十二指肠液K-ras、P53和P16基因联合检测在胆管癌诊断中的价值

胆管癌由于其解剖部位隐匿,早期诊断极为困难,临床病例多为中晚期患者,手术切除率低,预后差。

因此发展新的筛选和诊断手段,提高胆管癌的早期诊断率是改善胆管癌不良预后的关键。

利用分子生物学技术,对胆管癌患者胆汁和十二指肠液中的癌基因K⁃ras和抑癌基因P53、P16的突变状况进行联合检测,探讨其在早期诊断或筛查胆管癌中的应用价值。

材料与方法一、临床资料本组研究对象均为2004年2月至2005年2月住院病人,其中包括:①胆管癌组共30例,男/·临床试验·十二指肠液K⁃ras、P53和P16基因联合检测在胆管癌诊断中的价值薛平郑强卢海武胡以则【摘要】目的探讨十二指肠液标本中K⁃ras、P53和P16基因联合检测对胆管癌诊断的价值。

方法应用PCR⁃SSCP⁃银染法和PCR⁃RFLP法检测30例胆管癌患者和10例良性胆道疾病患者胆汁及十二指肠液标本中上清液及沉渣的K⁃ras、P53及P16基因突变状况。

结果胆管癌组胆汁标本的上清中K⁃ras、P53和P16基因突变及三基因联合检测的阳性率为56.7%、50%、33%和80%;相应的十二指肠液标本阳性率为43%、36%、20%和70%。

良性胆道疾病组仅胆汁标本检出K⁃ras基因突变1例,良恶性疾病组比较有显著性差异(P<0.005),胆管癌3种基因突变的检出率在上清组中明显高于沉渣组(P<0.001),对于胆管刷检阴性的胆管癌患者,联合检测胆汁中3种基因突变的阳性率仍高达66.67%。

结论十二指肠液K⁃ras、P53和P16基因联合检测有助于胆管癌的诊断。

【关键词】胆管癌;K⁃ras;P53;P16;十二指肠液Clinical singnificance in diagnosis of biliary tract carcinoma by detection of K⁃ras、P53and P16 gene mutations in duodenal juice Xue Ping,Zheng Qiang,LuHaiiwu,et al.Department of Hepatobiliary Surgery,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical college,GuangZhou 510260,China【Abstract】Objective To investigate the role of K⁃ras,P53,and P16gene of duodenal juice detection in diagnosis of biliary tract carcinoma(BTC).Methods The K⁃ras,P53and P16gene mutations in the bile and duodenal juice from30cases with BTC and10cases with benign choledocholithiasis were detected by PCR⁃SSCP⁃AgNO3staining or PCR⁃RFLP.Results The positive rates of K⁃ras,P53and P16gene mutations and combination assay with them in bile supernatant of patients with BTC were56%,50%,33%and83.3%,respectively.The positive rates of them in duodenal juice were43%,36%,20%and70%,respectively.However,K⁃ras gene mutation was detected in only one case with benign choledochlithiasis.Statistic analysis show there was significant difference in those gene mutations between BTC group and benign group(P<0.001).Positive rates of K⁃ras,P53and P16gene mutations were higher in the supernatant than that in the sediment(P< 0.001).For the negative of blie duct brushing in BTC,positive rate of combination assay with these gene mutations was still high(66.67%).Conclusions Combined assay of K⁃ras,P53and P16gene mutations in duodenal juice might be useful for diagnosis of BTC.【Key words】Biliary tract carcinoma;K⁃ras;P53;P16;duodenal juice基金项目:广东省科技计划项目(2003C3011)作者单位:广州医学院第二附属医院肝胆外科女为19/11,年龄30~89岁,平均(62±14)岁;②其他良性胆道疾病组(作对照组)共10例,男/女为6/4,年龄28~78岁,平均(54±15)岁,均为胆石症患者。

上述病例均经细胞学检查或手术探查证实。

胆管癌组的病例按照Bismuth分型,Ⅰ型13例,Ⅱ型7例,Ⅲ型A2例,Ⅲ型B3例,Ⅳ型5例。

二、方法1.标本来源:所有病例的十二指肠液标本均通过十二指肠引流管处获取。

胆管癌组的胆汁标本通过ERCP胆管插管后抽取,良性胆道疾病组的胆汁标本则通过术后“T”管引流处获取。

所有标本迅速于常温下2000r/min离心20min,分上清液或沉渣,冻存于-80℃以备DNA提取。

胆管癌组患者行ERCP检查同时行胆道刷检术作细胞学检查。

2.标本DNA提取:由⁃80℃取出标本,室温下溶解后,取1ml标本,按DNAzolR Reagent(Cat. No:10503⁃027,CAS.No:593⁃84⁃0,InvitrogenTM, US)说明书步骤提取DNA。

所有引物均由分子生物学实验室根据Pubmed的Genome数据库自行设计,并由上海生物工程公司合成。

3.K⁃ras基因第12密码子突变的检测:采用突变富集PCR⁃限制性片段长度多态性(restriction fragment length Polymorphism,RFLP)法,可以检测出第一外显子第12密码子的突变。

引物序列K R⁃F:5′⁃actgaatataaacttgtggtagttggacct⁃3′;K R31⁃R:5′⁃tcaaagaatggtcctggacc⁃3′;K R32⁃R:5′⁃tgcaccagtaatatg catat⁃3′。

经2次PCR及2次酶切反应,酶切产物行3%琼脂糖凝胶电泳,凡出现143bp突变带者,则认为存在K⁃ras基因第12密码子突变,否则认为其是野生型。

实验过程中以灭菌去离了水为PCR反应模板作阴性对照,每份标本均至少重复实验2次。

4.P⁃53基因突变检测:采用PCR⁃单链构象多态性(Single⁃strand conformation polymorphism, SSCP)银染法,分别检测P53基因第5,6,7,8外显子区域的突变。

引物序列:P53⁃5F:5′⁃tactcccctgccctcaac⁃3′;P53⁃5R:5′⁃ctgctcaccatcgctatct⁃3′;P53⁃6F:5′⁃ctgatttcctcactgattgctct⁃3′;P53⁃6R:5′⁃ctcaggcggctcataggg⁃3′;P53⁃7F:5′⁃cctcatcttggcctgtg⁃3′; P53⁃7R:5′⁃caagtggctcctgacctg⁃3′;P53⁃8F:5′⁃taatctacfggg⁃actgaaca⁃3′;P53⁃8R:5′⁃ttacctcgcttagtgctcc⁃3′。

主要步骤:①PCR扩增:根据上述引物,针对P53基因第5,6,7,8外显子区域分别进行PCR扩增;②制备非变性聚丙烯酰胺凝胶:第5,6,7,8外显子区域PCR扩增产物所需的电泳凝胶浓度分别为8%、10%、15%、8%;③电泳:PCR产物经变性处理后行垂直电泳,恒定电压80V,恒温15℃电泳8h;④硝酸银染色:电泳结束后,取下凝胶,按常规流程行硝酸银染色,显示电泳条带。

在同一次电泳,与正常标本条带位置相同则认为正常,与正常标本条带位置异常则认为存在变异。

4个外显子均为正常者判断为野生型,4个外显子中有一个存在异常则判断为突变型。

5.P16基因突变的检测:采用PCR⁃SSCP⁃银染法,检测P16第一外显子的突变。

引物序列:P16⁃1:5′⁃tggaaactggaagcaaatgt⁃3′;P16⁃2:5′⁃tgagctga⁃ggcaagaccg⁃3′。

方法同上。

6.统计学处理:2组异常率的比较用四格表2检验,3组异常率的比较用行列表2检验,以孕<0.05为差异具有显著性。

结果一、胆管癌组和良性胆道疾病组的检出率比较组别胆汁标本胆管癌组良性胆道疾病组十二指肠液标本胆管癌组良性胆道疾病组例数30103010K-ras56.7%(17/30)∗10%(1/10)43%(13/30)∗P5350%(15/30)∗36%(11/30)∗P1638%(10/30)∗20%(6/30)﹡三基因联合检测83.3%(25/30)∗∗10%(1/10)70%(21/30)∗∗注:与良性胆道疾病组比较∗<0.005,∗∗<0.001表1胆管癌和良性胆道疾病胆汁、十二指肠液中上消化液标本3种基因突变率(%)胆管癌组和良性胆道疾病组的胆汁标本和十二指肠液标本上清液中K ⁃ras、P53及P16基因突变相比较,不论是胆汁标本还是十二指肠液标本,单基因检测或三基因联合检测,其突变率均有显著差异(P <0.05);胆汁标本或十二指肠液标本相比各基因突变率相似,两两比较差异无显著性(P >0.05,表1)。

二、胆管癌组的胆汁标本和十二指肠液标本中上清液组与沉渣组K ⁃ras、P53及P16基因突变的检出率的比较胆管癌组3种基因突变率在胆汁及十二指肠液中上清液组明显高于沉渣组,两者比较差异有显著性(P <0.05,表2)。