变性梯度凝胶电泳技术的原理及其在畜牧业中的应用

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专题综述
变性梯度凝胶电泳技术的原理及其在畜牧业中的应用一朱南山， 等
V1 Region To Monitor Dynamic Changes in the Bacterial Population during Fermentation of Italian Sausages[J].App1 Environ Microbiol,2001,67(11): 5113-5121. [7] Zoetendal EG,Ben2Amor K,Akkermans AD,et al.DNA isolation protocols affect the detection limit of PCR approaches of bacteria in samples from the human gastrointestinal tract [J].Syst Appl Microbiol, 2001,24(3):405-410. [8] 王金全,蔡辉益,印遇龙,等.小麦日粮非淀粉多糖和木聚糖酶 对肉仔鸡肠道微生物区系的影响[J].畜牧兽医学报,2005,36 (10):1014-1020 [9] McCracken VJ,Simpson JM,Mackie RL,et al.Molecular Ecological Analysis of Dietary and Antibiotic-Induced Alterations of the Mouse Intestinal Microbiota [J].Nutr,2000,131:1862-1870. [10] 黄俊文.甘露寡糖对仔猪生长、免疫及肠道微生态的影响 [D].广付:华南农业大学,2004. [11] 何兴国.不同糖源对断奶仔猪生产性能的影响[D].北京:中 国科学院,2005. [12] 朱伟云,姚文,毛胜勇.变性梯度凝胶电泳法研究断奶仔猪 粪样细茵区系变化[J].微生物学报,2003,43(4):503-508. [13] Simpson JM,McCracken VJ,White BA,et al.Application of denaturing gradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbiota [J].Journal of Microbiological Methods,1999,36:167 -179. [14] 苏勇,朱伟云.仔猪哺乳期和断奶后胃中细茵和乳酸杆茵茵 群的变化[J].肠外与肠内营养,2006,13(1):1-4. [15] Kocherginskaya SA,Aminov RI,White BA.Analysis of the rumen bacterial diversity under tWo different diet conditions using denaturing gradient gel electrophoresis，random seguencing,and statistically ecology approaches[J].Anaerobe,2001,7:l19-1341. [16] 姚文,韩正康, AntoonDLAkkermans,等.应用变性梯度凝胶 电泳和 16S rDNA 序列分析对山羊瘤胃细茵多样性的研究 [J].中国农业科学,2004,37(9):1374-1378.
收稿日期 !2006-11-22
2.1 无需进行微 生物培养 部分微生物不 能 用 现有的培养方法进行分离培养。据报道，自然环境 中尚不可纯培养的微生物高达 85%~99%[4]。 一些 微生物的生长需要厌氧环境。 厌氧培养对于观察 茵群的多态性及动态变化是非常有限的。 而直接 从胃肠食糜样品中抽提总 DNA， 然后对 16S rRNA 的可变区进行 PCR 扩增， 通过 DGGE 进行分析，能 检测到难以或不能培养的微生物， 更能反映肠道 微生态群落结构的动态变化。 2.2 检测率高 由于传统鉴定技术对微生物描述 简单，外部特征不明显，因而只有很少的一部分细 茵能够被分离和鉴定。 Muyzer 等[2]用 DGGE 能检测 出 数量仅占总群落数 1%的微生物，Omar 等 [5]证实 PCR-DGGE 技术能检测大约为 1%~3%的微生物。 2.3 结果准确可 靠 传统 的生化 鉴 定方法 容易 出现假阳性或假阴性结果，主观性比较强，且会漏 掉一些不能培养的微生物。 PCR-DGGE 方法能客观 完整地鉴定微生物， 它根据参考茵株和样品微生 物 16SrRNA 的 PCR 扩增产物在凝胶中的相对位置 来进行判断结果也很直观。 若将凝胶上的条带切 割下来测序，然后与 Genebank 中的标准序列进行 比较，可以得出它们的遗传相关性。 2.4 与其它方法 结合 DGGE 可 以 和 许 多方法结 合，从而全面认识微生态的组成、优势茵群等。 这种 结合起来的方法，目前被认为是研究微生物真正的
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3 DGGE 的缺陷
PCR-DGGE 是一种快速可靠的比较细茵群落的 方法。 DGGE 条带再经割胶和测序，有助于人们了解 微生物多样性和巨大的未知微生物遗传资源。 由于 不能确切了解样品中大量细茵的系统发育关系和 群落的多样性，其敏感度相对较低。 采样和样品处 理可能会使 DNA 提取产生误差[7]，模板和扩增引物 的选择、处理片段大小的限制(不超过 1 Kb)、电泳 条件以及微生物不同序列 16S rDNA 基因多拷贝的 存在，都会对 PCR-DGGE 分析结果产生影响。只有占 整个群落细茵数量约 1% 或以上的类群能够通过 DGGE 检测到。同时有些细茵具有多操纵子，DGGE 能 将其在 PCR 时形成的不同序列分离开，可能过高的 估计环境中的微生物多样性[2]。
露寡糖、 纳豆茵能不同程度减缓断奶引起的细茵 种类和数量的减少， 两者合用时细茵种类及总数 的变化幅度最小，其生产性能优于其它各组。 利用 DGGE 技术发现， 乳糖能显著增 加回肠乳酸杆茵和 显著 降 低结肠大肠 杆 茵的数量[11]， 说明 乳 糖对肠 道微生物的作用要优于其它糖类。 利用 DGGE 还能反映肠道微生态的动态变化。 朱伟云 等 [12]采用 PCR-DGGE 技术 研究仔猪断奶前 后粪样中微生物区系的组成。 当仔猪哺乳时，同窝 仔猪之间具有相似的优势细茵群。 不同窝之间细 茵群差异较大， 说明母猪对其哺乳仔猪体内的优 势茵群有一定的影响。 断奶后，仔猪粪便 DGGE 图 谱上条带数量明显增多，个体间优势带位置，亮度 及数量上差异明显， 表明断奶后体内己形成各自 特征性的茵群。 Simpson 等[13]分析 DGGE 技术在研 究猪肠道微生物区系方面的应用条件， 研究猪的 年龄、 饲粮发生变化时不同个体肠道和粪样细茵 群组成变化。 图谱显示断奶前、断奶后及肥育猪的 肠道样品泳道中分 别 具有 4、2 及 2 条 独特 条带， 各年龄段图谱具有 10 条共同条带，断奶后与肥育 猪图谱还有 5 条共同条带，断奶前、断奶后及肥育 猪图谱各只有一条相同条带。 苏勇等[14]利用 PCR -DGGE 分析 7-35 日 龄仔猪胃 中细茵和 乳酸杆 茵 数量变化。 哺乳期胃中细茵条带较单一，优势茵为 相对高 GC 含量细茵，断奶后仔猪胃中的茵群数量 显著升高，并且优势茵属于 Escherichia 和 Streptococcus 属， 它们是引起仔猪发病的潜在病原 茵。 这可能是引起小肠茵群变化的一个重要原因。 乳酸杆 茵 DGGE 图谱 相似 性分析显示， 仔猪断奶 前、后胃中乳酸杆茵变化较小。 至断奶后 2 周，其 数量有所上升。 4.2 DGGE 在反刍动物研究中的应用 DGGE 技 术用于研究瘤胃细茵的遗传多样性和组成的变化 非常有效。 它能够定性描述瘤胃细茵种类的变化， 进一步将其与其它研究手段一起应用， 能更好地 揭示瘤胃微生物的功能。 Kocherginskaya 等[15]分 析了 饲喂两 种不同日粮的 阉公牛瘤胃液 样品的 DGGE 图谱。 4 头去势公牛的日粮为豆科和未本科 混合干草， 另 4 头的日粮包括了 20%的干草、52% 玉米、5%玉米油、3%矿物质和 20%玉米副产品。 图 谱显示至少有 16 条可分 辨的条带， 其中 5 条为 明显的优势带。 饲喂同种日粮的 4 头动物的 DGGE
中图分类号 ! S818.9 文献标识码 ! A!!
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文章编号 ! 1005-8567(2007)02-0014-03
变性梯度凝胶电泳 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE) 是 由 Fisher 和 Lerman 发明用于检测 DNA 突变的技术[1]，1993 年 Muyzer 等[2]首次将其用于分析土壤的微生物区系， 成为检测微生物多样性，的一种有效方法。近年来 开始运用于动物胃肠道微生物的研究，通过 DGGE 研究微生物数量及多样性， 了解肠道微生物的结 构和组成。 本文就 DGGE 技术的原理、优缺点及其 在畜牧业中的应用作一综述。
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
DGGE 的优点
1 DGGE 技术的原理
DGGE 是利用长度相同的双链 DNA 片段解链 温度不同的原理， 通过梯度变性胶将 DNA 片段分 离开来的电泳技术。在由低到高的变性梯度胶中， 双链 DNA 片断依据其序列的特异变性点溶化解 链， 单独的序列将在各自具特征的变性点开始溶 解。当双链 DNA 片段迁移到变性凝胶的一定位置， 达到解链温度时，开始部分解链，当迁移阻力与电 场力平衡时，DNA 片段在凝胶中基本上停止了迁 移， 这样不同序列的 DNA 片段就被 DGGE 有效分 离。 理论上讲，只要选择的电泳条件 （ 如变性剂梯 度、电泳时间、电压等）足够精细，仅有一个碱基 差异的 DNA 片段都可被分开。 用于 DGGE 分析的 PCR 引物的设计，一般可由 相应的计算机软件来进行，通常需要在引物的 5' 末端加上 40 bp 的 GC-Clamp，可使被分析的片段 差异的敏感度提高 1 倍[3]。 DGGE 一般采用 160V 电 压，电泳时间根据 DNA 片段长度及变性情况而定， 这样比较节省时间； 如果需要分辨比较细微的 DNA 片段，则采用低电压(如 100V)，电泳时间则相 应延长。 此外，TAE 电泳液 pH 值的恒定、电压的稳 定、变性剂梯度的平缓等因素对于 DGGE 条带的分 辨率均有较大的影响。