成熟中国对虾卵巢中卵黄蛋白的纯化
实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾和罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中的表达
实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾和罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中的表达李媛媛;蔡生力;刘红【摘要】Vitellin, as the major constituent of the yolk protein is to provide nutrition to the developing of embryos and early larve in crustaceans. Its source and biosynthesis regularity have been the focus of crustacean research in past decades. The accurate site for vitellogenin synthesis was investigated in two representative shrimp species Litopenaeus vannamei and Macrobrachium rosenbergii with real-time PCR in this experiment.Based on histological observation, the ovarian development was divided into six stages in L. vannamei (oogonium proliferation, previtellogenic, primary vitellogenic, secondary vitellogenic, mature, and recovery stages) and five stages in M. rosenbergii (previtellogenic, primary vitellogenic, secondary vitellogenic, mature, and gravid stages). It was found that both L. vannamei and M. rosenbergii expressed Vg-mRNA in hepatopancreas and ovary. In L. vannamei, the relative quantity of Vg-mRNA expression of each developmental stage was 1.1, 5.9, 10.4, 26.9, 85.3, and 1.5 in ovary, and 1.3, 3.2, 7.1, 37.2, 51.6, and 1.0 in hepatopancreas respectively. In M. rosenbergii, the relative quantity of Vg-mRNA expression of hepatopancreas in each ovarian developmental stage was 3.4, 12.6, 15.2, 38.9, and 2.9 compared to 1.0, 1.3, 1.7, 4.8, and 1.5 in ovary, respectively. In all examined shrimps the Vg-mRNA expression decreased sharply to the minimum at the last development stage. Theresearch confirmed that both penaeid shrimp(Litopenaeus vannamei) and caridea prawn(Macrobrachium rosenbergii) were able to synthesize the vitellin in ovary and hepatopancreas, and with the gonad development, the vitellin synthesis showed clear regularity.%卵黄磷蛋白作为卵黄蛋白的主要成分,可为甲壳动物胚胎和早期幼体发育提供能量,为研究其来源及合成规律,实验应用SYBR G reen Ⅰ荧光定量PCR法检测了凡纳滨对虾和罗氏沼虾性腺不同发育时期卵巢和肝胰腺两种组织中卵黄蛋白原mRNA的表达水平.结果发现,凡纳滨对虾和罗氏沼虾的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达.随着卵巢的发育,凡纳滨对虾卵巢中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前5个阶段不断增加,分别为1.1,5.9,10.4,26.9,85.0,恢复期急剧减少,为1.6.肝胰腺中的相对表达量也不断增加,分别为1.3,3.3,7.1,37.3,51.6,恢复期急剧减少,为1.0.罗氏沼虾肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前四个阶段不断增加,分别为3.4,12.6,15.2,38.9,抱卵期急剧减少,为2.9；而卵巢在整个发育过程中对卵黄蛋白原合成的贡献比较小,分别为1.0,1.3,1.7,4.8,1.5.研究表明,两种虾类的肝胰腺和卵巢均具合成卵黄蛋白的功能,而且在不同的卵巢发育阶段呈现明显的规律性.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2012(036)011【总页数】8页(P1667-1674)【关键词】凡纳滨对虾;罗氏沼虾;实时荧光定量PCR;卵黄蛋白原mRNA【作者】李媛媛;蔡生力;刘红【作者单位】上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306【正文语种】中文【中图分类】Q786;S917.4卵黄积累是包括甲壳纲、昆虫纲等节肢动物卵母细胞发育成熟的必要前提[1], 也是雌性个体生殖周期中的关键阶段[2]。
中国明对虾大颚器的组织学及孕酮和雌二醇的检测
收稿日期:2005204218;修订日期:2006208222资助项目:国家攀登计划B 类项目(编号:PDB62221);上海市教委重点学科建设项目(Y 1101)资助作者简介:蔡生力(1957—),男,浙江临安人;教授;主要从事海洋生物繁殖与发育生物学通讯作者:蔡生力,T el :021*********,E 2mail :slcai @sh 研究简报中国明对虾大颚器的组织学及孕酮和雌二醇的检测蔡生力1 赵维信1 杨丛海2(1.上海水产大学生命科学与技术学院,农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海 200090;2.中国水产科学院黄海水产研究所,青岛 266071)DETECTION OF PR OGESTER ONE AN D ESTRADIOL ,AN D OBSERVATION OFHISTOLOG Y IN THE MAN DIBU LAR ORG AN OF SHRIMPF ENN EROPENAEUS CHIN ENSISC AI Sheng 2Li 1,ZH AO W ei 2X in 1and Y ANG C ong 2Hai 2(1.The K ey Laboratory o f Aquatic G enetic Resources and Aquacultural Ecology (AGRA )Certificated by the Ministry o f Agriculture ,Shanghai Fisheries University ,Shanghai 200090;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute ,Chinese Academy o f Fisheries Sciences ,Qingdao 266071)关键词:中国明对虾;大颚器;组织学;孕酮;雌二醇K ey w ords :Fenneorpenaeus chinensis ;Mandibular organ ;Histology ;Progesterone ;Estradiol中图分类号:Q173 文献标识码:A 文章编号:100023207(2007)022******* LeR oux 于1968年首次描述了甲壳动物十足类的大颚器,并认为它与Y 2器官是两个不同的腺体,Byard 等[1]在研究了美洲龙螯虾(Homarus americnus )大颚器的超微结构后指出,甲壳动物大颚器是类似于昆虫咽侧体的内分泌器官。
卵黄抗体的提纯及应用
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Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃ葡萄球菌蛋白 Ｇ， 故使用 ＩｇＹ 可 以避免由抗哺乳动物 ＩｇＧ 抗体引起的干扰作用。用 ＩｇＹ 作 为 免 疫 学 检 测 工 具 ， 测 定 循 环 复 合 物 、类 风 湿因子和补体等， 可减少假阳性结果。 ２．１．２ 免疫治疗 因鸡抗体耐酸、耐热且性能稳 定， 可经口服用于预防或治疗年幼动物或人类的肠 道传染病， 如婴儿防病食品、龋齿预防、新生乳猪致 死 性 大 肠 杆 菌 感 染 的 预 防 以 及 鱼 病 治 疗 等 。特 别 是 抗生素或其它药物的使用 存 在 问 题 时 ， ＩｇＹ 成 为 首 选。在非典流行期间， 鸡卵黄抗体还被研制用于抑 制 ＳＡＲＳ 病毒。 ２．２ 取代哺乳动物抗体 禽类是潜在的抗体提供 者， 其免疫应答类似于哺乳动物。禽类可以作为任 何 抗 体 的 供 体 动 物 。如 ① 抗 人 肌 原 蛋 白 Ⅰ 的 抗 体 作 为试剂用于自动免疫诊断系统中； ②过氧化物酶标 记的抗马免疫球蛋白的 ＩｇＹ 已制成试剂盒， 用于马 性 病 的 诊 断 中 ； ③抗 新 城 疫 ＩｇＹ、抗 传 支 ＩｇＹ、抗 传 染性法氏囊病 ＩｇＹ 经荧光素异硫氰酸盐标记后， 用 荧光抗体技术诊断这些禽类病毒病。 ２．３ 在 兽 医 临 床 上 的 应 用 从 高 免 动 物 （ 如 兔 、 鸡 、牛 、羊 等 ） 的 血 清 或 初 乳 中 分 离 ＩｇＧ， 在 被 动 免 疫 治 疗 中 有 很 重 要 的 意 义 和 价 值 。但 这 些 来 源 提 供 的 ＩｇＧ 产 量 低 ， 成 本 高 ， 通 常 只 能 局 限 于 实 验 室 的 免疫学诊断和基础研究。近年来， 国内外学者就卵 黄抗体的研究和开发作了许多工作， 证明免疫鸡的 鸡蛋是提供特异性 ＩｇＧ 的最方便、最廉价的来源。 目前， 高免 ＩｇＹ 已广泛地应用于鸡传染性法氏囊病 （ ＩＢＤ） 、新城疫（ ＮＤ） 、鸭肝炎、小鹅瘟、犊牛腹泻、仔 猪 大 肠 杆 菌 病 、羔 羊 和 小 白 鼠 轮 状 病 毒 腹 泻 等 动 物 传染病的防治， 并取得了显著的效果。 ２．４ 在人类保健上的应用 大量研究结果显示， 鸡 ＩｇＹ 对病原体感染的防御无动物的种属差异， 故应 用鸡高免 ＩｇＹ 防治婴幼儿疾病是完全可行的。随着 ＳＰＦ 鸡群的使用， 用卵黄研制安全可靠的人用抗病 （ 尤其是肠道疾病） 生物制品必将获得广泛的应用。 ２．５ 用作饲料添加剂 用抗特定抗原并可直接饲 喂的鸡卵黄抗体作为替代抗生素的新型饲料添加 剂 正 在 引 起 人 们 的 关 注 。鸡 卵 黄 抗 体 是 产 蛋 母 鸡 被 免 疫 １５ｄ 左 右 产 生 的 ＩｇＹ， 且 较 快 达 到 高 峰 ， 可 产 生较长时间的免疫应答， 效价可维持数月至一年以 上， 其浓度活性及功能可通过对母鸡进行高免而加 以调节。鸡抗体可取代抗生素用作生长促进剂， 且
中科院南海海洋研究所发现激素调控对虾卵巢成熟新机制
中科院南海海洋研究所发现激素调控对虾卵巢成熟新机制在这项研究中，研究人员通过分析虾类卵巢组织，发现了一种激素调控的新机制。
这种机制涉及到一种名为甲状腺素的激素的作用。
虽然甲状腺素一直以来都被认为是调节脊椎动物的新陈代谢和生长发育的激素，但在虾类卵巢中的作用却一直没有被发现。
研究人员通过实验发现，在虾类卵巢中，甲状腺素的含量会随着卵巢的成熟而增加。
这种增加的甲状腺素通过调节卵巢细胞的生长和分化来促进卵巢的发育。
研究人员进一步发现，甲状腺素会激活一系列与卵巢发育相关的基因，从而进一步促进卵巢的成熟。
这项研究的发现对于虾类养殖具有重要意义。
虾类是全球重要的渔业资源之一，虾类养殖在很大程度上依赖于人工控制卵巢的发育和成熟过程。
通过深入了解虾类卵巢发育的新机制，研究人员可以提供更有效和可持续的虾类养殖方法，从而提高虾类养殖的产量和质量。
此外，在海洋生态系统保护方面，该研究的发现也具有重要意义。
虾类在海洋食物链中占据着重要的位置，其卵巢的成熟过程对于维持海洋生态平衡具有重要影响。
通过深入了解虾类卵巢成熟的调控机制，我们可以更好地保护海洋生态系统，保护虾类的生态角色。
这项研究的发现还揭示了甲状腺素在非脊椎动物的作用，对于我们理解激素调控机制的多样性具有重要意义。
目前，大多数关于激素调控的研究都集中在脊椎动物上，对于非脊椎动物的了解仍然非常有限。
这项研究的发现为我们深入研究非脊椎动物的激素调控机制提供了新的思路和方法。
综上所述，中科院南海海洋研究所的这项研究发现了一种新的激素调控虾类卵巢成熟的机制。
这项研究对于虾类养殖和海洋生态系统保护具有重要意义，并为我们对激素调控机制的多样性进行更深入的研究提供了新的思路和方法。
对虾养殖生物学03(生殖营养学)
➢ 一、甲壳的机械屏障作用
➢ 二、滤过作用
➢ 滤集在鳃、血窦和淋巴器官中，防止其扩散。携 带异物的血淋巴经鳃管入鳃轴，再经二级血管进 入二叉分枝的鳃丝中，异物被滤在鳃血窦和鳃丝 末端膨大的囊状结构中。在正常情况下，这些囊 状结构是空的，没有血细胞游走；有异物存在时， 鳃腔中的血细胞游走到顶端结构中进行吞噬作用， 清除异物，或到蜕皮时一同蜕掉。定期检查鳃腔 中血细胞数量可监测病害的发生。
➢ 性成熟期间，肝胰脏中的某些R-细胞特化成卵黄发生细胞 （R-细胞的结构和作用见本章第四节），主要合成卵黄蛋 白——卵黄磷蛋白。卵黄磷蛋白与多不饱和磷酸甘油酯结合。 脂动员成高密度脂蛋白后由肝胰脏输出，使肝胰脏中总脂、 蛋白和糖原含量减少，血淋巴中磷酸甘油酯增加。
2021/6/20
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卵巢成熟期间脂类和蛋白质代谢动力学
➢
➢ 热休克蛋白(heat shock protein)：保守的蛋白分子家族——管 家蛋白(house-keeping protein)、媒人蛋白(matchmarker protein)、分子伴侣(molecular chaperone)。环境与病害严重 加剧了对热休克蛋白的研究。
➢20半21/免6/20疫反应：活下来的病虾能产生抗病毒力——黄海1号等的9
➢ 2）卵巢和无节幼体中脂肪酸的组成与中肠腺相似，即n-3 HU FA的含量和n-3/n-6比例较高。但卵巢中n-3/n-6比中肠腺高， 且性成熟期间卵巢中许多脂肪酸的含量变化显著：14：0和16： 0中度增加，15：00有多有少；SFA的总比例不变；16：1n-7 增加，18：1n-7波动，18:1n-9减少；MUFA和22：n-6增加， 而ARA减少，22：5n-6波动；随着性成熟n-6FA减少，导致 PUFA总比例下降；n-3FA和n-3HUFA总量不变。产后亲虾脂 肪酸组成没有显著变化，无节幼体的脂肪酸组成与成熟卵相同。
中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)卵黄发生前期与消退期卵巢和肝胰腺消减文库的初步构建及分析
摘 要： 利 用抑 制性 消减杂 交技 术 （ ｓ ｓ Ｈ） 分别 对 中国明对 虾在 卵黄 发生 的两 个 关键 时期 （ 卵黄 发 生前期 和 消退 期 ） 构 建 卵巢 ｎ ｋ 进行Ｂ Ｌ Ａ Ｓ Ｔ ｘ 同源 比较 并利 用ＧＯ 分 析进ｈ ｅ Ｇｅ ｎｅ Ｏｎ ｔ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ． Ｔｈｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｄ ｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｌ ｌ ｙ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｏ ｆ ｓ ｕ ｂ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｉ ｂ ｒ ａ ｒ ｙ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ａ ｃ ｅ ｏ ｒ ｄ ａ ｎｃ ｅ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｏ ｖ ａ ｒ ｉ ａ ｎ
对虾卵巢的发育过程是怎样的-
对虾卵巢的发育过程是怎样的?
对虾的卵巢发育一般根据卵巢的形态、颜色可分为若干个期别，在每个期别中都有相应的细胞学及发生学的变化。
通常将对虾卵巢发育分为以下各期：
形成期：此期指卵巢形成阶段。
中国对虾体长为15毫米左右即可从组织切片中观察到初始的、将发育成卵巢的细胞群。
此时的卵巢外观不可见。
增殖期：此期卵原细胞多次分裂增殖，发育成卵母细胞，卵巢渐渐增大，解剖对虾时可以看到透明的线状卵巢。
小生长期：此期内卵母细胞发育，体积逐渐增加。
卵巢体积增大，条状卵巢已经可从体外直接看到。
大生长期：此期内卵母细胞开始积累卵黄，并由于卵黄的增加而使卵径增大。
卵巢体积迅速增大、颜色加重，由土黄色渐渐变为嫩绿色、黄绿色。
在生产中可分为大生长初、中、末三期。
成熟期：卵黄积累在此期内已经完成，卵细胞开始成熟分裂，并逐渐游离。
卵巢体积膨大至最大，颜色转为褐绿色、黑绿色。
此期卵巢在环境适宜条件下很快即可产卵。
恢复期：又称产后期。
成熟卵子产出后，卵巢体积缩小，颜色消失，内部另一批卵母细胞又开始进入生长期并通过积累卵黄，再次成熟，再次产卵。
在一个繁殖季节里，对虾卵巢可以多次成熟，多次产卵。
在条件适宜的情况下，产过卵的对虾可以在7-10天内再次成熟并产卵。
中华锯齿米虾卵巢发育过程中卵黄蛋白积累的研究
泳洗脱法从其成熟卵巢中获得卵黄蛋白!6GUY::GE%6E"%制 备 多 抗%进 行 双 向 免 疫 扩 散 和 免 疫 印 迹 试 验%结 果 显
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齿米虾进行解剖%免疫组织化学技术检测分析显示%仅%#W的卵巢中出现 免 疫 阳 性 反 应%说 明 该 阶 段 的 卵 巢 中
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卵 巢 发 育 过 程 中 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 积 的 时 间 节 点 %为 中 华 锯 齿 米 虾 卵 巢 发 育 的 研 究 提 供 基 础 资 料 &
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卵黄抗体的制备实验报告
卵黄抗体的制备实验报告
实验目的：
本实验旨在制备出卵黄抗体，为后续的生物学研究提供基础。
实验原理：
卵黄抗体是指针对卵黄中特定抗原的抗体。
制备卵黄抗体的过程中，首先需要将卵黄分离出来，并进行纯化处理。
接着将纯化后的卵黄制成免疫原，并将其注射到动物体内，使其产生相应的抗体。
最后，用相应的方法将卵黄抗体分离出来。
实验步骤：
1.卵黄的分离与纯化
将新鲜鸡蛋打开，分离出卵黄，并将其放入离心管中。
然后，用生理盐水将卵黄稀释，离心，去除卵黄中的杂质。
最后，用离心法或沉淀法将卵黄纯化。
2.卵黄免疫原的制备
将纯化后的卵黄用PBS缓冲液稀释至适当浓度，加入适量的胶体铝溶液并搅拌混合，静置一段时间，使胶体铝与卵黄充分结合。
最后，用PBS缓冲液将其稀释至适当浓度，以备注射。
3.动物的免疫注射
将制备好的卵黄免疫原注射到小鼠或兔子等适宜的动物体内。
注射后，需要进行多次免疫，以增强动物产生抗体的能力。
4.卵黄抗体的分离
将免疫动物的血清收集，离心去除红细胞，得到血清。
接着，用卵黄抗原进行免疫沉淀或免疫吸附，分离出卵黄抗体。
实验结果：
经过以上步骤，我们成功制备出了卵黄抗体，并用酶联免疫吸附实验对其进行了检测。
检测结果显示，卵黄抗体的纯度和活性均较高，可以用于后续的生物学研究。
实验结论：
本实验成功制备出了高纯度、高活性的卵黄抗体，为后续的生物学研究提供了基础。
同时，本实验也展示了免疫学的基本原理和操作方法，对我们深入了解生物学研究具有重要意义。
十足目甲壳动物卵黄蛋白原的生化特性及生物合成
十足目甲壳动物卵黄蛋白原的生化特性及生物合成蔡生力;刘红【摘要】十足目在甲壳动物中种类最多,经济价值最大,分为枝鳃亚目(对虾类)和腹胚亚目(真虾、螯龙虾、蟹类)两大类.十足目种类卵黄蛋白原基因cDNA全长基本都在8kb左右,编码2500～2600个氨基酸组成的多肽,具有高度保守性.然而这两类生物的卵黄发生机制却存在显著差异.人工育苗过程中,对虾类卵巢不易发育,通常需要切除眼柄促熟,而腹胚亚目种类容易成熟甚至需要控制早熟.对虾类的卵黄蛋白原由卵巢和肝胰腺共同合成,一般卵巢贡献更大.尤其在卵巢发育前期,卵巢合成卵黄蛋白原较肝胰腺显著旺盛,具有“卵巢内源基因表达型”的特征.在真虾等腹胚亚目种类中,卵巢虽然也参与合成卵黄蛋白原,但以肝胰腺为主,绝大多数种类肝胰腺的贡献率超过90％.本文探讨了两类甲壳动物在卵黄发生机制中的显著差异与其在人工控制条件下性腺发育的不同表现之间的相互关系.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2017(041)001【总页数】9页(P150-158)【关键词】甲壳动物;卵黄蛋白原;卵巢发育;生化特性【作者】蔡生力;刘红【作者单位】上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306【正文语种】中文【中图分类】S917.4十足目是甲壳动物中种类最多(8000～10 000种)、进化位阶最高、经济价值最大的一个生物类群[1]，目前开展人工养殖的种类几乎全都出自十足目如：枝鳃亚目(Dendrobranchiata)的对虾类(Penaeiodea)、腹胚亚目的真虾类(沼虾、白虾)、螯龙虾类以及蟹类等。
一个非常值得关注的现象是属于枝鳃亚目的对虾类中的多数种类如斑节对虾(Penaeus monodon)、日本囊对虾(Marsapenaeus japonicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等，在人工控制条件下卵巢发育非常困难，生产上通常需要切除眼柄才能促使亲虾卵巢发育成熟，而腹胚亚目的种类如真虾类(Caridea)、螯虾类(Astacidea)、龙虾类(Palinura)、短尾类(Brachyura)卵巢很容易成熟，生产上还常因为其卵巢过早成熟，需要通过控制温度和营养来调控。
中华锯齿米虾卵黄蛋白的纯化鉴定
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中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子克隆与分析
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中 国 明对 虾 卵 黄 蛋 白原基 因启 动 子 克 隆 与分 析
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河北 大 学 学报 （ 自然科 学版 ）
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２ ０ １ ３
第 ３ ３卷
第 ２期
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｉ ｎ ｖｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｔ ｈｅ ｍｅ ｃ ｈａ ｎ ｉ ｓ ｍ ｏ ｆ ｔ ｈｅ ｅ ｘｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｇ ｕｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｆｅ ｎｎ ｅ ｒ ｏ ｐｅ ｎａ ｅ — Ｕ Ｓ ｃ ｈｉ ｎ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ｖ ｉ ｔ ｅ ｌ ｌ ｏｇ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ｅ ｎｅ，ｔ ｈ ｅ ｐｒ ｏ ｍｏｔ ｅ ｒ ａ ｎｄ ｔ ｈｅ ｕｐ — ｓ ｔ ｒ ｅ ａ ｍ ｒ ｅ ｇｕ ｌ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ １ １ ０ ０ ｂ ｐ ｗｅ ｒ ｅ ａ ｍｐｌ ｉ — ｌｅ ｆ ｄ ｂ ｙ Ｇｅ ｎ ｏｍｅ Ｗａ ｌ ｋｅ ｒ ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ．Ａ ｎ ａ ｌ ｙｓ ｉ ｓ ｓ ｈｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈａ ｔ ｔ ｈ ｅ“ＴＡＴＡ ｂｏ ｘ”ｗａ ｓ ｌ ｏ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ａ ｔ一 ３ ０一 一 ２ ４ ｂ ｐ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｆ ｒ ｏｎｔ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ａ ｎｓ ｃ ｒ ｉ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｉ ｔ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｉ ｔ ｅ，ｂｕｔ ｔ ｈｅ“ ＣＡＡＴ ｂ ｏｘ ”ａ ｎｄ“ＧＣ ｂｏ ｘ”ｗｅ ｒ ｅ ａ ｂｓ ｅ ｎ ｔ ．Ｍｅ ａ ｎｗｈｉ ｌ ｅ ， ａ ｍｏ ｎｇ ｔ ｈｅ ｕ ｐｓ ｔ ｒ ｅ ａ ｍ ｒ ｅ ｇｕ ｌ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｒ ｅ ｇ ｉ ｏ ｎ，ｔ ｈｅ ｒ ｅ ｗｅ ｒ ｅ ａ ｆ ｅ ｗ ｃ ｉ ｓ — ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ ｅ ｌ ｅ ｍｅ ｎｔ ｓ ｗｈｉ ｃ ｈ ｍｉ ｇ ｈｔ ａ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｐｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ，ｓ ｕｃ ｈ ａ ｓ ＮＦ— Ｊ ｃ Ｂ，ＹＹ １，ＳＰ１，ａｎ ｄ Ｓ Ｏ ｏｎ ． Ｔｈｅ ｓ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｌ ａ ｉ ｄ ｔ ｈ ｅ ｆ ｏ ｕｎ ｄａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｏ ｒ Ｕ Ｓ ｔ ｏ ｓ ｔ ｕ ｄｙ ｔ ｈｅ ａ ｃ ｃ ｕ ｍｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｖｉ ｔ ｅ ｌ ｌ ｉ ｎ ａ ｎｄ ｔ ｈ ｅ ｏ ｏｇ ｅ ｎｅ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ Ｆｅ ｎｎ ｅ ｒ ｏ ｐｅ ｎ ａ ｅ ｕ ｓ ｃ ｈｉ ｎｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ｉ ｎ ｄｅ ｐｔ ｈ ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄｓ ：ｖ ｉ ｔ ｅ ｌ ｌ ｏ ｇｅ ｎ ｉ ｎ；Ｇｅ ｎｏ ｍｅ Ｗ ａ ｌ ｋｅ ｒ；ｐ ｒ ｏ ｍｏｔ ｅ ｒ ；ｃ ｉ ｓ — ａ ｃ ｔ ｉ ｎｇ ｅ ｌ ｅ ｍｅ ｎｔ
卵黄抗体的分离提取和纯化方法
卵黄抗体的分离提取和纯化方法
卵黄抗体的分离提取和纯化是一种重要的实验技术，用于从蛋黄中获取纯化的抗体。
以下是一种常见的卵黄抗体分离提取和纯化的方法。
首先，收集需要提取卵黄抗体的鸡蛋，并分离出蛋黄。
接下来，利用一种物理方法，如离心或冷冻解冻循环，将蛋黄细胞破裂开放，使得抗体被释放到溶液中。
然后，使用晶体胶过滤或离心的方法，去除残留的细胞碎片和大分子物质。
接下来，使用一种亲和层析技术，例如蛋白A/G层析，选择性地吸附卵黄抗体在固定相上，在此过程中可以选择不同的缓冲条件和负载材料，以便优化抗体与固定相之间的亲和性。
随后，通过洗脱步骤，用适当的洗脱缓冲溶解固定相上的抗体，使其从固定相上脱落，得到纯化的卵黄抗体。
最后，通过浓缩和纯化步骤，使得卵黄抗体的浓度得到提高，并去除可能的污染物。
综上所述，卵黄抗体的分离提取和纯化方法包括蛋黄细胞破裂、去除残留物、亲和层析、洗脱、浓缩和纯化等步骤。
这些方法可以有效地提取和纯化卵黄抗体，为后续的实验研究和应用提供优质的抗体材料。
中华锯齿米虾卵巢发育过程中卵黄蛋白积累的研究
中华锯齿米虾卵巢发育过程中卵黄蛋白积累的研究李超;朱杰;陈娇;杨炎;张晗;穆淑梅;康现江【摘要】The aim of this study was to disclose the accumulation of vitellin (Vn) in the developmental ovary of Neocaridina denticulate sinensis.Vn was obtained from the mature ovary by electrophoresis eluting,and then antibody of Vn were prepared.Vn of N.denticulate sinensis was found to be of tissue specificity and species specificity detected by double immunodiffusion test and Western blot.Immunohistochemistry was used to analyze the accumulation of Vn in the ovaries of 12 d,32 d,43 d,55 d,70 d and 82 d shrimps after hatching.The results showed that Vn-immunopositive reaction only appears in the ovaries at 82 d,that is,Vn was accumulated in this ovary stage.The results were consistent with the toluidine blue staining during the same period.This research threw light on different phase of ovarian development in N.denticulate sinensis,and mastered the accumulation time of Vn,which provides basic data for the development of ovary in this species and makes clear the accumulation timeline of Vn.%为了研究中华锯齿米虾(Neocaridina denticulata sinensis)卵巢发育过程中卵黄蛋白的积累情况,采用电泳洗脱法从其成熟卵巢中获得卵黄蛋白(Vitellin,Vn),制备多抗,进行双向免疫扩散和免疫印迹试验,结果显示,中华锯齿米虾的卵黄蛋白具有物种特异性和组织特异性.分别对孵化后12,32,43,55,70和82 d 的中华锯齿米虾进行解剖,免疫组织化学技术检测分析显示,仅82 d的卵巢中出现免疫阳性反应,说明该阶段的卵巢中存在卵黄蛋白;用甲苯胺蓝染色分析同期结果显示与该结果一致.本研究旨在了解中华锯齿米虾卵黄蛋白在卵巢发育过程中累积的时间节点,为中华锯齿米虾卵巢发育的研究提供基础资料.【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2018(041)002【总页数】5页(P94-98)【关键词】中华锯齿米虾;卵黄蛋白;双向免疫扩散;免疫印迹;免疫组化【作者】李超;朱杰;陈娇;杨炎;张晗;穆淑梅;康现江【作者单位】河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002【正文语种】中文【中图分类】Q954.43+2;Q172卵黄是卵生动物胚胎及幼体发育早期必需的营养物质，储存于卵细胞中，其主要成分是卵黄蛋白(Vitellin, Vn)。
中国龙虾卵子发生及卵黄发生的超微结构观察
触面积， 利于核、 质之间的物质交换。核仁代谢产物 通过核孔输送到卵质中， 形成大量游离核糖体。核 糖体是合成蛋白质的重要细胞器， 大量游离核糖体 的出现为卵黄的形成提供场所和物质条件 16 。长 毛对虾 11 、 凡纳滨对虾 9 在其卵黄发生过程中卵核 也 有 类 似的 变 化。而 锯 缘 青 蟹 4 、 尖头蟹 （ Libinia
第5期
姜永华等： 中国龙虾卵子发生及卵黄发生的超微结构观察
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成分多样的泡状， 泡内逐渐沉积低电子密度絮状物 或高电子密度颗粒， 最后分别演化成脂滴和卵黄粒； 有的溶酶体将其吞噬物先消化分解为多个髓样结 构， 然后髓样结构逐渐变致密， 最后演化成多个卵黄 粒 （ 图版 Ⅰ-5， 图版Ⅱ-2、 6、 7） 。 2.2.3 线粒体 线粒体是最晚形成卵黄粒的细胞 器， 未见其形成脂滴的过程。线粒体腔内先沉积低 电子密度的絮状物， 使基质浓度增高， 同时嵴断裂成 小泡状融入腔中， 然后小泡的电子密度不断增高， 形 成致密的空心球状散布在线粒体基质中， 最后充满 整个线粒体腔并与基质融合在一起， 形成了致密的 卵黄粒 （ 图版 Ⅰ-7， 图版Ⅱ-2、 8） 。 2.2.4 游离核糖体 游离核糖体呈粗颗粒状散布 在各细胞器之间， 主要参与形成卵黄， 未见其形成脂 滴。核糖体形成卵黄的方式主要有 2 种， 一种是粗颗 粒逐渐聚拢并互相融合在一起， 直接形成大小不等 的致密卵黄粒； 另一种是粗颗粒进入溶酶体、 粗面内 质网及小囊泡中， 作为卵黄前身物间接参与形成卵 黄粒 （ 图版 Ⅰ-9， 图版Ⅱ-2、 3、 6） 。 2.2.5 高尔基体 高尔基体扁平囊和大小囊泡均参 与卵黄粒的形成。扁平囊内先沉积中等电子密度的 絮状物， 然后从两端通过芽生的方式断裂成许多小 囊泡， 这些小囊泡有的直接演变成小卵黄粒， 有的进 入溶酶体或粗面内质网间接参与卵黄粒的形成。高 尔基体大泡通过沉积粗颗粒的方式直接形成大的卵 黄粒 （ 图版 Ⅰ-8， 图版Ⅱ-2、 9） 。 2.2.6 卵质膜的胞饮作用 卵质膜的胞饮作用发生 在卵黄膜形成之后， 即卵黄发生中、 后期， 是中国龙 虾获取外源性卵黄物质的主要方式。卵质膜变得 凹凸不平， 将卵周隙中的物质包裹形成许多吞饮泡， 输送到卵质中， 直接或间接参与形成卵黄粒 （ 图版 Ⅱ-10） 。 3 讨论 3.1 卵核变化与卵黄发生的关系 中国龙虾卵子发生过程中卵核的核膜由平滑变 为凹凸不平， 局部形成核膜泡， 籍以增加与卵质的接
对虾的性腺发育过程是怎样的
对虾的性腺发育过程是怎样的对虾的性腺从仔虾后期即开始形成，雌雄开始分化。
自然海区中的中国对虾雄性精巢到当年10月即成熟，颜色为白色；雌性生殖腺到翌年4月才完全成熟。
卵巢的发育阶段不同，卵巢的体积和色泽也有明显的变化。
通过外观和组织学观察，可将卵巢成熟度分为六期。
①I期（增殖期）：主要特征为卵巢形成，卵原细胞不断分裂，数量增多，细胞核较大。
卵巢为线状，无色透明。
②Ⅱ期（发育早期）：为半透明或白浊色条状卵巢。
卵母细胞质增多，细胞核仍较大。
③Ⅲ期（发育期）：卵巢体积逐渐增大，约占腹一节宽的2/5 - 3/5．颜色由浅黄色变为深绿色。
卵母细胞内细胞质增多，并出现卵黄。
④Ⅳ期（近成熟期）：卵巢体积进一步增大，约为腹一节宽的4/5，颜色为深绿色，卵黄粒较前增多、增大。
⑤V期（成熟期）：卵巢体积达到最大，约与腹一节等宽，颜色为褐绿色，卵巢表面具有明显的凹凸。
⑥Ⅵ期（衰复期）：卵巢萎缩，呈黄白色，卵巢内卵为小生长期的卵母细胞。
在条件适宜情况下重复3-5期的发育过程。
图4-4为不同发育阶段的中国对虾卵巢形态。
影响对虾性腺发育的因素很多，有外界环境和内部机制因素等。
卵巢的发育速度是随水温的升高而加快的。
据报道，室内亲虾人工越冬试验，在水温14 -15℃的水温，卵巢成熟比自然海区提前35天产卵；水温16 - 18℃，提前45- 50天产卵；水温18-20℃，提前70天左右产卵。
饵料的质量与数量也影响对虾的性腺发育及所产卵的质量。
当饵料供应不足时，对虾性腺不仅发育慢，而且还可能退化。
一旦饵料供应充足，在适宜条件下对虾性腺发育又能很快恢复。
此外，对虾性腺发育还与对虾眼柄中X器官功能状态有关，切除眼柄可促进卵巢很快发育。
β-葡聚糖在中国对虾(Penaeus chinensis)育苗中的应用
β-葡聚糖在中国对虾(Penaeus chinensis)育苗中的应用王新霞;谭北平;麦康森;徐玮;张文兵;马洪明;刘付志国;艾庆辉【期刊名称】《高技术通讯》【年(卷),期】2004(014)004【摘要】分别用5种不同浓度(0, 0.1, 0.3, 0.5, 1mg/ml)的β-葡聚糖溶液对中国对虾蚤状、糠虾幼体进行3h浸浴,48h后用浓度为5.9×106cfu/ml的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行攻毒.攻毒后再养殖48h.结果显示,0.1、0.3和0.5mg/ml处理组均显著提高(P<0.05)蚤状和糠虾幼体攻毒后的存活率,其中,0.3和0.5mg/ml的处理组还显著提高(P<0.05)蚤状幼体的变态率和生长,但对糠虾幼体生长的影响不显著(P>0.05).本研究结果表明,β-葡聚糖可以作为免疫增强剂在中国对虾育苗阶段使用,建议浸浴使用的浓度为0.3～0.5mg/ml.【总页数】5页(P71-75)【作者】王新霞;谭北平;麦康森;徐玮;张文兵;马洪明;刘付志国;艾庆辉【作者单位】中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,青岛,266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,青岛,266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,青岛,266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,青岛,266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,青岛,266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,青岛,266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,青岛,266003;中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,青岛,266003【正文语种】中文【中图分类】S945.46【相关文献】1.成熟中国对虾(Penaeus chinensis)卵巢中卵黄蛋白的纯化 [J], 柳峰松;武金霞;谢松;房宝玲;黄增瑞;吴琛2.中国对虾（Penaeus chinensis）卵子孵化和无节幼体变态环境中锌离子… [J], 高成年;曲克明3.中国明对虾（Penaeus chinensis kishinouye）Sox基因PCR-SSCP分析条件优化的研究 [J], 朱琴;汪桂玲4.中国明对虾(Penaeus chinensis kishinouye)Sox基因PCR-SSCP分析条件优化的研究 [J], 朱琴; 汪桂玲5.中国对虾(Penaeus chinensis)糠虾肌肉组织中球形病毒的超微结构研究 [J], 姜明;汝少国;刘晓云;范瑞青;李永棋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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成熟中国对虾(Penaeus chinensis )卵巢中卵黄蛋白的纯化柳峰松1,武金霞1,谢 松1*,房宝玲2,黄增瑞1,吴 琛1(1.河北大学生命科学学院,河北保定 071002; 2.邯郸教育学院教务处,河北邯郸 056000)摘 要:用层析(SephadexG-150,DEAE-Cellulose-52)和电泳洗脱2种方法分别从成熟中国对虾卵巢中纯化得到了一种卵黄蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测表明,卵黄蛋白出现在SephadexG-150的第1个洗脱峰和DEAE-Cellulose-52的0.4mol/L 和0.5mol/L NaCl 洗脱峰处.比较了这2种方法的优缺点:层析法可用于蛋白的大量制备,电泳洗脱能够得到高纯度的蛋白.并对与其结合的类胡萝卜素的稳定性进行了讨论.关键词:中国对虾;卵黄蛋白;纯化;层析;电泳洗脱中图分类号:Q 492.5 文献标识码:A 文章编号:1000-1565(2001)04-0406-05雌性蛋白是某些动物雌体在生殖季节所产生的一种特异蛋白,包括存在于卵巢中的卵黄蛋白(Vitellin,Vn)和它的前体物质)))卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg),Vg 可能由卵巢或卵巢外某些组织产生,在卵巢发育后期,被卵巢中的卵母细胞吸收后经剪切修饰,转化成Vn.Vn 是虾卵的主要成分,是胚胎发育的重要营养源,而且在对虾孵化后的36~48h 内,无节幼体完全依赖于残余的卵黄为生,所以Vn 的数量和质量对于维持虾类早期的生命至关重要[1].目前已从日本对虾、斑节对虾、南美白对虾、短沟对虾等种类的卵巢或卵中分离纯化得到了Vn.Vn 的纯化方法很多,常用到的方法主要有以下几种:蔗糖加EDTA 匀浆)冷冻离心)饱和硫酸铵沉淀法[2];密度梯度超速离心法[3];凝胶过滤)离子交换层析法[4];D-型大柱聚丙烯酰胺电泳法[5].关于对虾Vn 的生化特性也有一些描述,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后的苏丹黑染色和高碘酸-希弗氏试剂染色,证明对虾的Vn 是一种脂糖蛋白,另外通过测定在480nm 的光吸收可证明这种蛋白结合有类胡萝卜素辅基,此蛋白相对分子质量在200~600kD 之间,亚基个数因种类和研究方法不同有2~11个不等[8-10].本文分别利用层析和电泳洗脱2种方法对成熟雌性中国对虾卵巢中的Vn 进行了纯化,得到了高纯度的Vn,为Vn 的进一步研究奠定了基础.1 实验部分1.1 材料中国对虾卵巢分别于3月份和11月份采自山东省荣成海珍育苗场,成熟中国对虾卵巢饱满,呈墨绿色;未成熟对虾卵巢呈白色细线状,尚未有卵黄物质积累.卵巢取出后-70e 保存备用.收稿日期:2001-06-20基金项目:河北省自然科学基金资助项目(398135,300083)作者简介:柳峰松(1976-),男,河北任丘人,河北大学在读硕士研究生.*通讯联系人 E-mail:xiesong.bio@第21卷 第4期2001年 12月河北大学学报(自然科学版)Journal of H ebei University(Natural Science Edition)Vol.21No.4Dec.20011.2 仪器ECP3000型电泳仪、DYY-III 28A 型夹芯式垂直电泳槽、DYY-I II43型蛋白质回收槽(北京市六一仪器厂),TLG-16G-A 高速冷冻离心机(上海市安亭科学仪器厂),UV -1200紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司),8823-A 型蛋白核酸检测仪(北京新技术研究所).1.3 方法1.3.1 卵巢粗提液的制备取成熟与未成熟卵巢各0.3g,分别加5m L Tris-HCl 缓冲液(0.5mol/L,pH 7.0),玻璃匀浆器匀浆,然后用高速冷冻离心机10000r/min 离心20min,离心结束后去除上层油脂和底部沉淀,取上清液于-20e 保存备用.1.3.2 卵黄蛋白的鉴定a.比较电泳 取成熟和未成熟的中国对虾卵巢粗提液同时进行不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳,浓缩胶质量浓度为30g/L,pH 6.7,分离胶质量浓度为60g/L,pH 8.9,电极缓冲液为Tris-甘氨酸(0.005mol/L,pH 8.3).电泳起始电压为120V,指示剂进入分离胶后电压改为260V.考马斯亮蓝R250(含磺基水杨酸)染色20min,在体积分数为7%的乙酸中脱色过夜.b.饱和乙酰苏丹黑染色[11] 成熟卵巢粗提液与乙醇的饱和乙酰苏丹黑溶液10B 1混匀,37e 保温30min,与400g /L 蔗糖溶液混匀后进行电泳.1.3.3层析法纯化蛋黄蛋白a.SephadexG-150凝胶过滤 用T ris-HCl 缓冲液(0.01mol/L,pH 7.0)平衡SephadexG -150柱(80cm @0.5cm),然后将卵巢粗提液上柱,同种缓冲液进行洗脱,流速20mL/h,蛋白核酸检测仪280nm 检测,收集各洗脱峰,聚乙二醇(6000D)浓缩,PAGE 检测Vn 峰.b.离子交换层析 用0.01mol/LT is-HCl,pH 7.0缓冲液平衡DEAE -Cellulose-52柱(20cm @0.5cm),然后将经电泳检测含有Vn 的洗脱峰上柱,用含有不同浓度NaCl(0,0.2,0.3,0.4,0.6,1mol/L)的同种缓冲液进行分段洗脱.流速为18mL/h,蛋白核酸检测仪280nm 检测,收集各吸收峰,60g/L PAGE 检测Vn.1.3.4 电泳洗脱纯化卵黄蛋白a.PAGE 分离Vn 按1.3.2a 方法电泳分离Vn,选用3mm 的厚胶,增加粗提液浓度,以增大加样量.电泳后,Vn 带在凝胶上聚集位置的确定有如下几种方法.1)从一侧纵向切下一条胶,考马斯亮蓝迅速染色(10min 内完成,不用脱色),对比确定位置。
染液采用如下配方:考马斯亮蓝G-250100mg ,体积分数95%的乙醇50mL,850g/L 磷酸100mL,加水定溶到1000mL.2)饱和乙酰苏丹黑预染法 方法同1.3.2bb.电泳洗脱 电泳结束后切下Vn 带,放入透析袋中,加入电极缓冲液(Tris-甘氨酸,0.005mol/L,pH8.3)约3m L,在蛋白回收槽中进行电泳洗脱,电压300V,洗脱时间6h.洗脱结束后反向电泳2~3m in,取出透析袋中的液体,用紫外可见分光光度计200~600nm 进行光谱扫描,然后进行电泳检测.纯化过程中发现卵黄蛋白的稳定性很差,在4e 保存数日或短时间高温(20e 左右)处理,其结构就会发生变化(图1),所以以上操作应在低温下进行.2 结果2.1 卵黄蛋白的鉴定1)成熟与未成熟中国对虾卵巢粗提液作PAGE 比较电泳,表明二者之间有差异,成熟卵巢明显多出1条蛋白带(图1),而且这条带在成熟卵巢的匀浆液中含量相当大.2)用脂蛋白的特异性染色方法)))饱和乙酰苏丹黑预染后的电泳凝胶上出现的惟一一条蛋白带,其他#407#第4期柳峰松等:成熟中国对虾(Penaeus chinensis )卵巢中卵黄蛋白的纯化蛋白均未着色.Chang等已经证实中国对虾卵黄蛋白为脂蛋白[7],由此可鉴定Vn.另外对照Quinitio[9]等相关文献所描述的卵黄蛋白在电泳图谱中的位置也可证实Vn鉴定的正确性. 2.2层析法纯化卵黄蛋白成熟中国对虾卵巢粗提液的SephadexG-150凝胶过滤图谱见图3.成熟卵巢粗提液经SephadexG-150层析可分为2个峰,经PAGE检测Vn存在于第1个峰中.将含有Vn的收集液进行DEAE-Cellulose-52柱层析,层析图谱见图4.进行电泳检测,发现0.4mol/L NaCl及0.5mol/L NaCl洗脱下的峰中含有Vn,而且以0.5mol/L NaCl洗脱下的峰中Vn纯度最高(图2).1,2.未成熟的卵巢;3~5.高温处理的成熟卵巢;6~8.正常的成熟卵巢(箭头所指为V n)图1卵巢提取液的PAGE图谱Fig.1PAGE map of ovarianextract 1.Sephadex G分离的第1个峰;2.从DEA E柱上纯化的Vn;3,4.卵巢提取液(箭头所指为V n)图2Vn的PAGE图谱Fig.2PAGE map ofVn图3Vn的Sephadex G-150分离图谱Fig.3Chart of Vn fractionatedon a SephadexG-1501.0.3mol/L N aCl;2.0.4mol/L N aCl;3.0.5mol/L N aCl;4.1mol/L N aCl图4Vn的DEAE-Cellulose纯化图谱Fig.4Chart of Vn purified on a DEAE-C ellulose2.3电泳洗脱纯化卵黄蛋白成熟中国对虾卵巢粗提液经电泳后,检测并切下Vn带放入透析袋内用蛋白回收槽进行电泳洗脱,将洗脱液进行光谱扫描,在280nm处有吸收峰,证明有蛋白存在,再将洗脱液经聚乙二醇浓缩后进行PAGE检测,证明回收到了高纯度的Vn.#408#河北大学学报(自然科学版)2001年3 讨论分别用层析和电泳洗脱的方法从成熟中国对虾卵巢中分离纯化得到了Vn,通过比较,发现这2种方法用于对虾Vn 的纯化各有优缺点.目前多采用层析法纯化Vn,作者选用Sephadex G-150和DEAE-Cellulose-52从中国对虾成熟卵巢中有效地纯化得到了Vn.该方法分离样品量大,可用于蛋白的大量制备,但操作较为烦琐.操作过程中上样量的大小、洗脱液的离子强度及pH 值、流速和环境温度等因素的变化都会影响分离效果,甚至在使用过程中,纤维素自身性质的改变也要求适当调解洗脱条件才能保证有效的纯化到目的蛋白.电泳洗脱的方法简便、快捷、得到的蛋白纯度高,很适于蛋白的亚基数目、分子量、氨基酸组成及等电点等一些生化性质的测定.作者用DYY-III43型蛋白质回收槽成功地纯化到了Vn,并对其操作方法进行了一定的改进:常规的方法是先用透析膜把收集器的两端底部封好,再把带有目的蛋白的凝胶切碎后放入阴极端进行电泳洗脱,最后在阳极端收集蛋白,此方法回收率低、速度慢、回收到的蛋白浓度小,作者将带有目的蛋白的凝胶装入透析袋中后再放入收集器中进行电泳洗脱,大大提高了回收效率.在PAGE 分离Vn 时,如果加样量足够大,在电泳过程中可在凝胶上看到一橙黄色条带向下移动,经证实此带正是Vn 带,这种颜色是与Vn 结合的类胡萝卜素的颜色.通过Vn 的这个性质,在电泳结束后可以迅速确认Vn 带.用层析法纯化得到的Vn,光谱扫描常检测不到类胡萝卜素的存在(480nm 没有光吸收),但在电泳时确实看到Vn 带有橙黄色,这可能是由于类胡萝卜素与Vn 结合不紧密,在纯化过程中脱落的缘故,也有可能是类胡萝卜素的生色基团发生构像变化所致.在用电泳洗脱的方法纯化Vn 时,也发现Vn 在480nm 的OD 值有变小的趋势,根据本课题组所采用方法的特点,与Vn 结合的类胡萝卜素即使脱落也不可能脱离透析带,所以对480nm OD 值降低更合理的解释应该是类胡萝卜素在光照、O 2、金属离子、pH 值、温度等因素的影响下,其生色基团发生了构像变化的缘故.Chang 等[7]在研究斑节对虾Vg 时未能检测到类胡萝卜素,可能也是这种原因造成的.Chang 等[8]对中国对虾卵巢中的Vn 进行研究时发现有两种形式的Vn(Vn1和Vn2),但作者只发现了一种Vn,这种Vn 形式上的差异在其他种类中也有报道,如Chang 等[9]从斑节对虾卵巢中纯化得到了2种形式的Vn(Vn1,Vn2),而Quinitio 等[10]在研究斑节对虾Vn 的时候只检测到一种形式的Vn.至于Vn2的存在,Chang 曾认为是在纯化过程中由Vn1亚基重排产生的,因为他将从斑节对虾卵巢中纯化得到的Vn1进行第2次电泳洗脱时依然有两条蛋白带存在.作者在研究中国对虾Vn 时也注意到了它的不稳定性,结构发生变化的Vn 在PAGE 电泳中可看到在原来的Vn 带位置上下各出现一条蛋白带(见图1).至于本实验与Chang 实验结果的不同,作者认为可能是由于材料成熟程度或实验方法的不同所致,但Chang 所得到的Vn1和Vn2也有可能是由于Vn 发生结构变化后形成的.目前对对虾Vn 及Vg 已经有了一定研究,但对于某些方面的看法还存在着许多分歧,如Vg 的起源部位、Vn 的形式、亚基数目、辅基的结合情况等,这些分歧的产生可能是由于种类的不同造成的,也有可能是由于研究方法的不同而产生的,所以不同的方法结合使用或许能更好地探讨Vn 及Vg 的性质.由于Vn 与Vg 有免疫同源性,所以把Vn 的抗体作为探针可检测Vg 在体内的存在部位,从而有助于探讨Vn 的发生部位及代谢途径.另外通过Vn 的序列分析及其cDNA 和mRNA 的克隆可为Vn 的起源部位和代谢途径的研究提供更有力的证据.参 考 文 献:[1]CHEN C C,CHEN S N.Isolat ion and partial characterization of v itellin from the egg of the g iant tiger pr aw n,Penaeus monodon [J].Comp Biochem Physio l,1993,106B(1):141-146.#409#第4期柳峰松等:成熟中国对虾(Penaeus chinensis )卵巢中卵黄蛋白的纯化[2]WAL LEN CE R A.Studied on amphian yolk I V:an analysis of the main body component of yolk platelets[J].Biochem BiephysActs,1963,74:505-518.[3]MA SAHARU K ,Seiichi A.Isolation of crustacean eg g yolk lipoprotein by differential densityg radient ultracentrifug atio n[J].Comp Biochem Physiol,1992,103B:363-368.[4]CH ING F C,L EE F Y,HU AN G Y S.P urification and char acterizatio n of vitellin from the mature o var ies of prawn,Penaeus mon -odon [J].Comp Biochem Physiol,1993,105B(2):409-414.[5]王 浩,李朝军,刘荣臻.大阪鲫两种卵巢蛋白的纯化及其生化特性[J].水产科技情报,1991,21(3):103-107.[6]M OSHE T ,M I LT O N F,T IM OT HY K ,et al.A compar ative study of the ov ar ian proteins from tw o penaeid shrimps,Penaeus semisulcatus de haan and Penaeus vannamei (Boone)[J].Co mp Biochem Physiol,1992,102B(3):483-490.[7]CHAN G C F ,L EE F Y ,HU AN G Y S,et al.Pur ificatio n 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071002,China ;2.Division of Teaching and M anagement,Handan Educational College,Handan 056000,China)Abstract:A purified vitellin w as isolated from the mature ovaries of the praw n(Penaeus chinensis )w ith tw o different methods,chromatography (Sephadex G -150,DEAE -Cellulose -52)and electro -elution.PAGE showed that the vitellin appeared in the first peak fraction on Sephedex and in the peak fraction when 0.4mol/L and 0.5mol/L NaCl w ere used as eluting buffer on DEAE-Cellulose.Merits and defects of those methods were estimated:the method of chromatography can help to get abundant protein and purer protein can g et by the other method.T he instability of the carotenoid connected w ith vitellin w as studied as w ell in this pa -per.Key words:Penaeus chinensis ;vitellin ;purification;chromatography ;electro-elution(责任编辑:赵藏赏)#410#河北大学学报(自然科学版)2001年。