，其在制备优质、纯度高的化合物上得到广泛应用。
（三）药物分析逆流色谱法在药物分析方面得到了广泛应用。
逆流色谱操作实验报告
一、实验目的1. 熟悉逆流色谱的基本原理和操作方法；2. 学会利用逆流色谱技术对混合物进行分离纯化；3. 了解逆流色谱在中药成分分离中的应用。
二、实验原理逆流色谱是一种液-液分配色谱技术，利用液体固定相和流动相之间的分配系数差异，实现混合物中各组分的有效分离。
实验中，将待分离的混合物加入固定相中，通过改变流动相的组成，使各组分在两相之间发生逆流分配，从而实现分离。
三、实验材料1. 仪器：逆流色谱仪、色谱柱、离心机、微量注射器、容量瓶、移液管等；2. 试剂：固定相、流动相、待分离混合物等；3. 药品：中药样品、分析纯试剂等。
四、实验步骤1. 调节逆流色谱仪，将色谱柱固定在离心机上进行操作；2. 准备固定相和流动相，根据实验要求配制不同浓度的流动相；3. 将待分离混合物加入固定相中，调整固定相的体积，使其充满色谱柱；4. 开启离心机，使色谱柱产生离心力，使固定相和流动相分离；5. 根据实验要求，逐渐改变流动相的组成，使各组分在两相之间发生逆流分配；6. 收集各组分，进行检测和分析。
五、实验结果与分析1. 实验过程中，观察色谱柱中固定相和流动相的分离情况，记录各组分分离时间；2. 根据分离时间，分析各组分在两相之间的分配系数差异，判断分离效果；3. 对分离得到的各组分进行检测和分析，确定其纯度和含量。
六、实验讨论1. 逆流色谱操作过程中，固定相和流动相的选择对分离效果有很大影响。
实验中，应根据待分离混合物的性质和实验要求，选择合适的固定相和流动相；2. 实验过程中，离心机的转速和温度对分离效果也有一定影响。
应根据实验要求调整离心机参数，以获得最佳分离效果；3. 逆流色谱在中药成分分离中具有广泛的应用前景。
实验结果表明，逆流色谱可以有效地对中药样品中的活性成分进行分离纯化，为中药现代化研究提供有力支持。
七、实验总结本次实验成功地将逆流色谱技术应用于混合物的分离纯化，掌握了逆流色谱的基本原理和操作方法。
实验结果表明，逆流色谱在中药成分分离中具有广泛的应用前景，为中药现代化研究提供了有力支持。
pH区带逆流色谱技1
影响分离效果的因素
流动相流速
逆流色谱转速
固定相保留值和转速的关系（见图3）
编号 1 至 3 依次表示转速为 400r/min、600r/min、800r/min, 4表示转速前 600r/min，然后调速至 800r/min的情况。 由图 3 可知，转速越大，保留值越高，分离效果 越好。但是情况 3和情况4 的保留值比较接近，所 以在通常的实验中普遍采用的都是情况 4， 这样既 能保证固定相保留值，也能使仪器不必要长时间在 800r/min 以上高速运转，同时也避免了由于高速旋 转造成的乳化。
同样，若被分离的样品是碱类如生物碱等，也可以碱为保留剂，酸为取代剂，进 行pH区带逆流色谱分离。此外，也可以选择下相溶剂为固定相，上相溶剂为 流动相，因此，pH区带逆流色谱扩大了逆流色谱的应用范围，提高了样品的进样 量，可进行制备性的样品分离，在氨基酸及其衍生物、多肽、氧杂葱染料、生物 碱、多酚和异黄酮类等化合物的分离方面得到应用。如用正丁醇：0．03tool三氟 乙酸 逆流色谱也可以用于有机酸对映体的分离，1一甲基一4一甲氧甲基环己基甲酸的 两个异构体由于立体位阻效应不同使酸性产生差异(图5)，从而得到分离。
溶剂组成
根据色谱分辨率的计算公式：计算上述a、b、c图的分辨率依次为 0.9814， 1.4150 和 2.0120 溶剂系统中水的体积含量始终占 50%， 正丁醇的含量代表 了系统的极性， 含量高， 极性大， 含量低， 极性小,分辨率与正丁醇含量 （ 极性） 的关系如图 所示
进样量
由图6可知，只要在逆流色谱的处理范围内， 进样量越大，重叠率越小，分离效果越好，这 是因为在ph区带逆流色谱中，流出物的浓度主 要有洗脱酸（碱）的浓度决定。
保留碱 或酸 的作用是在溶质区前面将溶质从流动相转移 到固定相中 洗脱酸 或碱 的作用是在溶质区后面将溶质 从固定相转移到流动相中 当存在多种较大量的溶质时 具 有最大= pka 值和亲水性的溶质首先流出柱子 依此类推 并以不同溶质区ph 值 的 降 低( 或 升 高 )为 标 志 达 到 分 离 目 的(见图2)
pH区带逆流色谱法分离纯化丹参中的丹酚酸B和迷迭香酸
pH区带逆流色谱法分离纯化丹参中的丹酚酸B和迷迭香酸李怀志;宫成玉;李云;杨鹏;李佳;王晓【摘要】采用pH区带精制逆流色谱技术(pH-ZRCCC)快速分离纯化丹参中的丹酚酸B和迷迭香酸.以乙酸乙酯-水(1∶1,V/V)为溶剂体系,上相加入三氟乙酸,使浓度达到10 mmol/L,作为固定相;下相加入氨水使浓度达到20 mmol/L,作为流动相;设置主机转速为850 r/min,流速为2.0 mL/min,检测波长为280 nm,对样品进行分离制备.从500 mg丹参粗提物中一次分离得到386 mg丹酚酸B以及25 mg 迷迭香酸,经HPLC分析纯度分别为96.3％和98.1％,各化合物通过电喷雾电离(ESI)谱和1H-NMR进行了化学结构鉴定.研究结果表明,pH-ZRCCC是一种快速、高效分离纯化丹酚酸B和迷迭香酸的方法.【期刊名称】《山东科学》【年(卷),期】2016(029)003【总页数】5页(P13-17)【关键词】pH区带逆流色谱;丹酚酸B;迷迭香酸【作者】李怀志;宫成玉;李云;杨鹏;李佳;王晓【作者单位】山东中医药大学药学院,山东济南250355;山东省中药质量控制技术重点实验室,山东省分析测试中心,山东济南250014;烟台出入境检验检疫局,山东烟台264000;山东中医药大学药学院,山东济南250355;山东省中药质量控制技术重点实验室,山东省分析测试中心,山东济南250014;济南三峰生物工程有限责任公司,山东济南250014;山东中医药大学药学院,山东济南250355;山东省中药质量控制技术重点实验室,山东省分析测试中心,山东济南250014【正文语种】中文【中图分类】R284.2丹参药材来源于唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根和根茎，是临床常用中药，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦以及凉血消痈等功效[1]。
丹酚酸B是丹参水溶性物质中的主要成分，在丹参酚酸类成分中含量最高。
pH区带精制逆流色谱法制备青风藤碱
pH区带精制逆流色谱法制备青风藤碱董红敬;张永清;庄会永;李佳;耿岩玲;王晓【摘要】We employed pH-zone refining counter-current chromatography to prepare high-purity sinoacutine from Stephania kwangsiensis. Its solvent system was composed of petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water （3 ： 7： 1 ： 9, V/V）, in which triethylamine （ 10 mmol/L） was added to the upper organic stationary phase as a retainer and hydrochloric acid （10 mmol/L） was added to the aqueous mobile phase as an eluter. The structure of sinoautine was identified by ESI-MS,1H NMR and 13C NMR. The purity of sinoacutine determined by RP-HPLC was 99.5%. This approach has such advantages as high-efficiency and high-purity, suitable for the preparation of large amount of sinoacutine.%采用pH区带精制逆流色谱法从广西地不容中制备青风藤碱，溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（3：7：1：9，V／V），上相加10mmol／L三乙胺为固定相，下相加10mmol／L 盐酸为流动相。
pH区带精制逆流色谱法分离制备黄藤中巴马汀和药根碱
pH区带精制逆流色谱法分离制备黄藤中巴马汀和药根碱井凤;耿岩玲;刘伟;段文娟;王岱杰;王晓【期刊名称】《天然产物研究与开发》【年(卷),期】2016(028)012【摘要】建立了黄藤生物碱快速分离制备的pH区带精制逆流色谱方法.采用95％乙醇加热回流提取制备黄藤生物碱粗提物,利用pH区带精制逆流色谱法对生物碱粗提物进行直接分离制备,以氯仿-甲醇-水(4∶3∶3)为溶剂系统,下相添加三乙胺(10 mmol/L)为流动相,上相加盐酸(40 mmol/L)作为固定相,在主机转速800 rpm,流动相流速2 mL/min,检测波长254 nm条件下进行分离制备.从1.5g黄藤提取物中一次分离得到231.6 mg药根碱和436.8 mg巴马汀,纯度均大于98％.化合物通过MS、1H NMR和13C NMR进行了结构鉴定.pH区带精制逆流色谱法是一种快速高效的分离纯化黄藤生物碱的方法.【总页数】4页(P1943-1946)【作者】井凤;耿岩玲;刘伟;段文娟;王岱杰;王晓【作者单位】山东省中药质量控制技术重点实验室山东省分析测试中心,济南250014;山东省中药质量控制技术重点实验室山东省分析测试中心,济南250014;山东省中药质量控制技术重点实验室山东省分析测试中心,济南250014;山东省中药质量控制技术重点实验室山东省分析测试中心,济南250014;山东省中药质量控制技术重点实验室山东省分析测试中心,济南250014;山东省中药质量控制技术重点实验室山东省分析测试中心,济南250014【正文语种】中文【中图分类】R284.2【相关文献】1.pH精制区带逆流色谱分离制备红曲中的酸式莫那可林K [J], 刘玉芹;郑振佳;杜金华;王岱杰;王晓;刘建华2.pH区带逆流色谱法分离纯化吴茱萸中的吴茱萸碱和去氢吴茱萸碱 [J], 刘倩;周思多;李大鹏;王晓;耿岩玲;郑振佳;杨丙田3.pH区带逆流色谱分离制备金果榄中的巴马汀及药根碱 [J], 刘倩;孙常磊;宫成玉;杨鹏;李大鹏;王晓4.高效液相色谱法测定金果榄中盐酸药根碱与盐酸巴马汀含量 [J], 陈黎;王启斌;黄良永;肖淼生;涂自良5.pH区带精制逆流色谱法制备青风藤碱 [J], 董红敬;张永清;庄会永;李佳;耿岩玲;王晓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
区 带 逆 流 色 谱
正 交 轴 逆 流 色 谱
双 向 逆 流 色 谱 （ DuCCC
高 速 逆 流 色 谱 （ HSCCC)
Ph
）
pH区带逆流色谱（pH-zone-refining counterrent chromatography）由Ito于1994年首次提出，利用待分 离有机酸碱的酸!碱解离常数及疏水性的不同进行分离。 与普通逆流色谱相比"其突出特点是在溶剂体系的固定 相中加入保留酸（或碱）同时在流动相中加入洗脱碱 （或酸）不同物质洗脱出来时伴随着ph 值的突变。该 技术可以得到最小重叠的矩形峰"同时杂质被集中在峰 的两侧"具有样品分离容量大。分离纯度和分离效率高 等优点。
酸碱浓度
由图7可知，在其他条件不变的情况下，对于生 物碱来说，洗脱酸浓度越小分离效果越好，在 洗脱酸浓度为6m mol/L的时，RS=1.5,实现了完 全分离。
应用
pH区带逆流色谱(pH—zone—refining CCC)的洗脱色谱图形与顶色 谱和等速电泳相似，主要组分的峰组成一系列矩形色谱峰，各色峰 之间很少重叠，一般针对可离子化的分子如羧酸、胺等。操作时选 择两相体系如甲基叔丁基醚：水，平衡后取上层溶剂加入适量的作 为“保留剂”的酸如三氟乙酸并作为固定相，下层溶剂加入适量的 作为“取代剂”的碱如氨水并作为流动相。以分离有机酸R1COOH、 R2COOH、R3COOH(pKa1<pKa2<pKa3)为例(图3)，首先将酸化的固 定相注人色谱柱中，然后加入用固定相溶解的样品。泵人流动相后， 在色谱柱足够长的情况下整个体系达到“等速”状态，与氨水界面 移动的速度同步。酸性较强的R1C00H先与氨水作用，转化为 R1COO一和NH4+产生，但R1COO一随即被酸性更强的CF3COOH质 子化，又变为R1COOH回到固定相， CF3COO一和NH4+先洗脱出。 同样，CF3COOH消耗完变为CF3COO一后，R1COOH提供质子，使 R2COO一转化为R2COOH留在固定相，直至所有的R1COOH转变 为R1COO一，并随流动相洗脱出，形成R1COO一的矩形色谱峰。与 此类
由于ph区带逆流色谱属于制备型色谱技术并具有分离效率高 分离效果好 杂质易收集及可实现ph监控等诸多优点 因此 在未来 产业化生产中拥有很大潜力和广阔应用空间 目前 该技术已经用 于许多混合物的分离 并在天然产物如生物碱的分离中显示出较强 的实用价值 对我国中草药提纯和分离工作也将有很大帮助 如果能 够与其它技术有效结合并克服其自身限制 相信其应用领域将进一 步拓宽 技术水平将得到不断提高和发展
同样，若被分离的样品是碱类如生物碱等，也可以碱为保留剂，酸为取代剂，进 行pH区带逆流色谱分离。此外，也可以选择下相溶剂为固定相，上相溶剂为 流动相，因此，pH区带逆流色谱扩大了逆流色谱的应用范围，提高了样品的进样 量，可进行制备性的样品分离，在氨基酸及其衍生物、多肽、氧杂葱染料、生物 碱、多酚和异黄酮类等化合物的分离方面得到应用。如用正丁醇：0．03tool三氟 乙酸(1：1)分离了粘菌素；用正丁醇：0．2tool甲酰氨分离了缩胆囊素。pH区带 逆流色谱也可以用于有机酸对映体的分离，1一甲基一4一甲氧甲基环己基甲酸的 两个异构体由于立体位阻效应不同使酸性产生差异(图5)，从而得到分离。
PH区带逆流色谱的原理
以分离碱性物质为例 (见图1) 与ph 突变相对应保留碱在柱子 前沿形成一个边界 在边界左侧 碱性待分离物质从洗脱酸获 得质子并进入流动相( 位置4) 溶质正离子穿过边界时置于高 ph 值范围内 (位置 1)于是被保留碱夺去质子后回到疏水性的 非离子形式并很快进入固定相中( 位置2)。当保留碱边界向 前推移时 失去了质子的溶质分子又被重新置于低ph 值范围 内( 位置3) 获得质子而回到流动相中 (位置4) 这一过程不断 重复 直至保留碱流出色谱柱。
PH区带逆流色谱技术
(pH—zone—refining Countereurrenct Chromatography
)
徐秀芳
主要内容
PH区带逆流色谱发展 PH区带逆流色谱原理 影响分离效果的因素 PH区带逆流色谱应用
发展与现状
。
逆流色谱(Countercurt Chromatography,简称CCC)是一种无需任何 固体支撑体的液液分配色谱分离技术，被分离物质根据其在互不混 溶的两相溶剂中的分配系数的不同而达到分离。由于不使用固体支 撑介质．因而避免了样品的不可逆吸附引起和失真等，全回收成为 可能。逆流色谱分离技术已经被证明是一种非常有效的制各和半制 各手段，近年来已被广泛应用于天然成分的分离纯化。由于不使用 固体支撑介质，逆流色谱有着许多液相色谱所没有的优点：CCC柱 可以通过改变不同的溶剂体系来分离不同极性的化合物；不必担心 粗样会污染损坏CCC柱；同一根CCC柱可以用于分析量级也可用于 制各量级的分离。因此放大起来比较简单。
1.袁黎明;傅若农;张天佑 高速逆流色谱在植物有效成分分离中的应用[期刊论文]药物分析杂志 1998(01) 2.张天佑 逆流色谱技术 1991 3.龚燕;郭颖;黄健光;李总成 孙丽华 pH区带逆流色谱研究进展[期刊论文]-分析化 学 2004(04)
谢谢大家！
再见!
影响分离效果的因素
流动相流速
逆流色谱转速
固定相保留值和转速的关系（见图3）
编号 1 至 3 依次表示转速为 400r/min、600r/min、800r/min, 4表示转速前 600r/min，然后调速至 800r/min的情况。 由图 3 可知，转速越大，保留值越高，分离效果 越好。但是情况 3和情况4 的保留值比较接近，所 以在通常的实验中普遍采用的都是情况 4， 这样既 能保证固定相保留值，也能使仪器不必要长时间在 800r/min 以上高速运转，同时也避免了由于高速旋 转造成的乳化。
近来ph区带逆流色谱技术又有新的改进 例如 除保留酸外还加 入乙酸 丙酸 丁酸等作为隔离酸 使几种待分离物可以被隔离 酸很好的分隔开 取得更好的分离效果 隔离酸的选取需要通过 实验加以确定 另外 加入手性选择剂 配位体 如二-( 2- 乙基己 基 磷酸） 以获得较高的固定相保留值 促进样品分离 由于该方法主要依据样品酸 碱 解离常数的不同进行分离 因 此 目前主要的分离对象为酸性或碱 性物质 并且仅限于具有较大解离常数差别的酸碱物质 这在很 大程度上限制了其应用空间的扩展 笔 者认为 根据已有的成功改进实例 与其它方法相结合以弥补这 一缺点应会成为ph区带逆流色谱技术未来发展的一个方向 例 如 对于具有微小酸 碱 离解常数差别的氨基酸混合物 可以考 虑加入适当的酸性萃取剂 碱性萃取剂或混合离子型溶剂 通过 与某种氨基酸形成络合物促进样品分离
推，其次洗脱出的是R2COO一矩形峰，最后是R3COO一的矩形峰。 由在所有的R1COOH转变为R-COO一前，R2COO一不会洗出，因 此，R1COO一在色谱图上形成矩形峰，与R2COO一很少重叠， R2COO一和R3COO一的峰也是如此。 二硝基苯亮氨酸(DNP—Leu)、丙氨酸(DNP—AIa)和天冬氨酸 (DNP—Asp)的pKa值分别为2．33、2．35和1．99、 3．90(pCOOH)，以MtBE-H20平衡后的上相为固定相并加入适量 三氟乙酸，下相为流动相并加入适量的氨水，它们pH区带逆流色 谱行为如图3所示，得到很好的分离效果(图4)。
保留碱 或酸 的作用是在溶质区前面将溶质从流动相转移 到固定相中 洗脱酸 或碱 的作用是在溶质区后面将溶质 从固定相转移到流动相中 当存在多种较大量的溶质时 具 有最大= pka 值和亲水性的溶质首先流出柱子 依此类推 并以不同溶质区ph 值 的 降 低( 或 升 高 )为 标 志 达 到 分 离 目 的(见图2)
溶剂组成
根据色谱分辨率的计算公式：计算上述a、b、c图的分辨率依次为 0.9814， 1.4150 和 2.0120 溶剂系统中水的体积含量始终占 50%， 正丁醇的含量代表 了系统的极性， 含量高， 极性大， 含量低， 极性小,分辨率与正丁醇含量 （ 极性） 的关系如图 所示
进样量
由图6可知，只要在逆流色谱的处理范围内， 进样量越大，重叠率越小，分离效果越好，这 是因为在ph区带逆流色谱中，流出物的浓度主 要有洗脱酸（碱）的浓度决定。