Rosetta-gami2(DE3)大肠杆菌菌株
Rosetta感受态细胞
Rosetta感受态细胞
Rosetta Competent Cell
规格
Rosetta ：10×100μl
pUC19（control vector）：0.1ng/μl, 5μl
保存条件：-80℃
基因型
F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3) pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(CamR)
说明：华越洋Rosetta 感受态细胞具有氯霉素抗性补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA) 对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，经pUC19 质粒检测转化效率高达109cfu/μg。
操作方法
1. 取100 μl 冰上融化的Rosetta 感受态细胞，加入目DN（质粒或连接产物）并轻轻混匀，冰上静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45 秒，迅速放回冰上，静置2 分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700μl 不含抗生素的无菌培养基（2YT 或LB），混匀后37℃，200 rpm 复苏60 分钟。
4. 5000rpm 离心1 分钟收菌，留取100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB 培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱，过夜培养。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
Rosetta-gami2(DE3)大肠杆菌菌株使用说明
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
规格：300ul 甘油菌
储存温度：-‐80℃
基 因 组 ：
Δ(ara-‐leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h （必要时，可适当延长培养时间）。 菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量 增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓 慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。 注 意 事 项 ： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放 置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能 正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
Rosetta表达意义
Rosetta表达意义BL21中质粒不稳定是因为：BL21不像DH5a，JM109那些克隆用菌一样是DNA酶缺陷型，所以时间一长，BL21中的外源质粒有可能会被降解，而克隆用菌中的质粒则相当稳定。
至于为什么BL21中的外源质粒丢失后，还能在相应抗性的平板上长出来的问题是因为：BL21不是RecA缺陷型。
质粒上的抗性基因有可能被整合到菌的基因组上，所以质粒丢失后还能在相应的平板上长出来。
rosetta菌种本身含有一种质粒，此质粒编码稀有密码子的tRNA，因此如果目的基因中含的稀有密码子较多，用此菌种表达比较合适。
rosetta菌中的质粒还带有抗氯霉素标记因此rosetta菌本身可以抗氯霉素，但这个一般是用于筛选菌种防止污染，而与原核表达无关。
因此表达过程中无需全程都加氯霉素RosettaTM宿主菌是BL21衍生菌，能明显增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。
该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。
这样Rosetta菌株实现了“万能”的翻译。
而一般情况下，由于受大肠杆菌密码子使用频率的限制，真核蛋白表达常有困难。
tRNA基因由它们的天然启动子驱动。
在Rosetta（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）pLacI中，稀有tRNA基因存在于分别带有T7溶菌酶和lac阻遏基因的同一质粒上。
大量摇菌表达前，先要划板挑若干单菌落做小量诱导表达，在上样量相同的情况下，我们能看到他们的表达量是不同的，保存表达量高的单菌落，尽快大摇表达，如果放时间过久，还得划板挑克隆选取表达高的单菌落大摇（虽然都来源于一个单克隆菌，但是划板后每个克隆表达量又有不同，原因不明，望大家赐教），这样能尽可能得到高表达。
另外，选Rosetta的原因，是因为它能满足一些稀有密码子的表达，BL21则不行（导致有些蛋白不表达），所以我们有时候不得不选前者。
毕竟能出结果是最重要的至于Rosetta为何不适宜用于工业化生产，其实与它的表达量有关的，试想一个菌株中拥有N多的质粒或表达框架在里面，那么同样的表达质粒导入，而在别的菌株中就只有一个表达质粒在里面，在相同的培养与诱导条件(即提供的材料量一样)下，可以想像Rosetta菌株中期望的表达质粒能用到的材料量占多少？那么你期望的表达量就肯定不会够了。
【关于优化原核表达的一些总结】
我认为，进行原核表达条件优化主要应注意以下几方面：1．密码子最优化（codon of optimization）：大肠杆菌某些核糖体蛋白质中的使用频率不同，有最佳密码子（optimal codons）或偏爱密码子（preferred codons），稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。
大肠杆菌稀有密码子主要有ATA，CTA，CCC，ACG，CGA，CGG，AGG，GGA，GGG等。
另外，大肠杆菌偏爱的终止密码子为UAA，而哺乳动物偏爱的终止密码子为UGA。
同时，终止密码子的下游碱基对翻译有效终止有影响，大肠杆菌中UAAN，N的影响力次序为：U>G>A，C；哺乳动物中UAGN，N的影响力次序为：A，G>>C，U。
我用的pET-43.1，先用宿主菌BL21（DE3），没有目的带出现，后改用RosettaBlueTM（DE3），目的蛋白表达效率达50%以上，并且是可溶的。
2．启动子是DNA链上RNA聚合酶的识别位点和结合位点，外源基因表达的理想启动子是可以指导高效转录，保证目的基因高效表达的启动子。
乳糖启动子是最常用的启动子，但容易引起外源基因的渗漏表达，对细胞的生长产生毒害作用；其他从乳糖启动子构建而来的启动子，多用IPTG诱导，IPTG对菌体也有毒害作用。
若IPTG对宿主菌有毒，可以同时加入IPTG和乳糖诱导表达，这样可减少IPTG的浓度。
若目的蛋白有毒，可用Invitrogen公司的pLEX系统等。
3．培养基的成分：用M9ZB和NZCYM培养基培养细菌，增加细菌质粒拷贝数；用LB培养基表达外源蛋白，提高蛋白表达量。
【毒性较大蛋白表达条件优化】：１）一般发酵时高温、高浓度诱导剂（ＩＰＴＧ）有利于表达表达包涵体形成，减少毒性。
２）加大氨苄的浓度（可达400mｇ／ｍｌ）并提高培养基中葡萄糖浓度（可达0.5％）有利于稳定表达，并要及时补充葡萄糖使其浓度维持在0.5％。
常用大肠杆菌基础信息及使用说明
常用大肠杆菌基础信息及使用说明菌株目录BL21 (2)BL21(DE3) (4)BL21(DE3)pLysS (6)BL21 Star(DE3) (8)BL21(AI) (10)OverExpress C43(DE3) (13)M15(pREP4) (15)CopyCutter EPI400 (16)Rosetta(DE3) (18)XL10 (20)Mach1-T1 (22)DH5a (23)TOP10 (24)BL21基因型F- dcm omp T hsd S(r B- m B-) gal产品说明作为E.coli B宿主菌，主要用来进行蛋白表达，细胞内缺少lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，能够有效避免目的蛋白的降解；当使用CE6噬菌体启动子时，BL21感受态细胞对目的蛋白在未诱导情况下的蛋白表达严密控制；用于非T7启动子驱动的基因表达，表达水平极高。
操作方法1.BL21感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
Sample Induction Protocol (for reference only)1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.5. (Optional)Pipet 1ml of the cultures into clean microcentrifuge tubes and place the tubes on ice until needed for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-inducedcontrol samples.6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃for 3-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 min at 4℃.9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptabl e).IPTGPrepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) bydissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.BL21(DE3)基因型F- omp T hsd S B(r B- m B- ) gal dcm(DE3)产品说明BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。
s17-1lamppir大肠杆菌使用说明
s17-1lamppir大肠杆菌使用说明s17-1 lamp pir大肠杆菌编号名称规格单位北京华越洋生物NRR00790 s17-1 lamp pir大肠杆菌300ul 支s17-1 lamp pir大肠杆菌基本信息：s17-1 lamp pir大肠杆菌菌种来源于ATCC28188，引进后视为第0代。
用接种环接种至3ml沙氏葡萄糖蛋白胨液体培养基中28℃培养至OD600=0.50，视为第1代，按照1:1的体积加入50%甘油，按照每管300μl的量分装至1.5ml的EP管中。
长期保存于-80℃。
s17-1 lamp pir大肠杆菌使用方法：s17-1 lamp pir大肠杆菌为甘油菌，内含培养基。
使用时只需要用接种环在菌种处挑去一定量的菌，接种至培养基中即可。
可以划线，也可以直接接种至液体培养基中。
1、PDA液体配方：土豆200g/L，葡萄糖20g/L2、用接种环接种至3ml PDA液体培养基中28℃培养至OD600=0.50，按照1:1的体积加入50%甘油，按照每管300μl的量分装至1.5ml的EP管中。
3、按照10%的接种量接种至100ml PDA培养基中28℃培养至OD600=0.50，按照1:1的体积加入50%甘油，按照每管1ml的量分装至1.5ml的EP管中。
4、推荐保存2代，视为安全保菌的方式s17-1 lamp pir大肠杆菌操作说明：1.使用s17-1 lamp pir大肠杆菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。
也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2.为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落进行后续操作。
s17-1 lamp pir相关菌株:TB1(DE3)大肠杆菌菌株，TB1(DE3)大肠杆菌乙型溶血性链球菌TB1(DE3)大肠杆菌菌株，TB1(DE4)大肠杆菌阴沟肠杆菌TB1(DE3)大肠杆菌菌株，TB1(DE5)大肠杆菌粘质沙雷氏菌断发毛癣菌株，断发毛癣菌金黄色葡萄球菌ATCC6538肺炎克雷伯氏菌株，肺炎克雷伯氏菌AD494(DE3)大肠杆菌菌株粪产碱杆菌株，粪产碱杆菌AGL-1根癌农杆菌粪肠球菌粪链球菌株，粪肠球菌粪链球菌ATCC15834发根农杆菌弗氏柠檬酸杆菌株，弗氏柠檬酸杆菌BJ5183菌株福氏志贺氏菌株，福氏志贺氏菌BL21 Gold PlysS(DE3)大肠杆菌菌株光滑念珠菌株，光滑念珠菌BL21 PlysS（DE3）大肠杆菌菌株红色毛癣菌株，红色毛癣菌BL21 Trxb大肠杆菌菌株桔青霉菌株，桔青霉菌BL21-AI（DE3）大肠杆菌菌株克柔假丝酵母菌株，克柔假丝酵母菌BL21-Trxb(DE3)大肠杆菌菌株痢疾志贺氏菌株，痢疾志贺氏菌BL21(DE3)-Condon Plus-RIPL 大肠杆菌菌株马红球菌株，马红球菌BL21(DE3)大肠杆菌菌株马拉色菌株，马拉色菌BL21（DE3）PlysS 大肠杆菌菌株裴氏着色真菌株，裴氏着色真菌BL21大肠杆菌菌株普通变形杆菌株，普通变形杆菌BY4742酵母菌奇异变形杆菌株，奇异变形杆菌C41(DE3) PlysS大肠杆菌菌株缺陷假单胞菌株，缺陷假单胞菌C41(DE3)大肠杆菌菌株热带念珠菌株，热带念珠菌C43(DE3)大肠杆菌菌株生孢梭菌株，生孢梭菌C43(DE3)PlysS大肠杆菌表达菌株石膏样小孢子菌，石膏样小孢子菌株DB3.1大肠杆菌宋内志贺氏菌，宋内志贺氏菌株DH5a大肠杆菌克隆菌株汤卜逊沙门氏菌，汤卜逊沙门氏菌株DH5α大肠杆菌菌株鲜绿青霉，鲜绿青霉DH10B大肠杆菌克隆菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌株DH10Bac杆状病毒表达菌株须癣毛癣菌，须癣毛癣菌株EGY48双杂交酵母菌蕈状芽孢杆菌EHA105根癌农杆菌猪霍乱沙门氏菌，猪霍乱沙门氏菌株GS115毕赤酵母表达菌A4发根农杆菌,a4农杆菌株GV3101根癌农杆菌AD494（DE3）PlysS大肠杆菌菌株INVSC1酿酒酵母菌株AH109酵母双杂交菌株,AH109 JM109 大肠杆菌菌株ArcticExpress? (DE3)RP大肠杆菌菌株JM109(DE3)大肠杆菌白念珠菌JM110大肠杆菌菌株阪崎肠杆菌K-12 MG1655大肠杆菌鲍曼不动杆菌LBA4404根癌农杆菌变形链球菌ATCC25175 LBA9402发根农杆菌表皮葡萄球菌M15 大肠杆菌菌株产气肠杆菌金黄色葡萄球菌ATCC25923肠炎沙门菌MC1061大肠杆菌菌株大肠埃希菌ATCC25922 NMY51双杂交酵母菌单增李斯特菌Origami B (DE3) 大肠杆菌菌株短小芽孢杆菌Origami2(DE3)大肠杆菌菌株腐生葡萄球菌Rosetta-gami 2（DE3）PlysS大肠杆菌表达菌株副溶血性弧菌Rosetta-gami-B pLysS大肠杆菌黑曲霉Rosetta-gami(DE3)PlysS大肠杆菌菌株金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003 Rosetta-gami2(DE3)大肠杆菌菌株蜡样芽孢杆菌Rosetta-gamiB(DE3)大肠杆菌菌株酿酒酵母菌Rosetta(DE3) PlysS大肠杆菌菌株犬小孢子菌ATCC32903 Rosetta(DE3)大肠杆菌表达菌株嗜热脂肪芽孢杆菌Rosetta2(DE3) PlysS大肠杆菌菌株苏云金芽孢杆菌Rosetta2(DE3)大肠杆菌菌株铜绿假单胞杆菌s17-1 lamp pir大肠杆菌菌株Top10大肠杆菌菌株SMD1163酵母菌Top10F'大肠杆菌菌株Stbl2大肠杆菌菌株Trans110 大肠杆菌克隆菌株Stbl3大肠杆菌TransB 大肠杆菌菌株SURE大肠杆菌克隆菌株Tuner（DE3）大肠杆菌菌株T1大肠杆菌克隆菌株WB800枯草芽孢杆菌TG1大肠杆菌克隆菌株XL1-Blue 大肠杆菌菌株Y1HGold单杂交酵母菌株XL2 blue MRF' 大肠杆菌菌株Y2Hgold酵母双杂交菌株XL2-Blue大肠杆菌克隆菌株Y187酵母双杂交菌株XL10-Gold 大肠杆菌菌株拟南芥种子KM71酵母表达菌藤黄微球菌无乳链球菌。
Rosetta（DE3）菌株
DE3 宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3溶原菌中表达目标蛋白。
在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。
未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。
而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。
pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。
pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λ DE3 溶原菌。
使用最广泛的为 BL21 及其10种衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。
B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。
BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。
两个硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变菌株 (AD494,BL21 trxB )，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。
Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。
Origami TM和Origami B 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。
新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。
其它菌株背景包括K-12菌株 HMS174 和 NovaBlue,象BLR 一样为 recA 。
这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。
由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白, NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。
（DE3）指宿主为λDE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。
原核表达菌株的选择及菌种保存需知
原核表达菌株的选择及菌种保存需知（Rosetta、BL21、Origami）从生物通上看到一篇文章，介绍原核表达菌株的选择。
文章很好，是生物通从M erck（Novagen隶属Merck旗下）的网站上编译而成的。
这里摘取其中我认为重要的地方，并添加了一些EMD (Emanuel Merck Darmstadt)原网站上的内容。
仅供参考。
在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。
（如上图）事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因——即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。
宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。
堪称经典的BL21系列就是lon和ompT 蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。
大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。
真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。
改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（A UA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
（已经携带有氯霉素抗性质粒）当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。
常用大肠杆菌感受态的区别
常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5：TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lac Ⅹ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-17：M110或SCS110大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。
PfuDNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达及快速纯化
第４１卷第３期２０１９年５月湖北大学学报(自然科学版)ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ)Ｖｏｌ.４１㊀Ｎｏ.３㊀Ｍａｙꎬ２０１９㊀收稿日期:２０１８０５１１基金项目:油料脂质化学与营养湖北省重点实验室开放基金资助作者简介:何华华(１９９２)ꎬ男ꎬ硕士生ꎻ喻婵ꎬ通信作者ꎬ讲师ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｕｃｈａｎ７２＠１６３.ｃｏｍ文章编号:１０００２３７５(２０１９)０３０２２３０５ＰｆｕＤＮＡ聚合酶在大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)中的表达及快速纯化何华华ꎬ胡晓韵ꎬ王婷ꎬ喻婵(湖北大学生命科学学院ꎬ生物资源绿色转化协同创新中心ꎬ湖北武汉４３００６２)摘要:来源于ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＣＯＭ１菌的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶具有保真性高㊁延伸速度快㊁热稳定性强等特点ꎬ能够提高ＰＣＲ反应过程中的扩增效率ꎬ减少错误碱基掺入率.以大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)为重组细胞ꎬ利用一种快速表达纯化方法ꎬ让ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的表达纯化过程变得更加简便ꎬ并维持其高活性.结果表明ꎬＰｆｕＤＮＡ聚合酶在大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)中能够进行大量表达ꎬ同时６０ħ高温水浴能有效去除杂蛋白ꎬ简化纯化步骤及提高ＰｆｕＤＮＡ聚合酶纯度.经过一系列纯化步骤处理后ꎬＰｆｕＤＮＡ聚合酶仍然能够保持较好的酶活ꎬ且在１００μＬＰＣＲ反应体系中ꎬ加入４μＬ的１ｍｇ/ｍＬＰｆｕＤＮＡ聚合酶液效果最佳.关键词:ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎻＲｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)ꎻ亲和层析ꎻＰＣＲ检测中图分类号:Ｑ７８６㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣２３７５.２０１９.０３.００２ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆａｓｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎＥ.ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)ｃｅｌｌｓＨＥＨｕａｈｕａꎬＨＵＸｉａｏｙｕｎꎬＷＡＮＧＴｉｎｇꎬＹＵＣｈａｎ(Ｂｉｏ￣ＲｅｓｏｕｒｃｅＧｒｅｅｎＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒꎬＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＷｕｈａｎ４３００６２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＴｈｅＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＣＯＭ１ｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙꎬｆａｓｔｅｘｔｅｎｓｉｏｎꎬａｎｄｓｔｒｏｎｇｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ.ＩｔｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｄｕｒｉｎｇｔｈｅＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｒａｔｅｏｆｉｎｃｏｒｒｅｃｔｂａｓｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ.ＵｓｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)ａｓｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｅｌｌｓꎬａｒａｐｉｄｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｗｈｉｌｅｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｉｔｓｈｉｇｈｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｏｕｌｄｂｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｉｎＥ.ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３).Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｈｉｇｈ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｔｅｒｂａｔｈａｔ６０ħｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｒｅｍｏｖｅｔｈｅｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓꎬｓｉｍｐｌｉｆｙｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ.ＡｆｔｅｒａｓｅｒｉｅｓｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｅｐｓꎬＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃａｎｓｔｉｌｌｍａｉｎｔａｉｎａｇｏｏｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄｉｎ１００μＬＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍꎬ４μＬｏｆ１ｍｇ/ｍＬＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｏｌｕｔｉｏｎｇａｖｅｔｈｅｂｅｓｔｏｕｔｃｏｍｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎻＲｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)ꎻａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎻＰＣＲａｓｓａｙ０㊀引言ＤＮＡ聚合酶Ｉ最先由ＫｏｒｎｂｅｒｇＡ等人在１９５６年研究大肠杆菌ＤＮＡ复制时发现[１]ꎬ随后在１９７０年ꎬＫｏｒｎｂｅｒｇＴ.和Ｍ.Ｌ.Ｇｅｆｔｅｒ发现了ＤＮＡ聚合酶ＩＩꎬ这一发现加深了大家对ＤＮＡ聚合酶在ＤＮＡ复制过程中的认识[２].在１９７６年ꎬＣｈｉｅｎＡ.等人发现了一种来源于嗜热菌的ＤＮＡ聚合酶ꎬ它能够在８０ħ条件下稳定存在[３]ꎬ这种耐高温的特性为未来ＰＣＲ技术的发展奠定了良好的基础.随着后来分子生物学２２４㊀湖北大学学报(自然科学版)第４１卷技术的进一步发展ꎬ如:ＤＮＡ测序技术㊁核苷酸合成技术等ꎬ逐渐打破了不能在体外扩增ＤＮＡ片段的限制.在１９８５年ꎬＫ.Ｓａｉｋｉ等人利用ＫｌｅｎｏｗＤＮＡ聚合酶成功在体外建立了ＰＣＲ技术ꎬ使体外扩增ＤＮＡ片段技术成为了可能ꎬ因其操作简单㊁快速㊁灵敏度高和特异性强等特点ꎬ已经广泛应用于生物学㊁医学检验㊁法医鉴定及考古等领域[４].自ＰＣＲ技术面世以来ꎬ科研人员一直在开发新型具有保真性高㊁热稳定性强㊁延伸速度快等优点的ＤＮＡ聚合酶.除了比较常用的ＴａｑＤＮＡ聚合酶ꎬ还有Ｖｅｎｔ㊁ＤｅｅｐＶｅｎｔ㊁Ｐｆｕ㊁ＵＴＴｍａ等.这些ＤＮＡ聚合酶ꎬ在进行ＤＮＡ复制时的错配率为Ｐｆｕ(１.３ˑ１０－６)<ＤｅｅｐＶｅｎｔ(２.７ˑ１００－６)<Ｖｅｎｔ(２.８ˑ１００－６)<Ｔａｑ(８.０ˑ１００－６)<ＵＴＴｍａ(５ˑ１０－５)[５].ＰｆｕＤＮＡ聚合酶在保真性方面明显优于其他类型的ＤＮＡ聚合酶ꎬ在ＤＮＡ复制过程中发生碱基突变的几率最低.ＰｆｕＤＮＡ聚合酶来源于极端嗜热菌ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＣＯＭ１[６]ꎬ在生物体内对ＤＮＡ复制起重要作用ꎬ具有５ ￣３ 端的ＤＮＡ聚合酶活性和３ ￣５ 端的校正活性.ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的分子量为９０ｋＤꎬ等电点为６.８５７.３５[７].因在ＤＮＡ复制过程中碱基的突变率最低ꎬ仅为１.３ˑ１０－６ꎬ且在９７.５ħ条件下半衰期大于３ｈꎬ故相对于其他ＤＮＡ聚合酶而言ꎬ保真性高和热稳定性强的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶关注度越来越高.在２００８年ꎬＫｉｍＳ.Ｗ.等人得到了２.６ˑ１０－６分辨率的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶晶体结构ꎬ便于在分子层面上理解ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的聚合和校正等作用机理[８].自１９９７年ＬｕＣ等人第一次用大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)作为宿主表达ＰｆｕＤＮＡ聚合酶以来ꎬＢＬ２１(ＤＥ３)作为表达ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的宿主已经越来越普遍ꎬ表达的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶也主要是通过热变性预处理和亲和层析等方式纯化得到[７ꎬ９]ꎬ但目前还没有报道以大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)为重组细胞表达纯化ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的相关文献.本研究成功地将ＰｆｕＤＮＡ聚合酶在大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)菌株中进行了可溶性诱导表达ꎬ通过简单的热变性预处理和亲和层析的方法大量纯化得到了ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎬ然后通过ＰＣＲ技术简单高效地检测出ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的活性.１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀菌株与质粒㊀大肠杆菌Ｇｏｌｄ㊁大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)㊁载体ｐＥＴ￣１６ｂ均为本实验室所保存.１.１.２㊀试剂㊀ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ㊁１ｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ及各种限制性内切酶均购于Ｔａｋａｒａ公司ꎻ咪唑㊁ｄＮＴＰｓ㊁ＰＭＳＦ㊁ＤｎａｓｅＩ㊁Ｔｒｉｓ㊁ＤＴＴ㊁ＮＰ￣４０㊁ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００㊁Ｔｗｅｅｎ￣２０㊁溶菌酶试剂均购于ＢｉｏｓｈａｒｐꎻＴｒｙｐｔｏｎｅ㊁Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ购于ＯＸＯＩＤꎻＰｌｕｓＤＮＡＣｌｅａｎ/ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ㊁ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＩＩ购于ＧｅｎｅＭａｒｋ公司ꎻＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白浓度测定试剂盒购于Ｂｅｙｏｔｉｍｅꎬ其余试剂均为国药公司提供.１.１.３引物㊀根据合成的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的编码序列(ＮＣＢＩ:ＣＰ００３６８５.１)来设计引物ꎬ正向引物为Ｐｆｕ￣Ｆ:ＧＣＧＧＣＣＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＧＡＡＧꎬ反向引物为Ｐｆｕ￣Ｒ:ＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＴＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＴＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧꎬ划线处为ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ的酶切位点碱基序列.１.２㊀方法１.２.１㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶表达载体(ｐＥＴ￣１６ｂ￣Ｐｆｕ)的构建㊀将合成的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶基因经过ＰＣＲ扩增后ꎬ溶液回收得到纯的ＤＮＡ片段.表达载体ｐＥＴ￣１６ｂ用ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ双酶切后ꎬＤＮＡ琼脂糖凝胶回收ꎬ得到纯的线性化载体.利用Ｔ５克隆的方法ꎬ将回收的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶目的基因与线性化的ｐＥＴ￣１６ｂ载体按摩尔比３ʒ１的量加入５μＬ反应体系中ꎬ同时加入Ｔ５外切核酸酶后于冰上静置５ｍｉｎꎬ再在超净工作台中加入５０μＬ大肠杆菌Ｇｏｌｄ感受态细胞并静置３０ｍｉｎ.在４２ħ水浴锅中热激３５ｓ后加入５００μＬＬＢ培养基ꎬ于３７ħ摇床孵育１ｈ涂布ＬＫ平板ꎬ接着放置在３７ħ培养箱中过夜培养.待菌落长大后ꎬ进行菌落ＰＣＲ鉴定及质粒测序验证ꎬ将构建的载体命名为ｐＥＴ￣１６ｂ￣Ｐｆｕ.１.２.２㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶在大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)中的诱导表达㊀取构建成功的ｐＥＴ￣１６ｂ￣Ｐｆｕ质粒１μＬ与１０μＬ大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)感受态细胞混合ꎬ在冰上静置５ｍｉｎ后ꎬ４２ħ热激３５ｓ并加入１５０μＬＬＢ培养基孵育１ｈꎬ取２０μＬ菌液涂布ＬＫ平板并在３７ħ培养箱中过夜培养.待形成单菌落后ꎬ挑取适量单菌落接种于２ｍＬＬＫ培养基中过夜培养ꎬ然后取１ｍＬ培养过夜的菌液转接到含有２００ｍＬＬＫ培养基的１Ｌ三角瓶中ꎬ于３７ħ摇床继续培养ꎬ大约培养２.５ｈ后ꎬ待菌体ＯＤ６００接近０.６ꎬ加入诱导剂ＩＰＴＧ至其终浓度为０.５ｍｍｏｌ/Ｌꎬ放入１８ħ摇床诱导表达ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎬ培养２４ｈ后收菌.第３期何华华ꎬ等:ＰｆｕＤＮＡ聚合酶在大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)中的表达及快速纯化２２５㊀１.２.３㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的纯化㊀将收集到的大肠杆菌菌体沉淀用２０ｍＬＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ(５０ｍｍｏｌ/ＬＮａＨ２ＰＯ４ꎬ３００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ１０ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑ꎬｐＨ８.０)重悬ꎬ并在重悬液中加入２０ｍｇ溶菌酶㊁１ｍｍｏｌ/ＬＰＭＳＦ㊁０.５％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００㊁１００μＬＤｎａｓｅＩꎬ于４ħ冰箱中用磁力搅拌器搅拌１ｈ.然后将处理过的重悬液用超声波破碎仪破碎细胞ꎬ直至破菌液清亮泛黄为止ꎬ并以４ħ㊁１４０００ｒ/ｍｉｎ的条件高速离心１５ｍｉｎꎬ去除细胞碎片以及其他杂质ꎬ此为破菌上清.将离心之后的破菌上清于６０ħ水浴锅中高温水浴１５ｍｉｎꎬ去除不耐热的杂蛋白ꎬ然后将高温处理过的加热上清以４ħ㊁１４０００ｒ/ｍｉｎ条件高速离心１５ｍｉｎꎬ得到经过预处理含有ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的上清溶液ꎬ此为加热上清.将含有１ｍＬ树脂的Ｎｉ￣ＮＴＡ柱用ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ(５０ｍｍｏｌ/ＬＮａＨ２ＰＯ４ꎬ３００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ３５ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑ꎬｐＨ８.０)连续清洗３次ꎬ再往Ｎｉ￣ＮＴＡ柱中缓慢加入２ｍＬ含有ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的加热上清ꎬ静置１ｍｉｎ后使纯化柱中的液体流出ꎬ并用干净的容器收集流出液以便于第二次挂柱ꎬ此为挂柱上清１.再加入２ｍＬＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ洗掉结合不紧密或未结合而残留在树脂中的杂蛋白.重复以上操作ꎬ直到把加热上清全部都加入到Ｎｉ￣ＮＴＡ中为止.再将收集的挂柱上清１按上述操作ꎬ重新全部加入到Ｎｉ￣ＮＴＡ柱中并收集流出液ꎬ此为挂柱上清２.然后用ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ连续清洗树脂３次后充分去除树脂中的杂蛋白ꎬ同时将最后一次Ｗａｓｈ的溶液用干净的容器收集.再加入１ｍＬＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ(５０ｍｍｏｌ/ＬＮａＨ２ＰＯ４ꎬ３００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ２５０ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑ꎬｐＨ８.０)使结合在Ｎｉ￣ＮＴＡ柱树脂中的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶随ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ流出ꎬ用１.５ｍＬＥＰ管分２次收集Ｎｉ￣ＮＴＡ柱中的流出液ꎬ每次５００μＬ.第一次收集液为Ｅｌｕｔｉｏｎ１ꎬ第二次收集液为Ｅｌｕｔｉｏｎ２.再加入１ｍＬＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒꎬ用１.５ｍＬＥＰ管分２次收集流出液ꎬ每次５００μＬ.两次收集液分别为Ｅｌｕｔｉｏｎ３和Ｅｌｕｔｉｏｎ４.对各个纯化步骤中的样品进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ并用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测量纯化的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶浓度ꎬ同时用ＳｔｏｒａｇｅＢｕｆｆｅｒ(１００ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓꎬ０.２ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬ２ｍｍｏｌ/ＬＤＴＴꎬ０.２％ＮＰ４０ꎬ０.２％Ｔｗｅｅｎ２０ꎬ５０％甘油ꎬｐＨ８.０)进行等体积超滤ꎬ将用ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ保存的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶换成ＳｔｏｒａｇｅＢｕｆｆｅｒ保存的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶.１.２.４㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的活性检测㊀将用ＳｔｏｒａｇｅＢｕｆｆｅｒ保存的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶浓度稀释成１ｍｇ/ｍＬꎬ再分别取１㊁２㊁３㊁４㊁５μＬＰｆｕＤＮＡ聚合酶在１００μＬＰＣＲ反应体系中进行牛溶菌酶Ｃ片段扩增ꎬ以检测ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的活性和ＰＣＲ反应体系中的１ｍｇ/ｍＬＰｆｕＤＮＡ聚合酶的最佳加入量.图１㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ＰＣＲ扩增结果图１和２均为ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的ＰＣＲ产物ꎻＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２㊀结果２.１㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶(ｐＥＴ￣１６ｂ￣Ｐｆｕ)表达载体的构建㊀将合成的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶基因利用引物Ｐｆｕ￣Ｆ/Ｐｆｕ￣Ｒ进行ＰＣＲ扩增ꎬ得到２３７３ｂｐ的ＰＣＲ片段ꎬ如图１所示.表达载体ｐＥＴ￣１６ｂ用ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ双酶切之后ꎬ通过ＤＮＡ琼脂糖凝胶回收试剂盒得到纯的线性化载体ꎬ如图２所示.在Ｔ５核酸外切酶的作用下ꎬ将回收的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶基因片段插入到线性化ｐＥＴ￣１６ｂ的表达载体中ꎬ如图３所示.转化大肠杆菌Ｇｏｌｄꎬ涂ＬＫ平板过夜培养.待转化的菌长出后ꎬ进行菌落ＰＣＲ㊁质粒抽提并测序验证ꎬ通过测序结果可知ꎬ我们已经成功构建ｐＥＴ￣１６ｂ￣Ｐｆｕ载体.２.２㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶在大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ中的表达与纯化㊀将构建成功的表达载体ｐＥＴ￣１６ｂ￣Ｐｆｕ转化大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)菌株ꎬ经过３７ħ培养ꎬ待菌落长出后ꎬ挑取含有ＰｆｕＤＮＡ聚合酶质粒的单菌落ꎬ接种于ＬＫ培养基中ꎬ待其ＯＤ６００达到０.６时ꎬ加入诱导剂ＩＰＴＧ使其在培养基中的终浓度为０.５ｍｍｏｌ/Ｌꎬ并在１８ħ条件下进行诱导表达.诱导培养２４ｈ后ꎬＯＤ６００会达到３左右ꎬ此时离心收菌.将菌体用ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ重悬后ꎬ经过预处理ꎬ利用超声波破碎仪破菌ꎬ使胞内经ＩＰＴＧ诱导表达的可溶性ＰｆｕＤＮＡ聚合酶从胞内释放出来.由于ＰｆｕＤＮＡ聚合酶是一种热稳定性蛋白质ꎬ通过６０ħ高温加热１５ｍｉｎ可以去除热不稳定的杂蛋白ꎬ达到初步纯化ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的效果.因ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的Ｎ端含有６个组氨酸ꎬ可以与Ｎｉ￣ＮＴＡ柱中的Ｎｉ２＋发２２６㊀湖北大学学报(自然科学版)第４１卷生相互作用而紧密结合在树脂中ꎬ从而达到与其他杂蛋白分离的目的.取各个纯化步骤的样品进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测.从图４可以看到ꎬ得到了大量的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎬ说明这种快速纯化的方法效果很好ꎬ能够在短时间内获得大量的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎬ适合在实验室小规模范围内使用.通过Ｂｒａｄｆｏｒｄ法检测ꎬ我们培养的４００ｍＬ菌液最终可以获得总量达３０ｍｇ的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶.图２㊀ｐＥＴ￣１６ｂ载体酶切图１:用ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ双酶切的ｐＥＴ￣１６ｂ载体ꎻ２:未酶切的ｐＥＴ￣１６ｂ载体ꎻＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒ㊀㊀㊀图３㊀ｐＥＴ￣１６ｂ￣Ｐｆｕ表达载体的构建示意图㊀２.３㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的活性检测㊀将等体积超滤后用ＳｔｏｒａｇｅＢｕｆｆｅｒ保存的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶浓度稀释成１ｍｇ/ｍＬꎬ在１００μＬＰＣＲ反应体系中分别加入１㊁２㊁３㊁４㊁５μＬ浓度为１ｍｇ/ｍＬ的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎬ并进行牛溶菌酶Ｃ基因片段扩增检测.ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果显示(图５)ꎬ在１００μＬＰＣＲ反应体系中ꎬ加４μＬ稀释成１ｍｇ/ｍＬ的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的效果最佳.图４㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测分析１:破菌上清ꎻ２:加热上清ꎻ３:挂柱上清１ꎻ４:挂柱上清２ꎻ５:Ｗａｓｈꎻ６:Ｅｌｕｔｉｏｎ１ꎻ７:Ｅｌｕｔｉｏｎ２ꎻ８:Ｅｌｕｔｉｏｎ３ꎻ９:Ｅｌｕｔｉｏｎ４㊀图５㊀ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ＰＣＲ检测效果１２为１μＬ的酶量ꎻ３４为２μＬ的酶量ꎻ５６为３μＬ的酶量ꎻ７８为４μＬ的酶量ꎻ９１０为５μＬ的酶量㊀第３期何华华ꎬ等:ＰｆｕＤＮＡ聚合酶在大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)中的表达及快速纯化２２７㊀３㊀讨论大肠杆菌是一种目前应用广泛的异源蛋白表达宿主ꎬ具有遗传背景清楚㊁生长周期短㊁培养方便㊁成本低等优势ꎬ适合工业化大规模培养[１０]ꎬ选择大肠杆菌作为表达ＤＮＡ聚合酶的表达宿主是较佳选择.ＰｆｕＤＮＡ聚合酶作为一种ＰＣＲ的工具酶ꎬ以具有高保真性和强热稳定性优于其他ＤＮＡ聚合酶的优势ꎬ受到大家的广泛关注.目前ＰｆｕＤＮＡ聚合酶最常用的表达宿主是大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)ꎬ通过热预处理和亲和层析等纯化方法可以得到诱导表达的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶[７ꎬ９]ꎬ但可溶性表达量较低[７ꎬ１１]ꎬ无法进行产业化应用.本研究以大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)菌株作为宿主来表达ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎬ通过结合ＩＰＴＧ诱导表达㊁高温预处理与亲和层析快速纯化的方法ꎬ可以从４００ｍＬ培养液中得到总量为３０ｍｇ的ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎬ高于ＰｆｕＤＮＡ聚合酶在ＢＬ２１(ＤＥ３)菌株中的表达总量６ｍｇ[７]ꎬ增加了ＰｆｕＤＮＡ聚合酶进行大范围应用的可能.将ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的浓度稀释成１ｍｇ/ｍＬ后ꎬ通过ＰＣＲ技术快速高效地检测出ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的活性.这种活性检测方式ꎬ可以在实验室规模进行应用.在Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)菌株中表达ＰｆｕＤＮＡ聚合酶ꎬ不仅增加了ＰｆｕＤＮＡ聚合酶表达宿主的选择性ꎬ而且在表达纯化以及活性检测的方法上ꎬ快速㊁简便㊁高效ꎬ节约时间.有文献报道ꎬＷａｎｇＹ.等人在２００４年使用一种ＤＮＡ结合蛋白Ｓｓｏ７ｄ能够显著提高ＤＮＡ聚合酶的延伸速度ꎬ而不会影响ＤＮＡ聚合酶的催化活性和稳定性[１２]ꎬ并已经成功地在ＴａｑＤＮＡ聚合酶上得到了较好的应用[１３].因此ꎬＰｆｕＤＮＡ聚合酶和Ｓｓｏ７ｄ蛋白进行融合表达ꎬ可能会在一定程度上增强ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的延伸能力ꎬ使ＰｆｕＤＮＡ聚合酶的性能更加强大ꎬ应用范围更加广泛.４㊀参考文献[１]ＬｅｈｍａｎＩＲꎬＢｅｓｓｍａｎＭＪꎬＳｉｍｍｓＥＳꎬｅｔａｌ.Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ(Ⅰ):ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅｓａｎｄｐａｒｔｉａｌｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９５８ꎬ２３３(１):１６３￣１７０.[２]ＫｏｒｎｂｅｒｇＴꎬＧｅｆｔｅｒＭＬ.ＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｃｅｌｌ￣ｆｒｅｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｆａＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ￣ｄｅｆｅｃｔｉｖｅｍｕｔａｎｔ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ１９７０ꎬ４０(６):１３４８￣１３５５.[３]ＣｈｉｅｎＡꎬＥｄｇａｒＤＢꎬＴｒｅｌａＪＭ.ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍｔｈｅｅｘｔｒｅｍｅｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ１９７６ꎬ１２７(３):１５５０￣１５５７.[４]廖俊杰ꎬ吴英杰.新型ＤＮＡ聚合酶 Ｐｆｕ酶的研究[Ｊ].广东轻工职业技术学院学报ꎬ２００５ꎬ２:４￣６ꎬ１０. [５]ＣｌｉｎｅＪꎬＢｒａｍａｎＪＣꎬＨｏｇｒｅｆｅＨＨ.ＰＣＲｆｉｄｅｌｉｔｙｏｆｐｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄｏｔｈｅｒｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ１９９６ꎬ２４(１８):３５４６￣３５５１.[６]ＬｕｎｄｂｅｒｇＫＳꎬＳｈｏｅｍａｋｅｒＤＤꎬＡｄａｍｓＭＷꎬｅｔａｌ.Ｈｉｇｈ￣ｆｉｄｅｌｉｔｙａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇａｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅꎬ１９９１ꎬ１０８(１):１￣６.[７]ＺｈｅｎｇＷꎬＷａｎｇＱꎬＢｉＱ.ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎꎬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ[Ｊ].ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１６ꎬ３５(２):１４５￣１５３.[８]ＫｉｍＳＷꎬＫｉｍＤＵꎬＫｉｍＪＫꎬｅｔａｌ.ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰｆｕꎬｔｈｅｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２００８ꎬ４２(４):３５６￣３６１.[９]ＬｕＣꎬＥｒｉｃｋｓｏｎＨＰ.ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｏｆｔｈｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ１９９７ꎬ１１(２):１７９￣１８４.[１０]ＰｏｒｏｗｉｎｓｋａＤꎬＷｕｊａｋＭꎬＲｏｓｚｅｋＫꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ[Ｊ].ＰｏｓｔｅｐｙＨｉｇＭｅｄＤｏｓｗ(Ｏｎｌｉｎｅ)ꎬ２０１３ꎬ６７:１１９￣１２９.[１１]吴海洪ꎬ孙章辉ꎬ蔡谨.乳糖诱导ＰｆｕＤＮＡ聚合酶基因的表达及酶的纯化[Ｊ].科技通报ꎬ２００８(１):２３￣２８. [１２]ＷａｎｇＹꎬＰｒｏｓｅｎＤＥꎬＭｅｉＬꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｅｎｇｉｎｅｅｒＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｄｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｖｉｔｒｏ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００４ꎬ３２(３):１１９７￣１２０７.[１３]伊丽娜.新型ＤＮＡ聚合酶的基因工程改造及应用研究[Ｄ].南京:南京理工大学ꎬ２０１２.(责任编辑㊀游俊)。
Rosetta (DE3) 感受态细胞说明书
Rosetta(DE3)感受态细胞说明书货号：C1420规格：10×100ul/20×100ul保存：-70℃保存，运输为干冰包装。
-70℃保存至少6个月。
产品简介：Rosetta(DE3)感受态细胞是采用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。
使用pUC19质粒检测，转化效率可达107cfu/µg，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。
基因型:F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcmlacY1(DE3)pRARE(argU,argW,ileX,glyT,leuW,proL)(Camr)特点:该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA,AGG,AGA, CUA,CCC,GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
操作方法：（以下操作均按无菌条件的标准进行）1、将感受态细胞置于冰上融化，以下实验以100ul感受态细胞为例。
2、向感受态细胞悬液中加入需转化的目的DNA，注意目的DNA的体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴放置30分钟。
3、将离心管置于42℃水浴中60-90秒，然后快速转移到冰浴中放置2-3分钟，注意不要摇动离心管。
4、向离心管中加入500ul无菌无抗的SOC或LB培养基，37℃180rpm振荡培养1小时。
目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5、取适量已转化的感受态细胞涂布含相应抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培养12-16小时。
涂布用量可根据具体实验来调整，如转化的DNA总量较多，可取100ul左右的转化产物涂板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul的转化产物涂板。
过多菌液可以抑制细菌生长。
如果预计的克隆较少，可通过离心后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。
大肠杆菌表达纯化蛋白
大肠杆菌表达纯化蛋白大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究中。
它具有较高的生长速度、易于培养和操作的特点，被广泛用于表达和纯化蛋白。
本文将从大肠杆菌的选择、蛋白表达、纯化等方面介绍如何利用大肠杆菌表达纯化蛋白。
一、大肠杆菌的选择在大肠杆菌中选择合适的表达宿主菌株至关重要。
一般而言，常用的宿主菌株有BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。
这些菌株具有较高的蛋白表达能力和稳定性，适合用于表达多种蛋白。
根据所需表达的蛋白的特点（例如毒性、折叠状态等），选择合适的宿主菌株是必要的。
二、蛋白表达蛋白表达是指通过转化目标基因到大肠杆菌中，使其表达目标蛋白。
一般采用的方法有原核表达和真核表达两种。
原核表达是将目标基因插入表达质粒，然后转化到大肠杆菌中，利用大肠杆菌的细胞机制进行蛋白表达。
真核表达则是将目标基因转化到真核细胞中，利用真核细胞的转录和翻译系统进行蛋白表达。
在大肠杆菌中进行蛋白表达时，需要选择适当的表达质粒。
常用的表达质粒有pET系列、pGEX系列等。
这些质粒通常含有启动子、多克隆位点、选择标记等功能元件，能够实现高效的蛋白表达。
在构建表达质粒时，需要将目标基因插入适当的位点，确保目标蛋白能够被正常表达。
三、蛋白纯化蛋白表达后，需要对目标蛋白进行纯化。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
亲和层析是利用蛋白与亲和树脂之间的特异性相互作用进行纯化的方法。
离子交换层析则是利用蛋白与离子交换树脂之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
凝胶过滤层析则是利用蛋白在凝胶中的分子大小差异进行纯化的方法。
在进行蛋白纯化时，需要根据目标蛋白的特性选择合适的纯化方法。
不同的纯化方法具有不同的选择条件和操作步骤，需要根据实际情况进行选择。
此外，为了提高纯化效果，还可以采用多步骤的纯化策略，如串联多个纯化方法，以获得更高纯度的蛋白。
四、蛋白质结构分析在蛋白纯化后，可以对目标蛋白进行结构分析。
Rosetta2(DE3) PlysS大肠杆菌菌株使用说明
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
株适用于 pET 系列载体，及其他 T7 启动子系列载体。含有 pLSs 质粒，pLySs
质粒能够产生 T7 溶菌酶，可以有效降低目的基因的基础表达水平。pLySs
质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。pLySs 质粒的起始复制位点是 p15 Origin,
这使得该质粒能够和 pUC-‐及 pBR322-‐衍生的质粒互相共存。
Rosetta2(DE3) PlysS 大肠杆菌菌株
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00860 Rosetta2(DE3) PlysS 大肠杆菌菌株
基 本 信 息 ：
名称：Rosetta2(DE3) PlysS 大肠杆菌菌株
规格：300ul 甘油菌
储存温度：-‐80℃
基 因 组 ：
F-‐ompT hsdSB(rB-‐ mB-‐) gal dcm (DE3) pLysSRARE2 (CamR)
稀 有 密 码 子 ， 使 得 该 宿 主 菌 相 对 于 其 他 大 肠 杆 菌 ， 能 够 提 供 更 加 “通 用 ”的
蛋 白 质 表 达 ， 从 而 提 升 目 的 蛋 白 表 达 水 平 。
DE3 是溶源性的 λDE3, 所以带有 T7 RNA 聚合酶的染色体拷贝。该菌
了能够提供原 Rosetta(DE3)宿主菌含有 的 AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 和
Rosetta-gami 2 小木虫2
菌株类型: li产品目录号: 71352-3, 71352-4培养基: LB培养基生长条件: 37 ℃, 有氧基因型: Rosetta-gami2(DE3)pLysS感受态细胞菌株基因型抗性: 氯霉素，链霉素，四环素质粒转化条件: 42 ℃热激应用: 蛋白表达诱导方法: IPTG菌株特点::Rosetta-gami 2系列菌株是集合了Rosetta 2系列菌株和Origami 2系列菌株的有点，增强了细胞内二硫键的形成和含有在大肠杆菌中稀有密码子的真核细胞蛋白的表达能力。
Rosetta-gami 2(DE3)pLysS系列菌株是来源于Origami 2系列菌株。
而Origami 2 系列菌株是卡那敏感的K-12细胞菌株，携带有TrxB和Gor基因突变提高含二硫键正确折叠蛋白的高效表达。
本菌株含有pRARE2质粒，除了能够提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有的AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 和GGA六个稀有密码子的tRNA外，还提供了第七个稀有密码子CGG的tRNA。
同时，pRARE2质粒具有氯霉素抗性。
通过提供原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的在大肠杆菌中的蛋白表达水平。
Rosetta-gami 2(DE3)pLysS感受态细胞中的Gor基因突变使得菌株具有四环素抗性。
DE3是溶源性的λDE3, 所以带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。
该菌株适用于pET系列载体，及其他T7启动子系列载体。
含有pLSs质粒，pLySs质粒能够产生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基础表达水平。
pLySs质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。
pLySs质粒的起始复制位点是p15 Origin, 这使得该质粒能够和pUC-及pBR322-衍生的质粒互相共存。
亮氨酸生长缺陷型菌株。
刚从同学手中拿到rosetta gami 2(DE3)，准备用于表达蛋白质，但是有两个关于菌株和质粒抗性的问题，给我菌株的同学也不能确定，故特在此求助，望用过这个菌株的朋友帮帮忙，谢过先～novagen官网上有如下两段话（有删节）Product DescriptionRosetta-gami 2 host strains ... These trxB/gor mutants are compatible with kanamycin-resistant vectors, and carry the chloramphenicol-resistant pRARE2 plasmid, which supplies seven rare tRNAs.Genotype: D(ara-leu)7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL (DE3)F′[lac+ lacIq pro] gor522::Tn10 trxB pRARE2 (CamR, StrR, TetR)在novagen出版的pET system manual(11th edition)第54页对rosetta gami 2(DE3)的描述是“...Kanamycin sensitive”。
Rosetta-gamiB(DE3)大肠杆菌菌株使用说明
pRARE (CamR, KanR, TetR)
简 介 ：
Rosetta-‐gami B 系列菌株来源于 Origami B 系列菌株，是集合了 BL21
系列，Rosetta 系列菌株和 Origami 系列菌株的优点，极大的增强了细胞内
Rosetta-gamiB(DE3)大肠杆菌菌株
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00820 Rosetta-‐gamiB(DE3)大肠杆菌菌株
基 本 信 息 ：
名称：Rosetta-‐gamiB(DE3)大肠杆菌菌株
二硫键的形成和含有在大肠杆菌中稀有密码子的真核细胞蛋白的表达能
力。Rosetta-‐gami B(DE3)系列菌株是来源于 Origami B 系列菌株，携带有
TrxB 和 Gor 基因突变，提高含二硫键正确折叠 蛋白的高效表达。本菌株
含有 pRARE 质粒，能够提供原 Rosetta(DE3)宿主菌含有的 AUA, AGG, AGA,
胞质内生成二硫键，有助于含二硫键蛋白的活性蛋白形成。TrxB 和 Gor
基因突变使得质粒能够分别具有卡那和四环素抗性，所以本菌株无法用于
卡那和四环素抗性质粒的蛋白表达。DE3 是溶源性的 λDE3, 所以带有 T7
RNA 聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于 pET 系列载体，及其他 T7 启动
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
Stable化学感受态细胞使用说明
Stable化学感受态细胞Stable Chemically Competent CellStable感受态细胞基因型F' proA+B+ lacI q∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet R) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str R) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRMS -mcrBC)Stable感受态细胞说明：Stable菌株是NEB公司开发的高转化效率菌株，是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株，具有与Stbl2，Stbl3完全不同的基因型，但是表现出比Stbl2，Stbl3更优异的性能，特别适合慢病毒或具有末端重复序列DNA片段的克隆。
基因组含有重组酶recA1 rel A1突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；同时含有核酸酶endA1突变，避免了提取质粒过程中核酸酶的污染，大大提高了高纯度病毒质粒的产量和质量。
lacZΔM15的存在使Stable可用于蓝、白斑筛选，此菌株具有四环素和链霉素抗性，Stable 感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19检测转化效率>5×108cfu/μg DNA。
Stable感受态细胞优点及应用:1.与Stbl3相比，基因组含有endA突变，提高了病毒质粒的产量和纯度。
2.比Stbl3生长速度快，倍增时间是Stbl3的1.5倍。
3.基因组中含有fhuA突变，赋予其对噬菌体T1的抗性。
4.具有较高的转化效率，pUC19检测转化效率>5×108cfu/μg DNA。
5.基因组中含有lacZΔM15，可用于蓝白斑筛选实验。
6.特别适合于不稳定DNA片段的克隆，及逆转录病毒/慢病毒载体的构建和扩繁。
Stable感受态细胞操作方法:1. Stable感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，6分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
AD494(DE3)大肠杆菌菌株使用说明
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
D (ara-‐leu)7967, lacX74, phoAPvuII, phoR, malF3, trxB::Kan
简 介 ：
AD494 菌株来源于 K12 菌，AD494 菌株含有 thioredoxin reductase
(TrxB)基 因 突 变 ， 有 利 于 细 菌 胞 内 的 二 硫 键 形 成 ， 能 够 帮 助 蛋 白 形 成 正 确
的 三 维 折 叠 ， 形 成 有 功 能 活 力 的 蛋 白 。 AD494 菌 株 中 的 thioredoxin
reductase (TrxB)突 变 具 有 卡 那 霉 素 抗 性 ，因 此 该 宿 主 菌 只 能 用 于 氨 苄 或 者
AD494(DE3)大肠杆菌菌株
编号
名称
北京华越洋生物 NRR01260
AD494(DE3)大肠杆菌菌株
基 本 信 息 ：
油菌
储 存 温 度 ： -‐80℃
基 因 组 ：
3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能 正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
dh5α与rosstea菌株的区别
dh5α与rosstea菌株的区别标题：dh5α与rosstea菌株的区别摘要：本文旨在探讨dh5α与rosstea菌株在基因转化和应用领域方面的区别。
dh5α是一种广泛应用于分子生物学研究中的大肠杆菌菌株，而rosstea则是一种用于茶叶发酵过程中的微生物。
我们将首先介绍这两种菌株的背景和特征，然后比较它们在基因转化和应用中的差异。
第一部分：dh5α菌株1. 背景介绍dh5α是一种非致病性的大肠杆菌（Escherichia coli）变种，在分子生物学中被广泛应用。
2. 特征和优势dh5α菌株具有高速生长、易于培养和转化、高转化效率等特点。
它具备较高的DNA摄取量，适用于高效的质粒转化。
同时，dh5α还具有多种抗性基因，可以用不同抗生素进行筛选。
第二部分：rosstea菌株1. 背景介绍rosstea是一种微生物，广泛存在于茶叶发酵过程中，对于红茶的特色和风味发挥着关键作用。
2. 特征和应用rosstea菌株有很强的嗜酸性和耐受能力，能够在茶叶的发酵过程中产生多种酶类和化合物，进而影响茶叶的气味和口感。
因此，rosstea在红茶的制作中具有重要地位。
第三部分：dh5α与rosstea菌株的差异1. 基因转化效率dh5α菌株由于具备高转化效率的特点，适用于大规模基因转化实验，而rosstea菌株在基因转化方面的应用较为有限。
2. 应用领域dh5α菌株主要应用于分子生物学研究，如质粒构建、基因克隆等；而rosstea 菌株主要应用于食品工业领域中的红茶制作和茶叶发酵过程。
第四部分：研究方法和前景展望1. 研究方法分子生物学和微生物学方法是研究dh5α和rosstea菌株的常用手段。
2. 前景展望dh5α菌株作为分子生物学研究的重要工具，在基因转化技术和基因工程领域具有广泛的应用前景；rosstea菌株在茶叶发酵和食品工业上的应用也在不断深入研究，有望为产品质量和口感的改良提供新的途径。
结论：dh5α和rosstea菌株作为在不同领域中发挥着重要作用的微生物，具有明显的差异。
bl21(de3)菌株专利注册购买证明
在这篇文章中，我将围绕着"bl21(de3)菌株专利注册购买证明"这一主题展开深入探讨。
我会介绍bl21(de3)菌株的背景和特点，然后分析专利注册对于该菌株的意义和作用。
我会共享我对于这一主题的个人观点和理解，以及总结回顾性的内容。
bl21(de3)菌株是一种常用的大肠杆菌菌株，在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
它具有高效的表达能力和较低的内毒素产生水平，在重组蛋白表达、蛋白纯化等方面被广泛使用。
bl21(de3)菌株在科研和工业生产中具有重要地位。
对于bl21(de3)菌株而言，专利注册是至关重要的。
专利注册可以保护bl21(de3)菌株的知识产权，防止他人非法使用或制造。
专利注册也可以为bl21(de3)菌株的进一步研究和开发提供保障，吸引更多科研机构和企业参与。
在购买证明方面，证实了授权公司或机构的正规性和权威性，为使用者提供了合法合规的保障，避免了不必要的纠纷和风险。
个人观点上，我认为bl21(de3)菌株的专利注册购买证明对于保护知识产权、促进科研和产业发展具有极其重要的意义。
在科研和生产实践中，我们应当遵守专利法律法规，尊重知识产权，合法合规地购买bl21(de3)菌株，并且支持和鼓励科研机构和企业进行创新研发。
总结回顾性地看，bl21(de3)菌株专利注册购买证明是保护知识产权、推动科研发展的重要手段，对于促进相关领域的进步和发展具有重要意义。
我们应当重视专利注册和购买证明的作用，支持和鼓励相关研究和生产实践的合法合规进行。
以上是对"bl21(de3)菌株专利注册购买证明"这一主题的全面评估和深入探讨，希望能够对你有所帮助。
大肠杆菌菌株是在分子生物学与生物技术领域中广泛使用的一种微生物。
bl21(de3)菌株作为其中的一种，具有高表达能力和较低的内毒素产生水平，因此在蛋白表达和纯化方面有着重要的应用。
而专利注册购买证明则是对该菌株知识产权的保护和合法购买的证明，对于吸引更多科研机构和企业参与以及推动科研和产业发展都具有重要的意义。
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的优点，增强了细胞内二硫键的形成和含有在大肠杆菌中稀有密码子的真核细
胞蛋白的表达能力是一种亮氨酸生长缺陷型菌株。Rosetta-gami 2(DE3)系列菌
株是来源于 Origami 2 系列菌株。而 Origami 2 系列菌株是卡那敏感的 K-12
细胞菌株，携带有 TrxB 和 Gor 基因突变提高含二硫键正确折叠蛋白的高效表达。
北京华越洋生物提供 QQ:1733351176
Rosetta-gami2(DE3)大肠杆菌菌株
产品货号
产品名称
北京华越洋生物 NRR008230 Rosetta-gami2(DE3)大肠杆菌菌株
产品信息：
名称：Rosetta-gami2(DE3)大肠杆菌菌株
规格：300ul 甘油菌
储存温度：-80℃
基因组：
Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoAPvuIIphoR araD139 ahpCgalEgalKrpsL
(DE3) F′[lac+ lacIq pro] gor522::Tn10 trxB pRARE2 (CamR, StrR,TetR) 产品简介：
Rosetta-gami 2 系列菌株集合了 Rosetta 2 系列菌株和 Origami 2 系列菌株
（必要时，可适当延长培养时间）。
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菌株传代： 将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μ l 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓 慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。 注意事项： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放 置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能 正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保 持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保藏条件： -20℃保存（复溶液于 2-8℃保存） 保藏时间： 2-10 年，应根据菌种状况及时转接
30%甘油-80℃保藏菌种，42℃热激可将质粒转入该菌株，此菌株在 IPTG 的诱
导下可进行蛋白表达。
操作说明：
1，本产品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌
表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次
数的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
表达水平。Rosetta-gami 2(DE3)中的 Gor 基因突变使得菌株具有四环素抗性。
DE3 是溶源性的 λDE3, 所以带有 T7 RNA 聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于
pET 系列载体，及其他 T7 启动子系列载体。
Rosetta-gami 2 (DE3)可使用 LB 培养基在 37℃有氧的条件下培养，然后用
本菌株含有 pRARE2 质粒，除了能够提供原 Rosetta(DE3)宿主菌含有的 AUA，
AGG，AGA，CUA，CCC，和 GGA 六个稀有密码子的 tRNA 外，还提供了第七个
稀有密码子 CGG 的 tRNA。同时，pRARE2 质粒具有氯霉素抗性。通过提供原本
在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的在大肠杆菌中的蛋白
菌落进行后续操作。
冷冻管开封：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌株复溶：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
养。细菌在 30-35℃培养箱中培养 24-48h，真菌在 23-28℃培养箱中培养 24-72h