4、质粒DNA提取与纯化(碱解法)
质粒DNA的提取和纯化
质粒DNA的提取和纯化一、实验目的掌握碱法小量提取质粒DNA。
二、实验内容质粒DNA的小量提取。
三、实验原理所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。
碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。
离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
四、实验方法与步骤㈠细菌培养和收集将带有pUC19质粒的大肠杆菌接种在LB固体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃培养12～24小时。
在超净工作台中用无菌的牙签挑取平板培养基上的单菌落接种到25ml LB液体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃振荡培养（220rpm）约18小时至对数生长后期（OD600=0.6）。
㈡碱法小量提取质粒DNA1、将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，于4℃12000rpm离心30秒，弃去上清液，将剩余的培养物贮存于4℃。
重复3次，以得到较多的细菌沉淀（视具体情况而定）。
2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、加入100μl用冰预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴2～5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴2～5分钟。
6、4℃,12000rpm离心10分钟。
将上清液转入另一只1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟。
DNA抽提和质粒DNA制备
琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化， 琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用 酚抽提方法回收DNA
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问题
从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖， 目的是（ ） A 抑制核酸酶
• B 保护DNA，防止断裂 C 加速蛋白质变性 D 有利于细胞破碎
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用SDS-酚抽提DNA时，SDS浓度十分重要， 当SDS浓度为0.1%时，（ ）
1．菌株类型 2．质粒的大小 3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控制 4．细菌的培养与收集
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（四）碱裂解法原理：
在 pHl2.0-12.6 碱 性 环 境 中 ， 线 性 的大分子量细菌染色体DNA变性， 而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然 状态。
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将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件 下，染色体DNA之间交联形成不溶性网 状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂 SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA 仍然为可溶状态。
上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅， DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约 80kb。
25
• 4 异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍 容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子 RNA（在异丙醇中可溶状态）。
• 5 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或 NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K 或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
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DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率
去除回收DNA样品中的污染物
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电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸 附带有负电荷的DNA分子。
在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳 至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。 但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
质粒DNA提取方案(碱裂解法)
质粒提取原理采用碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA 与质粒DNA的变性与复性的差异不同而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开，DNA变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，留在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA及蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
Solution I：葡萄糖可增加溶液的年度，维持渗透压，防止染色体DNA受机械剪切作用而被降解，污染质粒DNA；溶菌酶（可省略）水解菌体细胞壁的化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，具有溶菌的作用。
当pH<8.0时，溶菌酶受到抑制；EDTA有两个作用：(1)螯合Mg2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解。
(2) EDTA的存在有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度环境；Tris-HCl作为缓冲溶液维持适当的浓度和pH值。
Solution II：NaOH，DNA在5.0<pH<9.0时时稳定的，但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而使DNA变性。
加Solution II后系统的pH高达12.6，线性染色体DNA和环型质粒DNA氢键均发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键只发生部分断裂，且其两条链不会发生完全分离，待pH调至中性闭合环型质粒DNA很快复性恢复原来的构型，而染色体DNA不能复性。
SDS 是阴离子表面活性剂，它有溶解膜蛋白破坏细胞膜，解聚细胞中核蛋白，能与蛋白质结合成为R-O-SO3-···R+-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但SDS能抑制RNase的作用，所以在以后提取中必须将其除干净。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。
4℃保存备用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA （pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳二、实验原理：1.质粒DNA的提取：质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。
除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。
（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。
与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。
进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。
SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。
（2）四种溶液作用及原理：①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。
质粒DNA提取(碱变性法)_百替生物
第 1 次课 6 学时注：本页为每次课教案首页实验四、质粒DNA提取（碱变性法）一质粒1 质粒（plasmid）：是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
2 质粒与宿主细胞的关系（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。
（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。
（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿。
（4）质粒赋于宿主各种有利的表型，使宿主获得生存优势。
3 质粒提取实验在生物化学与分子生物学中具有非同寻常的意义。
是基因工程中常用的载体之一。
转基因的时候不会转移直接的外源基因，需要把外源基因连接到载体上进行转化。
载体的存在就像一个运输工具一样，把目的基因转到受体生物中。
任何的目的基因的克隆，外源基因的转入，载体的构建都绝对的离不开质粒的提取过程。
4 常用的载体质粒：是通过DNA重组技术构建而成的。
pUC18, pUC19,T-EASY等。
二提取三碱变性碱变性法主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。
染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。
质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。
由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。
四、实验步骤与方法1 接含PUC18质粒的单菌落于3ml Amp+LB液体培养基中LB液体培养基：分别称取10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、5g NaCL于1L 烧瓶中，950mlddH2O，5MNaOH调pH到7.0，补充至ddH2O1L，高压灭菌。
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化（撰弄人：newdragon）1 原理碱法应用最广，不失为一种有效的经典方式。
该法利用NaOH及1% SDS混合液作用于细菌悬浮液，将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
虽然碱性溶剂使碱基配对完全破坏，完备环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是彼此缠绕的。
只要OH-处置的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA 双链就会再次形成。
在裂解进程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA 会彼此缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以够从上清中纯化并回收复性的质粒DNA。
2 试剂准备溶液I：50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH ；高压灭菌后于4℃贮存溶液II：N NaOH / 1% SDS（新鲜配制）；溶液III：，冰乙酸，加蒸馏水至100ml配制；乙醇酚：氯仿：异戌醇（25：24：1，V/V/V）氯仿：异戌醇（24：1，V/V）TE（）含10mg/ml RNase A100ml 3mol/l NaAc: 称取•3H20，溶入90ml重蒸水中，用浓盐酸调pH至,并定容至100ml。
10mg/mlRNase：称取100mgRNase溶入10ml 10mmol/l Tris•Cl ,15mmol/lNaCl中，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，分装后于—20℃3 实验操作3．1 小量制备（1）挑取单菌落，接种到3-5ml含适当抗生素的液体培育基中，37℃，250r/min留宿震荡培育至菌液浑浊（OD600=）。
（2）将菌液倒入微量离心管中，12000g离心6min，倒去培育液。
相同操作再搜集一次菌体，尽可以吸干培育液。
（3）将细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液Ｉ中，猛烈振荡，使细菌完全分散，将离心管置于冰上。
质粒DNA的抽提、纯化与检测
是重组DNA技术中重要的载体。
质粒
质粒的特性： 相对独立性 独立的复制单位 赋予宿主细胞一些表型 与宿主菌染色体DNA不同
作为载体的质粒： 多克隆位点 选择标记 容纳较大的外源DNA
提取质粒DNA的目的与意义
2. 实验操作中应注意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？ 3. 如何通过电泳分析判断得到的质粒DNA的质量？ 4. 如果质粒DNA中残留有蛋白质或RNA，电泳后会出现什么结
果？
质粒DNA电泳步骤
制胶 取酶切后的质粒DNA溶液20 μL 、酶切对照的质粒
DNA溶液20μL，各加5×上样缓冲液5 μL ，混匀后， 用移液枪慢慢将混合物加至样品孔中；另加入 5 μL DNA Marker至另一样品孔中。 电压120V，电泳约40min-1h。
点样：
预期电泳结果
Hind Ⅲ
0.9kb
本实验所提取的质粒为重组质粒，含有插入的目的片段。如 果用EcoRⅠ和Hind Ⅲ同时切割重组质粒（含两个单一酶切 位点），就产生两条带相应酶切位点的线性DNA分子。
使用限制性内酶切的原则
限制酶的热不稳定性，选择合适的条件； 避免反复冻融，保持低温（冰浴）下进行； 酶的用量可参照酶单位的定义确定； 两种以上的酶切割DNA时应选择合适的缓冲液； 酶切反应必须使用无菌离心管及吸头号，避免交叉污染。
最慢
如果两条链均断开，即为线 状DNA
中
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
DNA
重组质粒双酶切电泳
线酶 状切 标 质质 准 粒粒
线性载体
插入片段
DNA 标准（Marker） 是分子量 不同的DNA片段，主要用途就是 DNA 分子凝胶电泳时，加样用 做对比来检测琼脂糖凝胶是否有 问题以及估算条带的大小。
微生物分子生物学技术
一、质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳（一）碱变性法提取质粒DNA质粒(Plasmid) 是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。
带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。
将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。
质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。
分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增，细菌菌体的裂解; 质粒DNA的提取与纯化。
本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA。
【原理】细菌培养物加入SDS和NaOH 碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA 一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。
用溴化乙锭（EB）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。
根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。
【材料】1．菌株E.coli JM109（pUC19），E.coli RRI（pBR322）2．试剂溶液Ⅰ( 50 mM葡萄糖, 25 mM Tris.Hcl PH 8.0, 10 mM EDTA)溶液II ( 0.2 N NaOH，1%SDS) 用前新配制溶液III ( 5 mM KAc溶液PH4.8)TE缓冲液(10mMTris.Hcl ,1mMEDTA PH8.0)LB液体培养基( 胰蛋白胨10g,，酵母粉5g, Nacl 10g. 加蒸馏水溶解，用NaOH调PH 至7.5，加水至1000 ml,15磅高压灭菌15分钟)。
【方法】1．接种细菌于5ml LB液体培养基中，370C培养过夜。
2．3000 rpm/min,离心15min，弃上清。
加入100ul 溶液1悬起细菌沉淀。
3．加入200ul前新配制的溶液II ，颠倒EP管5次混合均匀，置冰浴2min。
4．加入150ul溶液III温和地混匀，12000 rpm/min,离心5min。
质粒DNA的提取与纯化
质粒DNA 的提取与纯化实验目的：1掌握碱变性法提取质粒DNA的原理和各种试剂的作用及方法。
2学习并掌握凝胶电泳法进行DNA的分离纯化的实验原理及方法。
3学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
实验原理：简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在PH高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA烦人氢键断裂双螺旋结构解开而变性，共价闭环状质粒DNA的大部分氢键断裂而变性，但两条互补链不完全分开。
当用PH 为4.6的KAc高盐溶液调节PH至中性时，变性的质粒DNA可发生复性恢复共价闭环的超螺旋结构而溶于溶液中，而染色体DNA不能复性，与不稳定大分子缠连在一起形成沉淀，通过离心与溶于溶液中的质粒DNA分离。
溶于上清液中的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液使之凝聚成沉淀。
由于RNA与DNA 性质相似，乙醇沉淀DNA时也伴随着RNA的沉淀，可用RNA酶降解。
质粒DNA 溶液中的RNase以及一些可溶蛋白可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动速度可因电离子的大小，形态，电荷量的不同而有所差异。
质粒DNA的提取、纯化、酶切、电泳、 紫外分光光度法定量测定
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
2.3 核酸分离纯化的总原则：
(1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
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(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
11
最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的一般特性：
(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型： 菌毛、抗药性等
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溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
质粒DNA的分离与纯化t Word 文档
质粒DNA的分离与纯化吴乃虎（中国科学院遗传与发育研究所）黄美娟（北京大学生命科学学院细胞遗传学系）一. 导言1. 质粒DNA的分离应用质粒作为基因克隆的载体，—个重要的条件是要获得批量的纯化的质粒DNA 制剂。
通常所说的质粒DNA的制备，事实上包括质粒DNA的分离和质粒DNA纯化两个步骤或两个内容。
⑴质粒DNA的分离这是指应用溶菌酶或是十二烷硫酸钠(SDS)处理大肠杆菌寄主细胞，使之完全裂解，释放出完整的染色体DNA及质粒DNA。
在这个步骤，要求操作十分温和而小心谨慎，要尽量避免染色体DNA发生断裂。
大肠杆菌细胞裂解液经离心之后，获得了含有大量质粒DNA的上清液。
⑵质粒DNA的纯化在离心所得的大肠杆菌细胞裂解液上清液中，不可避免地含有寄主细胞染色体DNA 短片段，因此需要设法除去这些污染的DNA片段，使质粒DNA得以纯化出来。
2. 选择制备质粒DNA技术程序必须考虑的因素己经发展出了许多种用于制备质粒DNA的快速简易的方法。
针对不同的具体实验的对象，究竟应选择何种技术程序，主要应考虑如下这些因素：⑴所研究的目的质粒DNA分子量的大小；⑵实验程序要尽可能简单，並有良好的重复性；⑶要使用溶菌酶溶菌的细菌种属，以及溶菌酶以外的其它溶菌药剂；⑷实验方法要温和，如果是制备大分子量的质粒DNA，这点尤其要重视；⑸质粒DNA的产量(这点与质粒拷贝数密切相关)；⑹提取质粒DNA的实验用途，例如供作限制酶酶切分析，或是进行转化实验等。
3. RNA及蛋白质等污染物的去除对于—般的转化实验以及克隆过程，并不—定需要制备纯化的质粒DNA。
但是为了构建限制性酶切图谱，为了获得发表用的图片，以及—些特定的克隆程序等，则需要制备纯化的货粒DNA。
为此需要在质粒DNA纯化过程中加RNase处理以除去RNA，用酚抽取除去蛋白质，或是加入核酸酶抑制剂：焦碳酸二乙酯，以除去—些菌种中存在内源核酸酶。
二. 微量碱法制备质粒DNA1. 溶液配制（1）Solution 1[ 50mM Glucose,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA]Glucose 991.0mg2M Tris-HCl(pH 8.0) 1.25ml0.5M EDTA (pH 8.0) 2.0mlLysozyme 4mg/mlG.D.H2o --------→ 100a.Autoclaved for 15 mins at 10 b/in2 and stored at 40C。
实验十一 质粒DNA的提取与纯化
实验十一质粒DNA的提取与纯化一、实验目的与原理质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒DNA的纯化。
本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。
二、材料与试剂1、材料：大肠杆菌2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪3、试剂：Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)10 mM EDTA(pH8.0)50 mM葡萄糖高压灭菌，4℃保存Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用Solution III 5 N KAc pH4.8高压灭菌，4℃保存3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。
异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂三、操作步骤1、细菌繁殖LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min8、离心10 min，12000 rpm, 4℃9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中10、加入40 ul，3 M NaAc11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀12、离心10 min，12000 rpm, 4℃13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
质粒的提取与纯化
碱裂解法小量制备质粒DNA
基本原理
人们使用碱与 SDS 裂解法从 E.coli 中分离制备质粒 DNA已有 20 多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高 pH 值的强阴离子洗 涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体 DNA 和蛋白质变性，将 质粒 DNA 释放到上清中。尽管碱性溶液使碱基配对完全破 坏，闭环的质粒 DNA 双链仍不会彼此分离，这因为它们在 拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太 过，当pH值恢复到中性时，DN双链就会再次形成。在裂解 过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体 DNA 会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包裹。当 用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀 下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒 DNA。
细菌的制备
挑取转化细菌的单菌落 (或用0.1～1.0m1单菌落的培 养物) 接种到30m1含适当抗生素的培养基(LB、YT 或Terrific培养液)中。
为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培 养物的体积大 4倍；试管不宜盖得过紧；应在剧烈振摇下温 育。
在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚 期(OD600约为0.6)。
液转移到微量离心管，室温放置30min。
加500
μl 1.6M NaCl（含13%PEG8000），混匀，4℃， 12000rpm离心5min。
弃上清，将沉淀溶于400
μl TE(pH8.0)，用酚、酚：氯仿、
氯仿各抽提一次。
将水相移入一干净指形管中，加100 μl 10M NH4Ac， 混匀，加2倍体积无水乙醇（约1ml），室温10min， 4℃，12000rpm离心10min。（-20 ℃放置30min以 上沉淀效果更佳，如果暂时不用，可将质粒长时间 保存于乙醇中，暂时不离心。） 弃上清，加200 μl 70%乙醇，旋转洗涤， 12000rpm 离心 2min。 用400 μl TE(pH8.0)溶解沉淀。定量后-20 ℃保存。
质粒DNA的提取（碱裂解法）
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
质粒提取原理及碱法
质粒提取原理及碱法质粒提取原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
分离质粒DNA 有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。
所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。
质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA；松弛开环的OC构型；超螺旋的SC构型。
由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。
道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。
质粒小量提取之碱裂解法试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。
其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
十二烷基磺进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
用SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH 值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。
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质粒DNA提取与纯化（碱解法）
质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
一、实验目的与原理
质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA 载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒DNA的纯化
本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。
二、材料与试剂
1、材料：大肠杆菌
2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪
3、试剂：
Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)
10 mM EDTA(pH8.0)
50 mM葡萄糖
高压灭菌，4℃保存
Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用
Solution III 5 N KAc pH4.8
高压灭菌，4℃保存
3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存
异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂
三、操作步骤
1、细菌繁殖
LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜
2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液
3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃
加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min
4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min
5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min
6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃
7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min
8、离心10 min，12000 rpm, 4℃
9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中
10、加入40 ul，3 M NaAc
11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀
12、离心10 min，12000 rpm, 4℃
13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14、电泳检测提取DNA的质量
四、结果与分析超螺旋结构DNA。