液滴逆流色谱
高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
液滴逆流色谱dccc示意图
天然产物提取分离案例
中草药有效成分提取
利用DCCC技术可从中草药中提取和分离出多种有效成分，为中 药现代化和国际化提供有力支持。
天然色素分离
DCCC技术可用于天然色素的提取和纯化，为食品、化妆品和染料 等行业提供高质量的天然色素。
生物碱类化合物提取
通过DCCC技术可从植物中提取和分离生物碱类化合物，为新药研 发和药物质量控制提供重要支持。
增加了物质与固定相和流动相之间的接触面积和 接触时间。
3
提高了分离效率和分辨率，尤其适用于复杂样品 的分离。
DCCC操作原理
01 样品溶液以液滴形式进入色谱柱，与固定相 形成动态平衡。
02
通过控制流动相的流速和组成，调节液滴在 色谱柱中的移动速度和分离效果。
03
检测器监测流出液的信号变化，记录色谱图 和峰信息。
药物研发中的应用案例
01
药物筛选
利用DCCC技术可对药物候选物进行高效筛选，提高药物研发效率和成
功率。
02
药物代谢研究
DCCC技术可用于药物代谢产物的分离和鉴定，为药物作用机制和药代
动力学研究提供重要信息。
03
质量控制
通过DCCC技术可对药物原料、中间体和成品进行质量控制，确保药品
的安全性和有效性。同时，该技术也可用于药物杂质的分析和鉴定，为
据。
05
02
柱塞泵设置
根据实验需求设置柱塞泵的流量和压力参数。
04
色谱分离
启动柱塞泵，推动液滴进入色谱柱进 行分离。同时开启检测器，实时监测 液滴中各组分的浓度变化。
06
关机与清洗
实验结束后关闭柱塞泵和检测器，拆卸色谱柱 进行清洗和保养。同时清洗进样器和连接管路， 确保设备清洁卫生。
逆流色谱基本原理
高速逆流色谱原理(HSCCC：High Speed Counter-Current Chromatography)液相色谱系统构成高速逆流色谱系统构成TBE300A＋ÄKTA Prime逆流色谱原理萃取：利用物质在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使物质从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。
逆流色谱原理液－液分配色谱：利用样品中各组分在两相溶剂间分配比的差异，进行分离。
它是不用固态载体的全液态的液-液分配色谱技术.优点：不存在样品的不可逆吸附，理论回收率为100％极大地避免了样品的变性问题操作简单，无需太多样品前处理等。
HSES 流体静力平衡体系在充满下（上）相的螺旋管内慢慢注入上（下）相，最终会形成整个管柱里上下两相交替分段分布的状态。
无论哪一相作为流动相，都能建立起流体静力平衡状态。
如果流动相与管壁亲和性强，它会均衡沿管壁流过形成连续流，如果亲和性较弱，会形成小滴穿过固定相。
液滴逆流色谱(DCCC)旋转腔室逆流色谱(RLCCC)离心分配逆流色谱仪(CPC)利用离心力产生的恒定立场讲固定相保留在又管道连接的一系列腔体中。
优点：噪声小、平衡性好，多数溶剂系统都可在该仪器使用，流动相流速为数毫升每分钟。
由于死体积存在，两相溶剂难以充分混合，与同体积的流体动力学的逆流色谱仪相比分离效率差。
这类一起都是采用旋转密封接头，不可避免产生溶剂渗漏问题。
HDES流体动力平衡体系螺旋管力能保留住任一相充当的固定相，并能形成在数量上超过螺旋单元数的分配单元。
在螺旋管的各个部位，由大量小滴构成了两相间广阔的界面，这些小滴在支撑相里剧烈而稳定的震荡，减小了质点传递阻力，避免了使样品区带展宽的层流的产生。
螺旋管里不存在完全由流动相占据的无效空间，无论以哪一相做流动相，在整个螺旋管的有效空间里总是有一相会形成剧烈而稳定震动小滴，靠这样的运动和分布能开发出有效的逆流色谱仪。
两相不相溶的溶剂在一根绕自身轴旋转的螺旋管内，其中一相的小液滴会向首端迁移，另一相向尾端迁移。
逆流色谱
逆流色谱基础
• 逆流色谱仪器体系
1) 重力作用 2) 流体静力学平衡体系 (HSES) 特征：a) 由一系列腔体或小室组成 b) 一个旋转轴，离心力恒定 3) 流体动力学平衡体系 (HDSE) 特征：a) 缠绕的聚四氟乙烯管 b) 两个旋转轴，离心力可变
逆流色谱基础
• 逆流色谱的基本色谱理论
CCC是一种特殊的液相色谱技术，利用特殊的 色谱柱实现液态固定相的有效保留。作为一种 色谱技术，遵循基本的色谱塔板数理论和经典 的色谱公式。
甲醇，正丙醇 ，异丙醇 甲酸，乙酸
高速逆流色谱
• 洗脱方式 1) 等度洗脱 2) 梯度洗脱
a) 三元溶剂体系 b) 多元溶剂体系
3) 双向洗脱
高速逆流色谱
• 检测 1) 紫外-可见光检测器 2) 蒸发光散射检测器 3) 傅里叶红外光谱检测器 4) 薄层色谱检测器 5) 质谱检测器
高速逆流色谱
• 优点
高速逆流色谱
• 简介
高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography, HSCCC)是20世纪80年代，由Ito教授研究和发展起来的一 种现代色谱分离制备技术，HSCCC建立在一种特殊的流体 动力学平衡基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的 不对称离心力场，实现两相溶剂体系的充分保留和有效混 合及分配，从而实现物质在两相溶剂中的高效分离。
1) 两相的界面张力 2) 比重差 3) 输液管的口径 4) 分离管的材料
液滴逆流层析
• 装置：三部分组成 1) 输液部分：微型泵、贮液槽、进样器 2) 分离管部分 3) 样品收集部分：检测器、自动收集仪 • 应用实例 柴胡皂苷a, d (C-16羟基端基异构体) 人参皂苷的分离 • 与逆流分配比较：优点
逆流色谱技术
逆流色谱起源于最简单的液液分配装置－实验室里常用 的分液漏斗。二十世纪30年代初，Jantzen对工业上的 混合分离单元首先使用了逆流分配术语，并发展了实 验室规模的逆流分配装置。1941年，Martin和Synge设 计了一种级联型萃取装置，他们使用多孔固态载体支 撑一种液体，而让另一种不互溶的液体通过载体，从 而产生了分配色谱。逆流分配法的创始人Craig发明了 非连续式的逆流分配（countercurrent distribution,CCD）装置，并设计了几种CCD仪器用于 多种类型物质的分离，这一设计很快被接受，用于天 然产物、多肽和其它生物大分子。此法设备复杂，溶 剂消耗大、易乳化，分离操作时间长。此后出现的几 种液液分配分离装置和仪器都没有根本上的突破，因 此均未得到推广用于。
螺旋管行星式离心色谱 螺旋形逆流色谱仪 液滴逆流色谱仪 旋转和回旋腔室逆流色谱 流通型行星式逆流色谱仪 连续洗脱型逆流色谱仪 倾斜角转子逆流色谱仪 慢旋转螺旋管制备型逆流色谱仪 水平流通式逆流色谱仪 非同步逆流色谱仪 高速逆流色谱仪 离心液滴逆流色谱仪 双向逆流色谱仪 多螺旋管逆流色谱仪
逆流色谱原理
日本学者Ito等首先在日本，随后在美国的国家 医学科学研究院发现了一种有趣的现象：不互 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小口径管子里能 在重力场的作用下实现物质在两相溶剂间的连 续分配。而当螺旋管柱在一离心力场内转动时， 随着转速的增加，两相溶剂的混合程度，分配 效率，管柱的利用率及物质在固定相的保留值 也随之增加。如果把待分离样品从管子的入口 引入，连续分配传递过程就会在管柱里进行， 从而实现连续的液一液分配分离，并由此设计 制造了多种逆流色谱仪。
物体在旋转螺旋管里的运动状态示意图
1．首端；2．玻璃珠；3．铅粒； 4．气泡；5尾端．
高速逆流色谱分离技术
生药
HPLC法测定分配系数
AUi 2 VL AUi 2 VL Ki Ki A A V Ui 1 Ui 2 U A A V
Ui1 Ui 2 U
生药
溶剂系统选择的基本步骤
(1)首先预测要分离物质的极性, 溶解性特点，粗 选几个溶剂体系。 (2)建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 （3）利用HPLC测定K，并计算容量因子a，2>K>0.5, a>2，能够获得理想的分离。 （4）制备性分离。
利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定
相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递
其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管 绕成的螺旋管中 流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系 数的不同依次洗脱而获得分离
特殊的流体动力学
生药
固定相的保留
缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程 长，需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．
生药
3.高速逆流色谱的原理
利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不 相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒 流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按 分配系数的次序，被依次洗脱。
生药
液－液分配色谱
利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES） 从而实现流动相高速移动时固定相的保留
生药
混合区：在靠近离心轴
心大约有四分之一的区 域，两相的激烈混合
静置区：两相溶剂分成
两层，重相在外部，轻 相在内部来自以1000转/分的速率进行旋 转，在二维力场的作用下 分离管柱内混合和传递的 频率可达到17次/S，从而 实现高效的分离
化学分离中的逆流色谱法原理
化学分离中的逆流色谱法原理化学分离是化学分析、工业生产等领域中的一个重要过程，其中，色谱法作为一种常用的分离技术，其原理和应用也备受关注。
在色谱法中，逆流色谱法作为一种高效、准确的分离技术备受推崇。
本文将详细讲解逆流色谱法的原理和应用。
一、逆流色谱法的概念逆流色谱法是一种速度较快、分离效果良好的体积计数法，适用于分离中小分子有机化合物和离子。
其原理是将流动相（溶液）通过逆流器后，在固定相（色谱柱）与流动相的作用下，溶液中的样品分子与固定相发生相互作用，使样品分子在色谱柱中发生分离，最后从出口处依次流出。
二、逆流色谱法的基本原理逆流色谱法的基本原理可以分为三大部分：逆流器、色谱柱、检测器。
（一）逆流器逆流器主要是利用多级电离器、离子对撞机等离子体设备对样品分子进行离子化，然后通过溶液进行循环，并利用固体捕获物质将其在离子源中分离，从而实现样品分子的准确分离。
它的主要作用是将样品分子与溶液分离，达到分离提纯的效果。
（二）色谱柱色谱柱是逆流色谱法中最为重要的一部分，其主要作用是分离各种组分及其含量。
其分离过程主要是通过化学亲和力异常及矩阵材料的物理吸附、化学反应来实现的。
从而实现最终样品的分离。
色谱柱的种类很多，不同的柱子有着不同的分离效率和特点。
（三）检测器检测器通常是用来对色谱柱中的有机物和离子物质进行检测，常用的方法有滴定法、荧光法、紫外-可见吸收法、电导率法、荧光差动压力法等。
其中，紫外-可见吸收法检测结果较为准确，受到广泛应用。
三、逆流色谱法的应用（一）分离样品逆流色谱法可以分离出样品中的不同组分，达到分离提纯的目的。
比如，如果在样品中含有多种不同的氨基酸或者蛋白质等杂质，逆流色谱法可以将其分离出来，提炼出目标化合物。
（二）制备纯度高的化合物逆流色谱法不仅能够分离出类似结构的分子，而且还可以提高目标化合物的纯度，降低不纯物质的含量。
因此，其在制备优质、纯度高的化合物上得到广泛应用。
（三）药物分析逆流色谱法在药物分析方面得到了广泛应用。
逆流色谱
20世纪90年代后，许多国家规定，凡结 构中具有不对称因素的药物，即“手性药 物”，必须拆分其相应的立体异构体，并分 别研究其药理、毒理和药物代谢性质。对已 上市的消旋体药物，要重新评价其光学异构 体的性质。对新申报的药品，一开始就要合 成其光学异构体。
.
如果设法把手性试剂引入固定相，外消
手性色谱 旋体样品流过柱子是否会形成非对映体？
手性色谱的原理是通过待拆分对映体与手性 固定相之间的瞬间可逆相互作用，根据形成瞬 间缔合物的难易程度和稳定程度，经过多次质 量交换后，达到对映体间的分离。
近年来，高效手性分离技术的发展，导致与有机立体化学相 关的手性药物学、分子生物学、材料化学、地球化学、天然有 机化学等前沿领域取得许多突破性的发现和发展。
美国Illinois大学的W H Pirkle 研究组研制，因此又称Pirkle 型或多种作用（multiple-interaction）手性固定相，其商品以 Brush-Type （ 刷 性 ） 著 称 。 在 手 性 液 相 色 谱 领 域 ， Pirkle 型 CSP是目前使用量大、适用面广、对手性识别机理揭示较深刻 的一类重要CSP。它们具有确定化学结构，其共同结构特征是 在手性中心附近至少含有下列基团之一： （1）π-酸或π-碱芳基，具有给体-受体相互作用能力（电子转 移络合）。 （2） 极性氢键给体/受体。 （3） 形成偶极相互作用的极性基团。 （4）大体积非极性基团，提供立体位阻、范德华作用或构型 控制作用。
阿基米德螺线力
.
固定相的保留是在两个力的平衡 状态下实现的
• 阿基米德螺线力——固定相移 向移动相引入端
• 流动相的推力——固定相推向 移动相流出端
逆流色谱法
7.4.1 DCCC (液滴逆流色谱)
DCCC (液滴逆流色谱): 是在逆流分溶法基础上创建的色谱
装置，可使流动相呈液滴形式在固定相间交换，促使溶质中各组 分在两相之间进行分配，达到分离效果。
7.4.1 DCCC (液滴逆流色谱)
缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程 长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．
7.4.2 旋转小室逆流色谱
7.4.3 离心逆流色谱法
离心逆流色谱法：仪器工作的时分离柱要绕 中心轴在设备中高速转动，因为高速旋转产 生的离心力可使两相剧烈地反复混合分层， 实现快速高效的分离。
7.4.3 离心逆流色谱法
7.4.3.1 非行星式逆流色谱仪：主要包括分离柱室 螺旋管式和非螺旋管式，主要是匣盒式离心逆 流色谱仪。
7.4.4 高速逆流色谱法
混合区：在靠近离心轴
心大约有四分之一的区 域，两相的激烈混合
静置区：两相溶剂分成
两层，重相在外部，轻 相在内部
以1000转/分的速率进行旋 转，在二维力场的作用下 分离管柱内混合和传递的 频率可达到17次/S，从而 实现高效的分离
7.4.4 高速逆流色谱法
K ＝ Cs/Cm
7.4.4.4 手性分离
手性分离：通过向固定相和流动相中 加入手性试剂，可以采用HSCCC实 现手性制备的目的，手性试剂的选择 至关重要，最好它溶解于固定相或流 动相中（报道非常有限）。
7.4.3.2 行星式逆流色谱仪：分离柱几乎全是利 用聚四氟乙烯管绕成的螺旋线圈。
7.4.4 高速逆流色谱法
高速逆流色谱技术(HSCCC) 是一种不用任何同态载体的 液．液色谱技术，其原理是 基于组分在旋转螺旋管内的 相对移动而互不混溶的两相 溶剂间分布不同而获得分离， 其分离效率和速度可以与 HPLC相媲美。
液滴逆流色谱DCCC示意图课件
第三节 提取分离方法
3.2 硅胶、氧化铝： P28
①被分离物质吸附力与结构的关系 被分离物质极性大，吸附力强，Rf值小，洗脱难，
后被洗脱下来。 官能团极性大小相对一般排列顺序：
-COOH > Ar-OH > R-OH > R-NH2, RNHR ', RNR ' R " > RCO-NR'R"> RCHO > RCOR ' > RCOOR ' > ROR ' >RH ②溶剂(洗脱剂)的极性与洗脱力的关系 洗脱剂极性越大, 洗脱力越强.
0
1
2
3
n
CCD法的分离过程示意图
第三节 提取分离方法
2.纸色谱法（PC）：也叫纸分配色谱（PPC， Paper Partition Chromatography）。 P23 补
固定相：滤纸纤维中含有的5-7%水 流动相：有机溶剂
注意：如果流动相为缓冲盐溶液，则PC 为非极性吸附色谱（纤维素色谱）
R2O
O
OH
OH O
OR1
极性大小:
SiO2-TLC Rf: Polyamide TLC, Rf:
A: R1 =R2= H B: R1 = H, R2= Rham C: R1 = Glc, R2= Rham
第三节 提取分离方法
答案： 极性大小: C > B >A SiO2-TLC Rf: A > B > C Polyamide TLC, Rf: C > B >A
稳定的纯物质都可以有超临界状态（化学性质稳定，在 达到临界温度不会分解）。
高速逆流色谱
溶剂体系的选择
基本原则: • 1. 不能影响样品（分解, 变性） • 2. 对样品溶解度好 • 3. 两相稳定可迅速分相（小于30秒） • 4. 固定相有较好保留（大于50%） • 5. 尽量用挥发性溶剂有利于样品回收
• 6. 样品在两相中分配系数合适（ 0.5~2 ）
溶剂条件的筛选方法
溶剂体系可分为三大类：
高速逆流色谱技术及应用
杨晶 授课老师：刘俊达
内容提纲
• 逆流色谱发展史 • 高速逆流色谱简介 • 高速逆流色谱的应用 • 总结与展望
逆流色谱的发展史
逆流分配色谱 Counter-current Distribution 上世纪 四十年代 Lyman C. Craig 发明了第一台设备 (不算分液漏斗!) 进行逆流分配实 验; 他称其为 Counter-current Distribution (CCD)。下面是一台由 Hecker (Tuebingen, Germany) 试制的由手动操作的CCD。
高速逆流色谱 High Speed CCC (HSCCC)
由Yoichiro Ito博士 (NIH, Bethesda, 20世纪60年代逆流色谱的基本模 型创始人)于1982年首先研发出行星式离心逆流色谱仪。 ●“增加的引力” – 混和程度提高 – 形成流体动力学平衡体系(变化 力场) ● 理论塔板数高 (up to 70,000 per hour) ● 无死体积，低压力，固定相保留率更高。
• ①③组分，由于在轻相中的分配系数过大不易被流动相洗脱下来 • ②④组分，根据在重相的分配系数大小按顺序洗脱出来分离区 •
………………――――轻相 • oooooooooooo――――重相 • ①②③④——样品（4组分）
HSCCC的工作流程简易图
逆流色谱技术
消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失， 在实验中只要调整好分离条件，一般都有离效果的因素
1. 固定相的保留值
在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的 一个重要因素，高保留量将会大大改进峰分离度。（仪器 因素和溶剂系统因素）
二、两相溶剂的选择
经典溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己 烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和 正丁醇-甲醇-水等
二、两相溶剂的选择
乙酸乙酯:水（1：1）
大部分目标化合物集中在上相
乙酸乙酯:乙醇:水
化合物的分配比得到了改善，但 是化合物的分离时间又过长
正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:5:5:5) 正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:5:7) 正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:6:6)
日本学者Ito等首先在日本，随后在美国的国家 医学科学研究院发现了一种有趣的现象：不互 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小口径管子里能 在重力场的作用下实现物质在两相溶剂间的连 续分配。而当螺旋管柱在一离心力场内转动时， 随着转速的增加，两相溶剂的混合程度，分配 效率，管柱的利用率及物质在固定相的保留值 也随之增加。如果把待分离样品从管子的入口 引入，连续分配传递过程就会在管柱里进行， 从而实现连续的液一液分配分离，并由此设计 制造了多种逆流色谱仪。
液滴逆流色谱仪
DCCC仪器的工作原理示意 a. 上行方式；b. 下行方式 1．储液器；2泵；3．样品室；4分离管柱；5．收集器
离心式DCCC的工作原理示意图
旋转腔室逆流色谱仪示意图
回旋腔室逆流色谱示意图
－
环绕螺旋管离心分离仪
同步螺旋管行星式逆流色谱
高速逆流色谱
高速逆流色谱(HSCCC)是一种液 -液色谱分离技术，它的固定相 和流动相都是液体，没有不可 逆吸附，具有样品无损失、无 污染、高效、快速和大制备量 分离等优点。由于HSCCC与传统 的分离纯化方法相比具有明显 的优点，因此己被广泛应用于 中药成分分离、保健食品、天 然产物化学、有机合成、环境 分析等领域。
逆流色谱原理简介
逆流色谱原理简介任何熟悉液液萃取（使用分液漏斗）和色谱（例如HPLC）技术的人都很容易理解逆流色谱液液萃取的原理(countercurrentchromatography(CCC))。
液液萃取为化学家们分离大量的化学物质提供了一个简单的方法，而且使用的溶剂最少。
把样品溶在两相溶剂系统中，振摇使两相充分混合，静置后，两相重新分层。
这些步骤是分离样品组分的关键。
这种经典的液液萃取在色谱工作者看来，最大的缺点是它在分离过程中只有一个理论塔板数。
（事实上，这种情况下没什么理论可言。
这一个分离塔板数是源自于工业上的分馏。
因此，化学工作者要么设计一合适的单步分离方法去适应自己的需要，要么就用多次液液萃取去提高分离度。
通常使用前者，因为后者太麻烦了。
（尽管多次液液萃取经常用到，但溶剂系统在不同的提取中通常要改变，以便提高效率。
）为了改善分液漏斗，以经过许多的尝试。
克雷格逆流分布仪是其中一个最引人注意的突破。
这套精妙的仪器，把一系列的分液漏斗有效的排成链，重复的进行系列的步骤：振摇（混合）、静置、分离，再重头开始，这样就提高了塔板数。
假如有足够的塔板数，那这套仪器可以达到色谱级的分离。
液滴逆流色谱（DCCC）在发展过程中又开发出了液滴逆流色谱（DropletCounterCurrentChromatograph）。
这个仪器把一系列垂直的管子用毛细管连接起来。
液体固定相留有直管中，把流动相慢慢的泵进去，（如果流动相比较重就从上方泵进去；反之，则从下方）。
象所有的色谱那样，组分比较容易溶于流动相中的就移动的快；而比较容易溶于固定相中就滞后了。
于是就分离开来了。
很显然，每一个直管只有最小可能的理论塔板数。
所以，要有显著的效能就要用大量这样的直管。
其分离步骤如下：把样品液滴与流动相混合，通过不移动的固定相，期间没有发生振摇。
液滴的大小与其他溶剂系统的参数限制了溶质在两质中的分配。
静置最终在直管末端形成，在这儿，流过固定相的流动相在通过毛细管进入下一根直管前先聚集起来。
逆流色谱操作实验报告
一、实验目的1. 熟悉逆流色谱的基本原理和操作方法；2. 学会利用逆流色谱技术对混合物进行分离纯化；3. 了解逆流色谱在中药成分分离中的应用。
二、实验原理逆流色谱是一种液-液分配色谱技术，利用液体固定相和流动相之间的分配系数差异，实现混合物中各组分的有效分离。
实验中，将待分离的混合物加入固定相中，通过改变流动相的组成，使各组分在两相之间发生逆流分配，从而实现分离。
三、实验材料1. 仪器：逆流色谱仪、色谱柱、离心机、微量注射器、容量瓶、移液管等；2. 试剂：固定相、流动相、待分离混合物等；3. 药品：中药样品、分析纯试剂等。
四、实验步骤1. 调节逆流色谱仪，将色谱柱固定在离心机上进行操作；2. 准备固定相和流动相，根据实验要求配制不同浓度的流动相；3. 将待分离混合物加入固定相中，调整固定相的体积，使其充满色谱柱；4. 开启离心机，使色谱柱产生离心力，使固定相和流动相分离；5. 根据实验要求，逐渐改变流动相的组成，使各组分在两相之间发生逆流分配；6. 收集各组分，进行检测和分析。
五、实验结果与分析1. 实验过程中，观察色谱柱中固定相和流动相的分离情况，记录各组分分离时间；2. 根据分离时间，分析各组分在两相之间的分配系数差异，判断分离效果；3. 对分离得到的各组分进行检测和分析，确定其纯度和含量。
六、实验讨论1. 逆流色谱操作过程中，固定相和流动相的选择对分离效果有很大影响。
实验中，应根据待分离混合物的性质和实验要求，选择合适的固定相和流动相；2. 实验过程中，离心机的转速和温度对分离效果也有一定影响。
应根据实验要求调整离心机参数，以获得最佳分离效果；3. 逆流色谱在中药成分分离中具有广泛的应用前景。
实验结果表明，逆流色谱可以有效地对中药样品中的活性成分进行分离纯化，为中药现代化研究提供有力支持。
七、实验总结本次实验成功地将逆流色谱技术应用于混合物的分离纯化，掌握了逆流色谱的基本原理和操作方法。
实验结果表明，逆流色谱在中药成分分离中具有广泛的应用前景，为中药现代化研究提供了有力支持。
逆流色谱
?
高速逆流色谱
线圈300ml
工作原理：利用的
是螺旋管的方向性与 高速行星式运动相结 合产生的一种独特的 流体动力学现象。 流体动力学现象。 HSCCC螺旋管内区混合运动示意图 HSCCC螺旋管内区混合运动示意图 两相溶剂体系在高速旋转螺旋管内的运动分布： 两相溶剂体系在高速旋转螺旋管内的运动分布：两相溶剂体 系在螺旋管内存在两种状态（左图） 系在螺旋管内存在两种状态（左图）,一种是在背离中心轴的螺 旋管内,互不相溶的两相处于分离的位置,较重相(下相) 旋管内,互不相溶的两相处于分离的位置,较重相(下相)处于螺 旋管外侧,轻相(上相)处于螺旋管内侧。 旋管外侧,轻相(上相)处于螺旋管内侧。在朝向公转轴线的方向 的区域两相激烈的接触、混合、分配和传递。 的区域两相激烈的接触、混合、分配和传递。随着流动相不断的 注入流出,样品中分配系数小的组分先被洗脱出来, 注入流出,样品中分配系数小的组分先被洗脱出来,分配系数值 较大的组分后被洗脱出来,最终达到分离的目的。 较大的组分后被洗脱出来,最终达到分离的目的。
阿基米德螺线力
固定相的保留是在两个力的平衡 状态下实现的 • 阿基米德螺线力——固定相移 向移动相引入端 • 流动相的推力——固定相推向 移动相流出端
高速逆流色谱
逆流色谱技术Countercurrent Chromatigraphy(ccc)
• 用很长的软管（如聚四氟乙烯管）绕制成，柱内不加入任何固态支撑 体或填料。使用时根据被分离混合物的理化特性.选择某一种有机/水 两相溶剂体系或双水相溶剂体系，此体系可以是二元的或多元的。用 此体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，首先将其注满管柱内， 然后让此管柱作特定的旋转运动，用由此形成的离心力场来支撑住柱 内的液态相。这时，若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混合 样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液相对流的整个管 柱空间，各个组分也就会按其在两相中的分配系数(即某一化组分在 流动相中的溶解度同它在固定相中的溶液解度的比值)分离开来。
逆流色谱法
7.4.4.2 实验操作
（2） 样品溶液的制备：样品溶液制备主要考 ） 样品溶液的制备： 虑样品的溶剂 样品量以及样品体积的大小。 溶剂， 以及样品体积的大小 虑样品的溶剂，样品量以及样品体积的大小。 （3） 分离：两相溶剂系统不需要脱气，但使 ） 分离：两相溶剂系统不需要脱气， 用前必须互相饱和。 用前必须互相饱和。 紫外检测器。 （4） 检测：目前较为常用的是紫外检测器。 ） 检测：目前较为常用的是紫外检测器 重要的是保证基线的稳定。 重要的是保证基线的稳定。
7.4 逆流色谱法（CCC） 逆流色谱法（ ）
7.4.1 液滴逆流色谱(DCCC) 液滴逆流色谱() 7.4.2 旋转小室逆流色谱 旋转小室逆流色谱(RLCC) 7.4.3 离心逆流色谱法 7.4.4 高速逆流色谱法 高速逆流色谱法(HSCCC)
7.4.1
DCCC (液滴逆流色谱) 液滴逆流色谱)
7.4.4.3 PH-区带 提取逆流色谱法 区带-提取逆流色谱法 区带
PH-区带 提取逆流色谱法：用于有机酸或碱的分 区带-提取逆流色谱法 区带 提取逆流色谱法： 固定相中加入酸 ），将样品 通过在固定相中加入酸（或碱）， 离。通过在固定相中加入酸（或碱），将样品 各组分保留在柱管内，而流动相中加入碱（ 各组分保留在柱管内，而流动相中加入碱（或 来根据各组分的PKa和疏水性把这些组分 和疏水性把这些组分 酸）来根据各组分的 和疏水性 逐一洗脱出来。 逐一洗脱出来。
7.4.4
高速逆流色谱法
高速逆流色谱技术(HSCCC) 高速逆流色谱技术 是一种不用任何同态载体的 液色谱技术， 液．液色谱技术，其原理是 基于组分在旋转螺旋管内的 相对移动而互不混溶的两相 溶剂间分布不同而获得分离， 溶剂间分布不同而获得分离， 其分离效率和速度可以与 HPLC相媲美。 相媲美。 相媲美
逆流色谱的技术-2013
半制备型逆流色谱法分离番茄红素
Chromatogram of the crude extract from marigold petal by preparative HSCCC. Solvent system: n-hexanedichloromethane-acetonitrile (10:3.5:6.5/v:v:v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: 800 rpm; sample:200 mg dissolved in 20 ml lower phase; retention of the stationary phase: 62.5%. Peak:5. lycopene
五、用途广，适应能力强
原则上，凡能进行萃取分离的体系，都能 用逆流色谱法分离
几乎任何互不相溶的两相溶剂系统都可以 使用，只是有的溶剂体系可能在一些特殊 型号的HSCCC仪器上可以取得更好的分离 效果。因此，可以通过改变溶剂体系的极
性，实现对不同极性物质的分离。
六、有制备能力
全球科学工作者正为之努力； 已有几个方案；
二、收率高
理论收率为 100％
滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱 方式予以完全回收
三、高效能
单个物质的基线分离
粗样可以直接上样而不会对柱子造成任何 损害；柱子可以用合适的溶剂（如甲醇） 很容易地清洗，然后注入新的溶剂后构成
新的柱体，重复使用。
四、工作条件温和
基本上是常温低压（液体定量泵 的压力）的液相操作
基本两相溶剂系统
辅助溶剂
非极性或弱极性物质 正庚(己)烷－甲醇
逆流色谱技术
操作复杂，需要高电压和特殊缓冲液。
03 逆流色谱技术的优势与局 限性
优势
分离条件温和
逆流色谱技术的分离条件相对温和，可以 避免一些对温度、压力敏感的化合物的分 解和变性。
高分离效率
逆流色谱技术采用连续分离的原理，可以 在一次分离过程中获得高纯度的产品，具 有较高的分离效率。
节约试剂
由于逆流色谱技术采用流动相作为分离介 质，不需要使用大量的固定相，因此可以 大大节约试剂成本。
工作原理
原理
基于液液分配平衡的原理，利用不同 组分在两相溶剂中的分配系数不同实 现分离。
过程
将两相溶剂在旋转的分离柱中连续流 动，样品注入其中，各组分因分配系 数差异在两相间进行反复分配，从而 实现分离。
应用领域
生物医药
用于分离和纯化生物活性物质 、药物中间体和药物成分等。
天然产物
用于分离和纯化植物、动物和 微生物中的次生代谢产物，如 色素、香精油、生物碱等。
食品中营养成分的分离
逆流色谱技术可用于分离食品中的营养成分，如脂肪酸、维生素、矿物质等，有 助于了解食品的营养价值和功能。
食品添加剂的检测
逆流色谱技术可以用于检测食品中的添加剂，如色素、防腐剂等，保障食品的安 全性和质量。
在其他领域的应用
环境样品的分析
逆流色谱技术可以用于分离环境样品 中的污染物和有害物质，如重金属、 农药残留等，有助于环境监测和污染 控制。
原理
利用物质在固定相上的吸附能力差异实现物质的分离。
应用
适用于分离具有不同吸附能力的物质，如黄酮类、皂苷类等。
优点
分离效果好，分离范围广。
缺点
固定相的制备较为困难，且重现性较差。
逆流电泳法
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第二节
分离与精制
二、分离方法
一 、两相溶剂萃取法
（1）原理：利用混合物中各成分在两相互不相溶的溶剂中分 配系数的不同而实现分离。萃取时如果各成分在两相溶剂 中分配系数相差越大，则分离效率越高。
（2）对无效成分溶解度小； （3）与有效成分不起化学反应；
（4）安全，成本低，易得。
第二章 提取分离方法 二、溶剂提取法的提取过程 将适宜的溶剂加入到药材中，溶剂通过渗透 扩散进入到 细胞中，溶解可溶性成分。形成细胞内外浓度差，产生渗透压， 细胞内溶质向细胞外扩散，最后达到动态平衡，细胞外溶剂就 溶解了大量溶质，从而把大量有效成分提取出来。
连续回流（Continuous Refluxing）
Assembly of Soxhlet extractor
Simple refluxing assembly
第一节
提取方法与技术
2.水蒸气蒸馏法（water-steam distillation ） 提取具有挥发性，能随水蒸气 蒸馏而不被破坏的成分，如挥发油。
玻 璃 珠
脱 脂 棉
CO2 钢 瓶 冷温槽
恒 温 箱
接 收 瓶
流量计
CO
2
P
高压泵 控温面板
小试实验装置图
• 上世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青
• 70、80年代，SFE越来越多的用于食品、香料的提取 • 90年代，开始从植物药中提取成分，如蛇床子、茵陈 蒿、桑白皮中提取成分。
中 小 型 SFE 装 置 图
• 具有穿透力强、选择 性高、加热效率高等 显著特点，而且其操 作简便、快速、节能、 高效。 • 缺点：工业化设备少、 成分变化、生物活性 变化。
工业生产用微波提取罐
第二节
分离与精制
二、分离方法
一 、系统溶剂分离法：
1、此法是选用3—4种不同极性的溶剂由低级性到高极性分步 对上述总提取液进行提取分离，是提取物中各组分按其在 不同极性溶team distillation refluxing assembly
第一节
提取方法与技术
3.升华法（ sublimation ） 用于具有升华性的成分提取，如香豆素，蒽醌， 樟脑等。
第一节
提取方法与技术
4.超临界流体提取法（supercritical fluid extraction
第一节 提取分离方法
三、常用溶剂的特点：
环己烷，石油醚，苯，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇 极性：小 ——————大 亲脂性：大 —————— 小 亲水性：小 —————— 大 （1）比水重的有机溶剂：氯仿。 （2）与水分层的有机溶剂：环己烷 ~ 正丁醇。 （3）能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁醇。 （4）与水可以任意混溶的有机溶剂：丙酮 ~ 甲醇。属于亲水性溶剂。 （5）极性最大的有机溶剂：甲醇 （6）极性最小的有机溶剂：环己烷 （7）介电常数最小的有机溶剂：石油醚 （8）常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂：正丁醇 （9）溶解范围最广的有机溶剂：乙醇
第一节
提取方法与技术
1、冷提：适用于受热不稳定的成分。 浸渍 (Maceration) 渗漉（Percolation）
Simple percolate assembly
第一节
提取方法与技术
工业生产用的渗漉装置
第一节
提取方法与技术
2、热提：煎煮法（Decoction） 回流（Refluxing）
第一节
提取方法与技术
5.超声提取法（ultrasonic extraction) 为物理过程，无化 学反应，生物活性不 减。大能量的超声波 产生的极大压力造成 植物物细胞壁及整个 生物体破裂，胞内物 质的释放、扩散及溶 解。
实验室用小型超声仪
工 业 生 产 用 超 声 仪
第一节
提取方法与技术
6.微波提取法（microwave extraction）
SFE)
利用溶剂在超临界条件下特殊的流体性能对样品进 行提取，为20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法。
超临界流体的密度与液体很接近，而它又具有气体
扩散性能
常用的临界流体有CO2、N2O、
乙烷、丙烷等。
超临界萃取实验装置与实验方法
实验装置－小试实验装置
超临界CO2萃取实验装置示意图
萃取柱 原 料
第一节
提取方法与技术
一、溶剂提取法（extraction with solvent）
1.相似相溶原理：根据相似者相溶原理，选择与化合物极 性相当的溶剂将化合物从植物组织中溶解出来。同时，由于某 些化合物的增溶或助溶作用，其极性与溶剂极性相差较大的化 合物也可溶解出来。 理想溶剂（ideal solvents ）： （1）对有效成分溶解度大；
①分配系数K值（即分配比）：溶质在两相溶剂中的分配比（K） 在一定温度及压力下为一常数
第二节
分离与精制
2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 2.1 影响分离的因素 ①分离因子β，分配系数K β= KA/ KB KA>KB, K=CU/CL （CU, CL被分离物质在上相和下相中浓度） 根据β值的大小可决定分离采用的方法: β≥100，简单的一次萃取，可基本分离. 100>β≥10，10-12次萃取，CCD法。 β≤2，100次以上萃取，DCCC法。
第二节
分离与精制
或用PC法求β值，选择理想分离条件。 • 纸色谱（PC）也叫纸分配色谱（PPC， Paper Partition Chromatography）。
第二章
提取、分离和鉴别方法
第二章 提取、分离和鉴别方法 目的要求 一、天然药物有效成分提取分离方法的原理—溶剂提取 法与水蒸气蒸馏法的原理、操作及其特点。 二、天然药物有效成分分离与精制——中草药有效成分 各种分离方法的原理。 三、掌握色谱技术中洗脱剂选择的原则。 重点：讲解各种层析方法（硅胶、聚酰胺、葡聚糖凝胶、 离子交换树脂、大孔树脂法及分配层析）和两相溶剂萃取法 的原理及方法。 难点：讲解各种层析方法和两相溶剂萃取法的原理。