高速逆流色谱分离技术

生药
HPLC法测定分配系数
AUi 2 VL AUi 2 VL Ki Ki A A V Ui 1 Ui 2 U A A V
Ui1 Ui 2 U
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溶剂系统选择的基本步骤
(1)首先预测要分离物质的极性, 溶解性特点，粗 选几个溶剂体系。 (2)建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 （3）利用HPLC测定K，并计算容量因子a，2>K>0.5, a>2，能够获得理想的分离。 （4）制备性分离。
利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定
相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递
其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管 绕成的螺旋管中 流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系 数的不同依次洗脱而获得分离
特殊的流体动力学
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固定相的保留
缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程 长，需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．
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3.高速逆流色谱的原理
利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不 相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒 流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按 分配系数的次序，被依次洗脱。
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液－液分配色谱
利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES） 从而实现流动相高速移动时固定相的保留
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混合区：在靠近离心轴
心大约有四分之一的区 域，两相的激烈混合
静置区：两相溶剂分成
两层，重相在外部，轻 相在内部来自以1000转/分的速率进行旋 转，在二维力场的作用下 分离管柱内混合和传递的 频率可达到17次/S，从而 实现高效的分离
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－ 上层 － 下层
体系 目标物质 分配系数K 300BHSCCC保留时间
氯仿/异丁醇/甲醇/水 4：0.25：3：2 芦荟未知物 0.9 2.3h 芦荟甙A 1.9 4.0h 芦荟甙B 2.3 5.3h
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样品的HSCCC分离图谱
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• 通过HPLC方法筛选HSCCC溶剂条件 的优势在于 1、提高效率 2、节省溶剂用量 3、可获得相对合适的溶剂条件
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● 影响逆流色谱应用的因素
●
溶剂系统的选择是应用逆流色谱的关键。
● 对于其溶剂系统的选择，目前尚无充分的 理论依据，一般根据实验积累经验。 ● 对于一个定型的机器来说，制备分离能力 决定于溶剂系统的选择和仪器参数
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HSCCC的溶剂条件选择
• HSCCC采用液-液分配原理，增加了固 定相选择环节，因此它的溶剂条件选择 方法与其他色谱技术不同。
● 建立高速逆流色谱的反应器, 反应与分离耦合
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高速逆流色谱 在中药现代化中的应用
单体化合物 用于制药中间体的质 量控制
成药质量控制 指导原药材种植/ GAP基地建设
指纹图谱
天然产物 中等极性(氯仿溶解)
（香豆素、醌类、苯丙 素、生物碱、黄酮等）
弱极性(正己烷溶解)
（萜类、甾体、脂肪酸等）
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溶剂条件的筛选方法
1、文献报道的溶剂条件 经典体系1：氯仿-甲醇-水：4-3-2 经典体系2：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水：1-1-1-1 2、TLC方法初步筛选 初步判断样品在上、下相中的分配情况 3、HPLC方法分析分配系数 分析目标组分在两相中的分配系数K值 4、利用分析型HSCCC 时间短、溶剂消耗少等优点
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逆流色谱简介
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逆流色谱
逆流色谱(countercurrent chromatography, CCC)是 一种无固体载体的连续液-液分配色谱技术，在离心 力场的作用下使液体保留于柱中作为固定相。最初 由美国国立健康研究院(NIH)的Ito教授研制开发。
Ito Y, Bowman R L. Science, 1970, 167: 281-283.
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◆ 温度 不同的样品及不同的体系，温度的影响 可能都会不一样。可配置恒温装置，控制 实验因素。 ◆ pH值 可通过调节体系的PH值使样品的溶解 度达到合适的范围。 ◆ 进样量 进样量的大小及溶样体积多少的影响
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◇逆流色谱溶剂系统的研究 ● 开发双水相系统,进行生物大分子分离 ● 开发微胶束系统 ● 建立三相\四相逆流色谱体系
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K ＝ Cs/Cm
Cs Cm
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HSCCC的工作流程
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●逆流色谱的优点
A、无固相载体，避免了有效成分不可逆吸附和峰形拖 尾等缺点； B、粗提物可进样分离，分离纯化与制备可同步完成， 有机溶剂消耗少，无损失、高效、快速和制备量大等 优点; C、与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达几克， 是HPLC的104-105 倍; D、与常压和低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，经 过1次分离就可以得到1个甚至多个单体，并且分离时 间短。
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HSCCC最合适的K值范围是0.5－2 当CS/CM＜＜0.5时，出峰时间太快，峰 之间的分离度较差，当CS/CM＞＞2时， 出峰时间太长，且峰形变宽
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实例 根据文献报道，筛选出芦荟甙HPLC分离的色谱条件，得到芦荟甙 提取物的HPLC图谱如下，1芦荟未知物，2芦荟甙A，3芦荟甙B
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HSCCC溶剂系统选择
Selection of solvent systems
水溶性和强极性
（皂苷、强心苷、黄 酮苷、多酚类等）
正丁醇-醋酸-水 正丁醇-甲醇-水(缓冲液) 正丁醇-乙酸乙酯-水(缓冲液) 乙酸乙酯-水(缓冲液) 氯仿-甲醇-水 乙酸乙酯-甲醇-水 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水) 正己烷-乙腈 正己烷-甲醇-水 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水)
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1 逆流色谱的原理及发展过程
分配定律：Nernst, 1891 年，Ｋ＝Ｃ1／Ｃ2 两组分K相差较大：一次萃取可得到分离
较小：多次萃取
逆流分配法，20世纪40年代,创始人Craig
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2.液滴逆流色谱(DCCC)
溶剂 泵
进样器
进样器
溶剂 约300根管柱 上行法 收集器
泵 收集器 约300根管柱 下行法
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影响高速逆流分离的其他因素
固定相保留率 转速及流速 温度 pH值 进样量
当体系选定后，在适当合理的调节这些 因素，样品可以达到有效的分离。
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◆ 固定相保留率 直接决定分离柱的有效长度，合适的
范围为30％～80％。在一定范围内，保留
率越高，分离越好。 ◆ 转速及流速 不同的机型可选择不同的转速及流速。 在一定范围内，转速提高，保留增加；流 速降低，保留增加。