高效逆流色谱HPCCC有哪些基本概念

高效逆流色谱HPCCC有哪些基本概念

1、分配系数D

所有样品在HPCCC里发生的分离，是由于化合物在两相溶剂体系里的溶解度不同。用分配系数D (也称作Kd)来表述这种结果：

D = CS/CM

C S 代表样品化合物在固定相中的浓度，C

M

代表样品化合物在流动相中的浓度。样品中一种

高分配系数的化合物在固定相中的浓度要高于在流动相中的浓度，要晚一些从柱子里洗脱出来。另一种低分配系数的化合物在流动相中的浓度要高于在固定相中的浓度，要早一些洗脱出来。如果一种化合物在两相中的是平均分配的(D=1) ，不论哪一相溶剂被选为流动相，在流动相流出1倍柱体积的量后，这种化合物都会被洗脱出来。

2、固定项保留因子SF

是固定相的体积与总柱（系统）体积的比值。固定相保留因子Sf越大，柱子（系

统）的分离能力越大，因此，分离度越好

Vcolumn

-Vmp

SF(%) = Vcolumn x 100

Vmp 相当于在平衡期间洗脱出的固定相体积（我们在后面操作HPCCC部分讨论），Vc 是的柱子体积，在下一个图中可以看到：

3、洗脱出峰时间t

如果您一旦知道了目标化合物的分配系数和在两相溶剂体系中的固定相保留因

子，您可以通过下面的公式计算出任意目标化合物的洗脱出峰时间：

Vc

tD = Sf (D-1) + 1

F

这里VC 是螺旋柱（管）体积，F 是流动相MP流速，Sf 是固定相保留因子(作为一个系数) ，D 是分配系数. 无论样品负载量是多少，用这种规格的柱子，目标化合物总是在同一时间里被洗脱出峰。因此，在分配系统确定后，就非常容易预测洗脱出峰时间。

4、出峰顺序

右图显示化合物的理论洗脱出峰顺序与分配系数D的关系如果化合物的分配系数较低(即<1)，在流动相中的浓度要高于在固定相中的浓度，则出峰速度快。如果化合物的分配系数较高(即>1)，在固定相中的浓度要高于在流动相中的浓度，则出峰速度慢。接下来，我们来

解释任意级别的分离纯化过程中,利用这一特性来如何准确预测洗脱出峰的时间。

5. 分离度（分辨率）：

这种技术具有高分离性能的关键是它具有高固定

相保留因子. 这对分离纯化的性能有什么影响

呢？正如左边的谱图所示，好的固定相保留因子能

获得好的分离度。我们可以看到固定相保留因子越

高，实现的分离度越好。以前的高速逆流色谱仪

HSCCC固定相保留因子最多也不过70%；而现在的

高效逆流色谱仪HPCCC固定相保留因子一般都要

高于 85%。

这主要带来两个好处。第一个好处是具有高固定相

保留因子，扩大了两相溶剂体系的范围。这很容易

理解，从非极性两相溶剂体系到极性两相溶剂体系

固定相保留因子降低(即极性变强). 因此，在过去

由于固定相保留因子太低，不能利用这个技术解决

纯化分离遇到的问题

由于工业上在非极性范围一直采用反相高效液相色谱技术，这种技术并没有被采用。第二个好处关系到纯化分离的通量和速度。过去，尽管这项技术叫高速逆流色谱，但是名不符实。因为分离纯化时间经常是以小时计算而不是分钟。高的固定相保留因子允许在不损失分离度的状况下提高流动相流速。右边图示例子。现在的HPCCC，溶剂的极性范围扩大，使高通量的分离纯化能够实现。

6. 柱长的影响：

可以通过增加柱长来提高分离度，这一点与常规采用固体固定相色谱技术的不同。

因为HPCCC 是一种低压分离技术，柱长不受限制。分离度与柱长倍数的平方根成

正比（如，柱长为2倍时，相当于提高分离度为2的平方根，即1.4)。显然，柱长增加，分离时间也增加了，但是通量（产量）却不受影响，因为样品负载能力是柱体

积的a %（在上面的例子，样品的负载加倍，但是分离时间也是加倍，因此生产能

力保持不变）。所以产品研发阶段，可以先在小级别的设备上检验工艺条件是否合适。用户可以根据最重要的工艺参数（通量，产率和纯度），放大工艺条件，制作

柱子。

4.与其它色谱技术的比较，HPCCC的优势有哪些？

HPCCC具有许多超越其他类型分配色谱设备（如，HSCCC ，CPC和FCPC）的优势。首先，固定相保留因子要好于HSCCC设备，流动相流速要

远高于其它设备，因此分离时间显著减少，通量显著增加。

操作模式更灵活

液体固定相的优势是可以采用多种不同的操作模式，这是固体固定相难以实现的。现在介绍一下液体固定相及它的组成。

另一个区别，HPCCC技术与液固色谱技术不同，正相分离过程就是反相分离过程的逆向过程。跑得快的化合物洗脱更靠后，跑得慢的化合物

洗脱更靠前。这是因为每种化合物的分配系数在反相分离过程中变成了原

来的倒数。请看右图所示[5]。

能实现高分离度分离

首先，我们先明确HPCCC实现高分离度分离的条件。这个条件就是目标化合物的D 值要选择介于0.5 和 2.0之间。对未知混合物，其所包含的大多数复杂化合物的平均D值也要被设定在这个范围里。调整D值最好的方式是调整两相溶剂体系；这在后面的方法开发部分会介绍。接下来，我们来介绍通过改变操作模式来实现这个目的。通过在一次分离过程中从正相分离模式切换到反相分离模式，或者相反，来调整D值。

单向洗脱模式CCC

单向洗脱模式CCC是最基本的分离类型。是一种单方向的分离模式，可以是正

相分离过程也可以是反相分离过程，这取决于选择的流动相。

在❽正相分离❾模式，溶质洗脱顺序是增加极性（正相等梯度模式）。

上相是有机相做流动相，下相是水相做固定相。

在❽反相分离❾模式，溶质洗脱顺序是降低极性（反相等梯度模式）。

下相是水相做流动相，上相是有机相做固定相。

洗脱推出模式：

洗脱推出模式的理论基础是基于化合物在从色谱柱里洗脱出来之前，就已经被完全分离

的假设。由于我们使用的是液体固定相，所以在完整洗脱循环过程没有完成的时候，我

们可以回收已经分离开的化合物。.

洗脱推出模式，分离开始的方式与单向洗脱模式CCC一样。但是，当运行到一

个点时(如D=1.0)。流动相被停止，固定相被泵送入，推出柱子里内容物。(即，

开始是固定相的那一相溶剂被当作新的流动相引入到设备里) [6]。

这种模式的优点是：

高D值得化合物的峰宽将变窄，对于在固定相中强保留的化合物能够提高分离度。

总的运行时间将缩短，因为只需要有1倍柱体积的初始固定相（也就是新流动相）推出全部样品。

洗脱推出模式另外一个好处是，在实验结束时设备里填满了固定相，可以进行下一次进样。