一种新型杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性_王书全
抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用
抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用概述：抗菌肽（Antimicrobial Peptide，AMP）是由真核生物和原核生物产生的一类广谱抗菌活性肽。
抗菌肽MET是一种新型的AMP，对多种细菌、真菌和寄生虫展示了显著的抑菌活性。
近年来，越来越多的研究关注抗菌肽MET在微生物学领域的应用。
本文旨在探讨抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用。
一、抗菌肽MET的特性抗菌肽MET是一类具有亲水性的小分子多肽，通常由20个左右的氨基酸残基组成。
其具有多种特性，如低分子量、对广谱微生物具有高度抗菌活性、快速杀菌等。
此外，抗菌肽MET在生物体内短暂存在，并且对抗生物耐药性展示出较低的概率。
二、抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达毕赤酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种常见的真菌，在生命科学和食品工业中具有重要的应用价值。
研究表明，抗菌肽MET能够在毕赤酵母中实现表达，且其表达量与MET基因的启动子的选择和表达强度密切相关。
通过适当的基因工程技术，可在毕赤酵母中构建MET基因表达系统，从而实现高效表达抗菌肽MET。
三、抗菌肽MET与抗生素的体外联合抑菌作用近年来，多重耐药微生物的出现使得传统抗生素治疗失去了效果。
因此，探索新型抗菌药物和联合治疗策略变得尤为重要。
抗菌肽MET与抗生素的联合使用已成为一种备受关注的策略。
实验证明，抗菌肽MET与常用抗生素如青霉素、庆大霉素等能够呈现协同抑菌作用，使得微生物对抗生素的耐药性得到抑制。
此外，抗菌肽MET还能增加细菌膜对抗生素的渗透性，提高抗生素内部靶位的浓度，并通过干扰细菌的生物膜、破坏细菌的DNA和RNA合成等机制增强抗生素的抗菌效果。
四、抗菌肽MET的应用前景抗菌肽MET作为一种新型抗菌药物，具有广泛的应用前景。
其作为微生物学领域的抗菌剂，不仅能够杀灭常见的细菌和真菌，还能有效对抗抗生物耐药菌株。
牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化
牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化朱善元;王安平;王永娟;成大荣;吴双;左伟勇;洪伟鸣【期刊名称】《扬州大学学报：农业与生命科学版》【年(卷),期】2011(32)3【摘要】根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP。
获得重组质粒经SalⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌。
通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组蛋白bTAP可在含2%酸水解酪蛋白的BMMY培养基中经0.5%甲醇在28℃诱导表达72h后获得最优表达。
抑菌试验表明bTAP对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。
【总页数】5页(P19-23)【关键词】牛气管抗菌肽;毕赤酵母;表达;优化;抑菌活性【作者】朱善元;王安平;王永娟;成大荣;吴双;左伟勇;洪伟鸣【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室;扬州大学兽医学院【正文语种】中文【中图分类】S823;Q78【相关文献】1.杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化 [J], 尹佳2.抗菌肽DCD-1L在毕赤酵母中的表达及其条件优化 [J], 张丽琼;廖世奇;王鸣刚;曾家豫;王黎;袁红霞;郑群;张宁3.抗菌肽基因在毕赤酵母中分泌表达及其条件优化 [J], 储卫华;李大力;汪信4.东北林蛙皮肤抗菌肽基因在毕赤酵母中表达条件的优化 [J], 崔绍鹏;周旋;朱熬;肖向红;张晶钰5.新型抗菌肽Temporin-SHf在毕赤酵母中的表达及诱导条件优化 [J], 王莲哲;江宏浩;唐宜飞;洪军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究
论著 基础研究复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究∗杨桂茂,陶元勇,孙万里,张旭光ә(潍坊医学院附属医院检验科/临床检验诊断学省级重点实验室,山东潍坊２６１０３１)㊀㊀摘㊀要:目的㊀构建天蚕素AＧ死亡素复合基因工程抗菌肽基因C A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９),并在毕赤酵母中表达.方法㊀采用重叠区基因扩增法(S O E)人工合成复合肽基因,同载体p P I C ZαA连接后转化毕赤酵母受体菌XＧ３３,通过博莱霉素抗性筛选得到的阳性克隆用甲醇诱导表达,并对产物进行抗菌活性检测,建立抗菌谱.结果㊀复合肽基因C A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９)成功克隆到载体p P I C ZαA上,鉴定结果与预先设计的基因序列一致,在甲醇诱导下复合肽基因得到表达,并得到临床分离的７６株革兰阴性和革兰阳性耐药致病菌的最小抑菌浓度,最小抑菌浓度可达到５μg/m L.结论㊀成功获得了具有抑菌活性的复合基因工程抗菌肽,且该复合肽对临床常见多重耐药菌株均有明显的抑杀作用.关键词:复合抗菌肽;㊀天蚕素A;㊀死亡素;㊀毕赤酵母表达系统;㊀抑菌活性D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１８．１２．００９中图法分类号:R９３;Q７８文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１８)１２Ｇ１４３９Ｇ０５文献标识码:AS t u d y o n e x p r e s s i o na n da c t i v i t y o f c o m b i n a n t a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e i n P i c h i a p a s t o r i s∗Y A N GG u i m a o,T A OY u a n y o n g,S U N W a n l i,Z HA N GX u g u a n gә(D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,S h a n d o n g P r o v i n c i a lK e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a lL a b o r a t o r yD i a g n o s t i c s/A f f i l i a t e dH o s p i t a l o f W e i f a n g M e d i c a lU n i v e r s i t y,W e i f a n g,S h a n d o n g２６１０３１,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e㊀T oc o n s t r u c t c e c r o p i nAＧt h a n a t i nc o m b i n a n t g e n ee n g i n e e r i n g a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e g e n eC A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９)f o r e x p r e s s i o n i n P i c h i a p a s t o r i s．M e t h o d s㊀T h e c o m b i n a n t a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e g e n e w a s a r t i f i c i a l l y s y n t h e s i z e dv i a g e n es p l i c i n g b y o v e r l a p e x t e n s i o n(S O E)．T h e g e n e w a sc l o n e di n t ot h e p P I C ZαAv e c t o r a n d t r a n s f o r m e d i n t o P i c h i a p a s t o r i s XＧ３３b y e l e c t r o p o r a t i o n．T h e p o s i t i v e c l o n e s o b t a i n e db y t h e s c r e e n i n g o f b l e o m y c i n r e s i s t a n c ew e r e i n d u c e db y m e t h a n o l,a n d t h e a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f t h e p r o d u c t s w a s d e t e c t e d a n d t h e a n t i m i c r o b i a l s p e c t r u m w a s e s t a b l i s h e d．R e s u l t s㊀T h e c o m b i n a n t p e p t i d e g e n eC A(１Ｇ７)ＧT (４Ｇ１９)w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d o n t h e c a r r i e r p P I C ZαA．T h e i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t sw e r e c o n s i s t e n tw i t h t h e p r eＧd e s i g n e d g e n e s e q u e n c e．T h e c o m b i n a n t p e p t i d e g e n ew a s e x p r e s s e du n d e r t h e i n d u c t i o no fm e t h a n o l,a n d t h e m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n o f７６s t r a i n s o fG r a mＧe g a t i v e a n dG r a mＧp o s i t i v e p a t h o g e n i c b a c t e r i a i s o l a t e d f r o mt h e c l i n i cw a so b t a i n e d,a n dt h em i n i m u mi n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n w a su p t o５μg/m L．C o n c l u s i o n㊀A c o m b i n a n t g e n e t i c e n g i n e e r i n g a n t i m i c r o b i a l p e p t i d ew i t h a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y w a s o b t a i n e d s u c c e s s f u l l y a n d i t h a do b v i o u s i n h i b i t i o ne f f e c t o n c l i n i c a l c o m m o nm u l t i d r u gＧr e s i s t a n t s t r a i n s．K e y w o r d s:c o m b i n a n t a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e;㊀c e c r o p i nA;㊀t h a n a t i n;㊀P i c h i a p a s t o r i s e x p r e s s i o ns y sＧt e m;㊀a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y㊀㊀抗菌肽是一种普遍存在于生物体内,由机体自身产生的具有多种生物学活性的多肽类物质[１].一般抗菌肽具有相对分子质量小,热稳定性好,不易产生耐药性,抗菌谱广,作用机制独特等特点[２].目前已被分离的抗菌肽中有数十种具有抗菌活性,包括单一肽和复合肽,它们不仅可以杀灭细菌,对真菌㊁病毒和原虫也有一定杀灭作用[３Ｇ４].在作用于细胞方面,仅对发生病变的真核细胞有明显杀伤作用,对正常细胞几乎无损伤,对机体具有保护作用.近年来,对抗菌肽的研究越来越重视,力求寻找其替代抗生素的可能性.有研究表明,抗菌肽的生物活性除了由自身序列决定外,还受净正电荷数㊁疏水性㊁α螺旋结构稳定性９３４１国际检验医学杂志２０１８年６月第３９卷第１２期㊀I n t J L a bM e d,J u n e２０１８,V o l．３９,N o．１２∗基金项目:潍坊医学院科技创新基金资助项目(K１３０２０２３).㊀㊀作者简介:杨桂茂,男,主管技师,主要从事病原体的分子诊断研究.㊀ә㊀通信作者,EＧm a i l:１３９５３６２０９６２＠１６３．c o m.㊀㊀本文引用格式:杨桂茂,陶元勇,孙万里,等．复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究[J]．国际检验医学杂志,２０１８,３９(１２):１４３９Ｇ１４４２．等多种理化因素及空间结构的影响[５Ｇ６].天蚕素A来自于家蚕,为阳离子型抗菌肽,其蛋白结构为双亲α螺旋结构,具有广谱的杀菌能力,热稳定性好且对正常细胞无杀灭作用.有研究发现,天蚕素A的N端序列对于其抗菌活性具有重要作用[７Ｇ９].死亡素是在昆虫斑腹刺益蝽中发现的小分子抗菌肽[１０],结构简单,对革兰阳性菌㊁革兰阴性菌和某些真菌都有抑制作用,但是对金黄色葡萄球菌的抗性较低[１１].因此,探寻一些长度显著缩短但仍具广谱抗菌活性且对人体无害的多肽就成了人们努力的目标.本研究选取抗菌肽天蚕素A的第１~７个氨基酸残基及死亡素的第４~１９个氨基酸残基,以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了复合肽C A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９)基因.此设计既避免了在体内应用时引起免疫反应,又增强了其杀菌的活性,通过优化该复合肽在酵母表达体系中的表达条件,使其达到高效稳定的蛋白表达量,从而建立新型复合基因工程抗菌肽的高效毕赤酵母表达体系及生产工艺,并初步探讨其抑菌活性,为临床后期选择理想的抗菌药物提供新的领域.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀菌株㊀毕赤酵母受体菌XＧ３３由南京农业大学提供,表达载体p P I C ZαA购于I n v i t r o g e n公司, D H５α㊁实验菌株由本实验室保存.１．１．２㊀主要试剂㊀D N A标准相对分子质量M a r kＧe r㊁T４D N A连接酶㊁限制性内切酶购自T a K a R a公司;P C R试剂盒㊁细菌D N A提取试剂盒㊁D N A凝胶回收试剂盒购自P r o m e g a公司.１．２㊀复合抗菌肽基因引物的设计与合成㊀以现有的抗菌肽的作用机制假说为根据,利用重叠区扩增基因拼接法(S O E)[１２]人工合成复合肽基因,并在两端分别引入X h oⅠ㊁X b aⅠ酶切位点.自行设计特异性引物,序列如下.P１:５ᶄＧC C G C T C G A G A T G C A T C A T C A T C A T C A T C A T A A A A G A A A G T G G A A G C T G T T CA A G A A G A T CG G TC C A G G TＧ３ᶄ;P２:５ᶄＧT A G T C TA G AC T AG A AC T TC T TC T TC T T G T G C A G G A A C T T A C C T G G A C C G A T C T T C T TＧ３ᶄ.另设计合成另一对引物用于重组载体及重组酵母菌的鉴定,序列如下.F１:５ᶄＧG A C T G G T T C C A A T T G A C A A G CＧ３ᶄ;F２:５ᶄＧG C A A A T G G C A T TC T G A C A T C CＧ３ᶄ.P１㊁P２和F１㊁F２均由上海生物工程公司合成.应用S O E法,以P１㊁P２互为模板㊁互为引物采用降落P C R(T DＧP C R)技术进行扩增.T DＧP C R反应体系(２５μL):P１１μL,P２１μL,２ˑP C R M a s t e rM i x １２．５μL,双蒸水(d d H２O)１０．５μL.扩增条件:９４ħ１m i n;９４ħ３０s,退火温度从６５ħ降至５０ħ,每个循环１m i n,每个循环降低０．５ħ,７２ħ３０s,循环３０次;延伸７２ħ５m i n.２．０％琼脂糖凝胶电泳检测P C R产物.１．３㊀重组表达载体的构建和鉴定㊀合成的复合抗菌肽基因和p P I C ZαA均用X h oⅠ㊁X b aⅠ双酶切,分别电泳胶回收后用T４D N A连接酶连接,连接产物转化E．c o l i D H５α,涂布于含２５μg/m LZ e o c i n的L B平板３７ħ过夜,挑转化子培养抽提质粒后进行酶切鉴定,并送I n v i t r o g e n公司测序.１．４㊀重组载体转化毕赤酵母XＧ３３及转化后的筛选鉴定㊀测序确认后的阳性克隆提取质粒后用S a cⅠ处理使其线性化,取５μg与８０μL感受态的毕赤酵母XＧ３３相混合,１．５k V㊁２５μF㊁２００Ω电击后,均匀涂布于Y P D Z培养平板上,置３０ħ培养箱至单菌落出现.采用煮Ｇ冻Ｇ煮法制备P C R模板[１３],以F１㊁F２为引物,反应体系同上,反应条件:９４ħ５m i n;９４ħ３０s;５２ħ４５s;７２ħ４５s,３０个循环;７２ħ６m i n.以能扩出６０７b p的克隆定为阳性转化子.以同样方法将p P I C ZαＧA空载体酶切线性化后电转化XＧ３３酵母菌,作为质粒对照.１．５㊀复合抗菌肽在摇瓶中的诱导表达及浓度和初步抗菌活性测定㊀将筛选到的阳性克隆酵母菌接种到５m LB MG Y培养基中,３０ħ振荡培养至O D６００达到３~６;室温２０００r/m i n离心５m i n收集菌体,垂悬于２５m LB MMY培养基中继续振荡培养,期间每隔２４h补加终浓度为２％(V/V)的甲醇.７２h后,１００００r/m i n离心５m i n收集培养液上清,用B C A法测定浓度,并将培养液加到已接种待检菌的琼脂平板小孔内进行初步抑菌活性测定.１．６㊀重组抗菌肽抗菌谱的完善㊀用液体生长抑制法测定重组抗菌肽对临床常见耐药致病菌的最小抑菌浓度(M I C).将能完全抑制菌体生长的最低抗菌肽浓度确定为M I C.试验菌株来自潍坊医学院附属医院检验科分离的临床常见致病菌,均进行了药敏测试.具体操作:把处于对数生长期O D６００ʈ０．５的各个菌株用L B培养液稀释到１０６C F U/m L,分别接种到９６孔细胞培养板上,每孔接种５０μL,然后分别加入稀释的不同浓度的抗菌肽５０μL,混匀.每组重复３个孔,设只加L B培养液的孔为阴性对照,不加抗菌肽接种细菌的L B培养液为阳性对照.３７ħ培养２０h后取出,测量其O D值,以O D值无变化的孔中抗菌肽的浓度作为M I C.２㊀结㊀㊀果２．１㊀复合抗菌肽基因的扩增㊀通过P C R扩增的复合抗菌肽基因经２％琼脂糖凝胶电泳,可观察到大小约为８７b p的单一条带,与预期大小一致,见图１.２．２㊀重组质粒的酶切鉴定和序列测定㊀取博莱霉素抗性筛选的转化子经培养后抽提重组质粒.分别用X h oⅠ和E c o RⅠ单酶切,重组质粒上X h oⅠ㊁X b aⅠ０４４１ 国际检验医学杂志２０１８年６月第３９卷第１２期㊀I n t J L a bM e d,J u n e２０１８,V o l．３９,N o．１２间的E c o R Ⅰ酶切位点缺失,限制性内切酶X h o Ⅰ酶切可以使其线性化,而用E c o R Ⅰ不能使其线性化,见图２.经缺失酶切位点鉴定阳性的重组质粒测序,截取复合肽基因片断测序图谱见图３,与预期设计一致.㊀㊀注:１．P C R 产物;M．D N A M a k e r图１㊀㊀复合抗菌肽基因㊀㊀注:M．D N A M a k e r ;１．pP I C Z αA ;２．重组p P I C Z αA X h o Ⅰ单酶切;３．重组p P I C Z αA E c o R Ⅰ单酶切图２㊀㊀单酶切鉴定图３㊀㊀复合肽基因序列测定㊀㊀注:１．pP I C Z αA ;２．重组体图４㊀㊀复合抗菌肽对大肠埃希菌(G －菌)的抑菌活性２．３㊀复合抗菌肽初步抗菌活性测定㊀抑菌活性测定结果显示,在加有３０μL 重组酵母菌表达产物的孔周围形成一透明抑菌圈,加有３０μL p P I C Z αA 空载体转化酵母的上清的孔周围无抑菌圈.研究表明抗菌肽对革兰阴性菌(G －菌)大肠埃希菌和革兰阳性菌(G ＋菌)金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌活性,抑菌圈直径分别为３２m m 和４６m m ,而p P I C Z αA 空载体转化的酵母菌表达产物没有抑菌活性,见图４㊁５.通过B C A 法测定复合抗菌肽终浓度为１５０m g /L .２．４㊀重组抗菌肽抗菌谱的完善及M I C 测定㊀用菌体液体生长抑制法测得该复合肽对临床分离的７６株耐药致病菌的M I C 分别见表１㊁２.结果显示,复合肽对多重耐药的G ＋菌和G －菌均具有良好的抑菌作用.㊀㊀注:１．pP I C Z αA ;２．重组体图５㊀㊀复合抗菌肽对金黄色葡萄球菌(G ＋菌)的抑菌活性表１㊀㊀复合肽对临床分离的５５株G －菌的M I C (μg /m L )菌株名称M I C菌株名称M I C鲍曼不动杆菌１１５．０肺炎克雷伯菌８１０．０鲍曼不动杆菌２５．０肺炎克雷伯菌９７．５鲍曼不动杆菌３５．０嗜水气单胞菌１７．５鲍曼不动杆菌４７．５铜绿假单胞菌１７．５鲍曼不动杆菌５１５．０铜绿假单胞菌２７．５产酸克雷伯菌１７．５铜绿假单胞菌３１５．０产酸克雷伯菌２１０．０铜绿假单胞菌４１５．０产酸克雷伯菌３７．５铜绿假单胞菌５１５．０产酸克雷伯菌４７．５铜绿假单胞菌６５．０产酸克雷伯菌５１０．０铜绿假单胞菌７１５．０大肠埃希菌１１０．０铜绿假单胞菌８１５．０大肠埃希菌２７．５洋葱伯克霍德菌１１０．０大肠埃希菌３１０．０洋葱伯克霍德菌２７．５大肠埃希菌４５．０洋葱伯克霍德菌３１０．０大肠埃希菌５１０．０阴沟肠杆菌１７．５大肠埃希菌６１０．０阴沟肠杆菌２７．５大肠埃希菌７７．５阴沟肠杆菌３７．５大肠埃希菌８１０．０阴沟肠杆菌４１５．０大肠埃希菌９１０．０阴沟肠杆菌５７．５１４４１ 国际检验医学杂志２０１８年６月第３９卷第１２期㊀I n t J L a bM e d ,J u n e ２０１８,V o l ．３９,N o ．１２续表１㊀㊀复合肽对临床分离的５５株G－菌的M I C(μg/m L)菌株名称M I C菌株名称M I C 大肠埃希菌１０７．５阴沟肠杆菌６７．５大肠埃希菌１１１０．０阴沟肠杆菌７７．５肺炎克雷伯菌１７．５阴沟肠杆菌８５．０肺炎克雷伯菌２７．５阴沟肠杆菌９７．５肺炎克雷伯菌３７．５阴沟肠杆菌１０７．５肺炎克雷伯菌４７．５阴沟肠杆菌１１１５．０肺炎克雷伯菌５７．５阴沟肠杆菌１２７．５肺炎克雷伯菌６７．５黏质沙雷菌１１０．０肺炎克雷伯菌７７．５黏质沙雷菌２７．５㊀㊀注:同种名称细菌不同编号代表来自不同标本的菌株表２㊀㊀复合肽对临床分离的２１株G＋菌的M I C(μg/m L)菌株名称M I C菌株名称M I C 表皮葡萄球菌１７．５金黄色葡萄球菌５７．５表皮葡萄球菌２７．５金黄色葡萄球菌６７．５表皮葡萄球菌３７．５人葡萄球菌１３．７表皮葡萄球菌４５．０人葡萄球菌２１０．０表皮葡萄球菌５７．５人葡萄球菌３５．０鹑鸡肠球菌１１０．０溶血葡萄球菌１５．０鹑鸡肠球菌２７．５溶血葡萄球菌２７．５金黄色葡萄球菌１３．０溶血葡萄球菌３７．５金黄色葡萄球菌２７．５溶血葡萄球菌４７．５金黄色葡萄球菌３３．０屎肠球菌１１０．０金黄色葡萄球菌４１０．０㊀㊀注:同种名称细菌不同编号代表来自不同标本的菌株３㊀讨㊀㊀论㊀㊀利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达蛋白质是近年发展起来的一种新兴分子生物学技术.巴斯德毕赤酵母是一种能高效表达重组蛋白的表达受体,该系统在D N A重组技术中已被广泛地应用.另外,真菌表达系统中的酵母菌与其他菌不同,酵母菌分泌到细胞外培养基中蛋白几乎都是分泌表达的外源蛋白,其自身的内源蛋白很少分泌到胞外,从而可以从培养基中获得较高表达量的目的蛋白,且利于表达产物的后期分离纯化.近年来,为了提高抗菌肽的表达量和抑菌能力,研究人员尝试对抗菌肽蛋白结构进行氨基酸的修饰,从而寻找决定抗菌肽活性的关键序列,并进一步进行分子设计,以获得抗菌肽的最佳活性.同时,将不同功能和结构的多肽杂合在一起进行研究,国内外也有相关报道[１４Ｇ１６].本研究截取了天蚕素A和死亡素的部分发挥作用的序列,串联重组后利用酵母表达系统进行甲醇诱导表达,结果复合肽C A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９)以分泌形式释放到培养基中,成功实现了复合抗菌肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达.本研究中,从抗菌谱实验结果可以看出,所合成的复合肽对临床常见耐药致病菌株均有很好的抑制和杀灭作用,尤其是对一些临床分离的多种耐药鲍曼不动杆菌及泛耐药鲍曼不动杆菌均有明显的抑杀活性,M I C达到５μg/m L,而且与细菌的耐药率无关,如鲍曼不动杆菌５与来自其他标本的４株鲍曼不动杆菌相比,其耐药率明显低于其他４株,但M I C却比其他４株要高.M I C测定结果还显示,该复合肽对临床常见的鲍曼不动杆菌㊁产酸克雷伯菌㊁铜绿假单胞菌㊁洋葱伯克霍德菌㊁阴沟肠杆菌㊁黏质沙雷菌等G－菌及表皮葡萄球菌㊁鹑鸡肠球菌㊁金黄色葡萄球菌㊁人葡萄球菌㊁溶血葡萄球菌㊁屎肠球菌等G＋菌均有明显的抑菌活性.在实验阶段内,尚未发现对该复合肽不敏感的临床标本分离细菌菌株.㊀㊀本研究成功构建了重组载体并顺利电转化到表达宿主毕赤酵母XＧ３３中,获得了具有抑菌活性的复合基因工程抗菌肽.抑菌活性试验显示,复合抗菌肽对临床常见致病菌株均有较好的抑杀活性.它的出现为人们寻找理想的抗菌药物提供新的领域,虽然人们不断研制新型抗菌药物或改造原有抗菌药物来杀灭耐药致病菌,但是常规抗菌药物研制速度较慢,且容易使细菌产生耐药性,因此治疗耐药菌感染的局限性越来越明显.抗菌肽由于其独特的抗菌机制有望替代抗菌药物应用于耐药菌感染的治疗,从而为解决细菌耐药性这一棘手难题提供了新途径.因此,很有可能成为临床上最有前景的抗菌药物.参考文献[１]单安山,马得莹,冯兴军,等．抗菌肽的功能㊁研发与应用[J]．中国农业科学,２０１２,４５(１１):２２４９Ｇ２２５９．[２]卫旭彪,武如娟,郑召君,等．抗菌肽的免疫调节功能及其作用机制[J]．饲料工业,２０１５,３６(２２):５５Ｇ５８．[３]L A K S HMA I A H N A R A Y A N AJ,C H E NJY．A n t i m i c r oＧb i a l p e p t i d e s:p o s s i b l ea n t iＧi n f e c t i v ea g e n t s[J]．P e p t i d e s,２０１５,７２:８８Ｇ９４．[４]H U R O T H A N H A,B A H R A N IH,S H A N K A RE M,e 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c r o p i n AＧm a g a i n i n２a n d c e c r o p i n AＧm e l i t t i nh y b r i d p e p t i d e s[J]．JP r o t e i nC h e m,１９９９,５０(４):２７９Ｇ２８５．(收稿日期:２０１７Ｇ１２Ｇ２７㊀修回日期:２０１８Ｇ０３Ｇ０７)７４４１国际检验医学杂志２０１８年６月第３９卷第１２期㊀I n t J L a bM e d,J u n e２０１８,V o l．３９,N o．１２。
昆虫抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达的开题报告
昆虫抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达的开题报告题目：昆虫抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达引言：自然界中存在着许多昆虫抗菌肽，具有广谱抗菌作用，对许多病原微生物有一定的杀灭效果。
昆虫抗菌肽通常由20-50个氨基酸残基组成，具有低分子量、稳定性和高效性的特点，因此具有成为天然抗菌剂的潜力。
毕赤酵母是一种广泛应用于生物学实验中的单细胞真核生物。
它具有许多优良的特性，如容易培养、对环境适应性强、遗传修饰容易等。
同时，毕赤酵母也被广泛用于蛋白质表达、分泌以及研究中。
本研究旨在通过化学合成或基因工程技术，合成出具有抗菌活性的昆虫抗菌肽，并将其转化到毕赤酵母中进行表达，以期在工业或医药领域发挥其广泛的应用价值。
研究内容及方法：1. 昆虫抗菌肽的合成从天然界中筛选出具备广谱抗菌活性的昆虫抗菌肽，并且在其基础上进一步对其进行化学合成。
合成昆虫抗菌肽的方法通常有两种，一种是基于固相合成技术，另一种是基于溶液相合成技术。
固相合成技术是在小球上连续合成昆虫抗菌肽，连续反复洗涤。
溶液相合成技术是在溶液中合成昆虫抗菌肽。
2. 在毕赤酵母中的表达用基因工程技术将昆虫抗菌肽基因插入到毕赤酵母的表达载体中，并将其转化到毕赤酵母中进行表达。
首先进行真核细胞基因的克隆和表达载体的构建。
并采用PCR 扩增、酶切、连接等技术，将昆虫抗菌肽基因与可表达载体进行连接。
常用的表达载体有pYES2、pPICZ、pGAP等。
选择合适的载体将其转化到毕赤酵母中，然后进行酵母细胞的培养、分离、表达、纯化以及抗菌活性分析等工作。
预期结果：通过本研究，可以制备出具备较高抗菌活性的昆虫抗菌肽，并且成功将其转化到毕赤酵母中进行表达。
通过对毕赤酵母中表达的昆虫抗菌肽的特性分析，将有助于深入了解昆虫抗菌肽在不同系统中的表达及其抗菌机制，为其广泛应用于工业和医药领域提供支持。
生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展
中 国 病 原 生 物 学 杂 志 2009 年 9 月 ! ! 第 4 卷第 9 期 ! Sept emb er 2009, ! V ol. 4, N o. 9 J ournal of Pathogen Biology
综述 生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展
孔凡红, 仲维霞, 崔勇, 王洪法*
( 山东省寄生虫病防治 研究所 , 山东济宁 272033) 摘要 ! 抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽 , 广泛存在 生物界。抗菌肽 具有广谱 抗菌活性 , 有良 好的应 用前景 , 使其 走 向临床的最大的挑战是如何用基因工程技术低成本大量生产 抗菌肽产 品。抗菌肽天然 提取资源 有限且 提取难 度大 , 难 以实现规模化生产 ; 人工合成成本太高 , 难以实现产业化 , 目前多局限 于研究用途。 毕赤酵母表 达系统 适用于 多种生 物 抗菌 肽的表达 , 多种表达策略的采用可以提高表达量 , 毕赤酵母表达抗菌肽具有良好的应用前景。本文综 述了抗菌肽 毕 赤酵母表达的研究进展。 关键词 ! 抗菌肽 ; 毕赤酵母 ; 综述 中图分类号 ! Q393. 92 ! ! ! 文献标识码 ! A ! ! ! 文章编号 ! 1673 5234( 2009) 09 0700 03
结果显示复合抗菌肽plsd具有很酸稳定性而针对不同的细菌复合抗菌肽则表现出了强于单独的sd的活性特别是对大肠杆菌在以酵母为宿主菌的抗菌肽基因工程中多数研究都实现了目的蛋白的表达产物对工程菌没有明显的抑制作用为了使表达量增高采用了各种不同的表达策略合表达改造后表达串联表达和复合表达等都有一定的预期结果
eases , J ining 272033, Shandong, China) Abstract ! A ntimicr obial peptides( A M Ps) a re amphiphilic, positively char ged mo lecules that have emerg ed as no vel an timicro bial ag ents. M any different kinds of A M P s hav e been identified fro m var ious o rg anisms. A M Ps have br oad spec tr um of antibact erial activities. P reparation o f A M P s at a larg e scale is a sig nificant challenge in o rder to dev elop co mmer cial product s. L imited resources of nat ur al antimicro bial peptide and diff iculties in extr action make antimicro bial peptide har d to achieve lar ge scale pr oductio n; a rtificial synthesis of antimicr obial peptide is limited to research fo r its high co st and difficulty to industr ialization. Pichia p astor is ex pr ession system is applicable to a w ide r ang e o f bio log ical antimicr obi al peptide, and the level of ex pr essio n can be increased by var ious st rateg ies, so P . p astor is sy st em has a go od application pr ospects in antimicr obial peptide pr oduction. T his paper focuses o n the advances of P . p astor is ex pression. Key words ! A nt imicro bial( A M Ps) ; Pichia p astor is ; review
抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定
抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定刘德辉;何俊;林云熊;黄毓茂【摘要】为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL37.pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrⅡ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168.经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合.在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237 mg/L.表达产物耐热性强,在100℃条件下30 min内仍保持一定的抗菌活性.表达产物对大肠杆菌DH5 α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)002【总页数】5页(P98-101,120)【关键词】抗菌肽LL-37;基因设计;高效表达;活性鉴定【作者】刘德辉;何俊;林云熊;黄毓茂【作者单位】华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S852.5抗菌肽(Antimicrobial peptides)最初是从昆虫的血淋巴细胞中发现的一类碱性多肽类物质，具有广谱抗菌活性，是生物先天性免疫的重要组成成分[1]。
Boman G 等人首次从天蚕蛹中发现抗菌肽Cecropins[2]，作为一种阳离子小肽，抗菌肽以其高效、广谱、抗菌机理独特等优点，日益成为最具开发前景的新型抗菌药物。
抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定
抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定李忠清;王亮【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)006【摘要】利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性.将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K 中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinBD通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母GS115宿主菌,G418抗性筛选,得到高拷贝转化子.经PCR检测,LfcinBD基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinBD,诱导表达5 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽衍生肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较强抗菌活性的抗菌肽,而且对氨苄青霉素抗性的大肠杆菌亦有较强的抑菌作用.【总页数】5页(P145-149)【作者】李忠清;王亮【作者单位】中国科学院新疆分院理化技术研究所,乌鲁木齐,830011;新疆金牛生物有限公司,乌鲁木齐,830026;中国科学院研究生院,北京,100039;中国科学院新疆分院理化技术研究所,乌鲁木齐,830011;中国科学院研究生院,北京,100039【正文语种】中文【相关文献】1.鸡源抗菌肽FoliCidin-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物学活性鉴定 [J], 李荣荣;和祯泉;鲍恩东;陈溥言2.家蝇抗菌肽Defensin在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 [J], 金小宝;王婷婷;朱家勇;李小波;马艳;褚夫江;卢雪梅3.抗菌肽牛乳铁多肽素(LfcinB)在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 [J], 易俊波;黄德新;李凌云;林枫4.抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定 [J], 刘德辉;何俊;林云熊;黄毓茂5.抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定[J], 苏志坚;吴晓萍;郑青;黄亚东;庞实锋;冯雅;李校堃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗菌肽CecropinD在毕赤酵母中的表达_纯化及活性鉴定
基金项目:云南省自然科学基金资助项目(No:2004C0029Q).作者单位:中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所分子生物室(昆明650118).通讯作者:孙茂盛,E mail:yinna988@中国图书分类号 R392.11 Q 786 文献标识码 A 文章编号 1004 5503(2008)03 0185 05基础研究抗菌肽Cecropin D 在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定尹娜 李鸿钧 彭梅 谢天宏 张光明 施锐 孙茂盛摘要 目的 在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。
方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K 。
重组表达质粒pPIC9K D 转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0 5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM Sepharose 层析柱纯化,Tricine SDS PAGE 分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。
结果 经Tricine SDS PAGE 检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D 对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。
结论 抗菌肽Cecropin D 成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。
关键词 抗菌肽;Cecropin D;毕赤酵母;分泌表达;抗菌活性Expression of Antibacterial Peptide Cecropin D in Pichia pastoris and Purificationand Activity of Expressed ProductYIN Na,LI Hong jun,PE NG Mei,et al(Instiute o f Medical Biolo gy ,Peking Union Medical College,Chinese Academ y o f Medical Sciences,Kunming 650118,China )Abstract Objective To express antibacterial peptide cecropin D in Pich ia p astoris and determine the activi ty of expressed product.Methods Six oligonucleotide fragments were synthesized according to the codon bias of Pichia pastoris ,then phosphorylated,annealed,linked and cloned to expression vector pPIC9K.The constructed recombinant plasmid pPIC9K D was transformed to Pichia p astoris GS115,and posi ti ve clones were screened with G418for expression under induction of 0.5%methanol.T he expressed product was puri fied by C M Sepharose chromatography,idntified by Tricine SDS PAGE,and determined for antibacterial activi ty by agarose diffusion test and turbidimetry.Results Cecropin D wi th a relative molecular mass of about 3900was expressed and reached a puri ty of more than 90%after purificati on.It showed antibacterial activi ty to both Gram positive and negative bacteria.C onclusion Cecropin D was successfully expressed in Pichia p astoris ,which laid a foundation of further study on antibacterial peptide.Key w ords Antibacterial peptide;Cecropi n D;Pichia pastoris ;Secretory expression;Antibacterial activity1975年瑞典科学家B oman 等人从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到一种抗菌肽,并将其命名为Ce cropin 。
凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA在毕赤酵母菌中的表达
凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA在毕赤酵母菌中的表达作者：马春霞彭金霞何苹萍雷爱莹马宁王瑞黎铭来源：《南方农业学报》2017年第07期摘要：【目的】明确凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA（LvcrustinA）在毕赤酵母菌中的表达情况，为研发出一种基于重组蛋白crustinA的新型水产药物打下基础。
【方法】采用全基因合成法（PAS）合成LvcrustinA基因，然后将LvcrustinA基因克隆至真核表达载体pYE-GAPα，所得重组质粒转化感受态细菌TOP10，以质粒提取试验盒提取的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA 电转至毕赤酵母菌GS115；以SDS-PAGE电泳检测和Western blotting鉴定分析融合蛋白LvcrustinA的表达情况，并通过保护试验验证融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌的抵抗作用。
【结果】以构建的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转毕赤酵母菌GS115，获得的重组菌株在30 ℃下摇床（220 r/min）培养24 h即可获得融合蛋白LvcrustinA，且随培养时间的延长，其表达量逐渐增多。
Western blotting鉴定结果显示，纯化的融合蛋白LvcrustinA能被抗His抗体识别。
保护试验结果表明，融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌具有良好的抵抗力。
【结论】利用表达质粒pYE-GAPα和酵母菌GS115可成功重组表达获得LvcrustinA，且获得的LvcrustinA 具有促进凡纳滨对虾抵抗副溶血弧菌感染的作用。
关键词：凡纳滨对虾；抗菌肽；毕赤酵母菌；真核表达中图分类号： S945.46 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）07-1310-070 引言【研究意义】抗菌肽（Antimicrobial peptides）又称抗微生物多肽或肽抗生素，是一类由生物细胞特定基因编码且经特定外界条件诱导产生的多肽（乔玮等，2014）。
人类抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的分泌表达和纯化
标准重组 DNA 技术 。按照毕赤酵母密码子的偏 好性 , 合成了一段包含肠激酶识别位点的 99 bp 的 hepc id in 序 列, 将 其 插 入 p MD19 T 载 体。质 粒 经 PCR 以 及 DNA 测 序 验 证。 hepcid in 片 段 用 带 有 E coR I位点的上 游引物 ( F: 5!ATGAATTCGACGAT GACGATAAGA 3!) 和 带 有 N ot I 位 点 的 下 游 引 物 ( R: 5!ACGCGGCCGCTCATTAAGTCTT 3!) 扩增。引 物酶切位点便于后续将 hepcidin蛋白编码序列克隆 到 pP IC9K 表达载体。 PCR 产物用 E co RI 和 No t I双 酶切连接到用相同酶切 过的 pP I C 9K 表达载体 上。 得到的 pP IC9K H 质粒通过酶切和测序验证。 1 . 2 . 2 毕赤酵母转化以及 H is M ut 转化子筛选 毕赤酵母通 过电转 化, 感 受态 细胞 制备 参考文 献 [ 10]。转化过 程使用 B io Rad Gene Pulser II 电转 仪, 电转参数 2. 5 kV / c m, 50 F 和 400 。涂有转 化菌的 RDB G418 琼脂平板在 29∀C 培养 3~ 4 d 。 H is 和 G418抗性菌株挑到 MM 和 MD 平板上 29∀C
-5 -5 - 5
根据其合成部位 ( 肝脏 ) 和体外抗菌性质将其命名 为 hepcid in 。 hepcidin 是在肝细胞中合成的 富含半 胱氨酸的阳离子多肽 , 对肠内铁离子的吸收起关键 的调节作用 作用
[ 5] [2 , 4]
, 通过与铁的输出膜转运蛋 白相互
[ 6]
, 减少肠内铁的吸收并抑制巨噬细胞内铁的 提出 hepcidin 在医学上可以用于
拟穴青蟹抗菌肽scygonadin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性
拟穴青蟹抗菌肽scygonadin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性许婉芳;谢嘉华;陈慧芸【摘要】采用PCR方法克隆获得拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因成熟肽片段，将其连接到Pichia pastoris酵母表达载体pPIC9K中，构建了分泌表达载体pPICgk-Scy．电击转化毕赤酵母GS115，经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合人酵母基因组中．以甲醇诱导表达阳性克隆，上清中表达产物经过Tricine-SDS-PAGE鉴定与预期的目的蛋白大小（约10ku）相符．并利用琼脂孔穴扩散法证明了表达产物能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长．%The mature peptide sequence of antimicropeptide scygonadin in Scylla paramamosain was subcloned into Pichla pastoris expression vector pPIC9K to construct the secretory expression vector pPIC9k-Scy and subsequently transformed into the GSI15 yeast strain using the electroporation. The positive clones, of which the chromosomes were integrated with scygonadin gene, were identified using the phenotype screning and PCR. Then they were induced by methanol and the expression product in the supernatant of about I0 ku, as preriously predicted was examined using Tricine-SDS-PAGE. Results of agarose diffusion assay indicate that the expressed scygonadin exhibits the antibacterial activity against both Gram negative bacteria and Gram positive bacteria.【期刊名称】《泉州师范学院学报》【年(卷),期】2011(029)006【总页数】5页(P11-15)【关键词】抗菌肽scygonadin;毕赤酵母;分泌表达【作者】许婉芳;谢嘉华;陈慧芸【作者单位】泉州师范学院化学与生命科学学院,福建泉州362000;厦门大学,海洋与环境学院,近海海洋环境科学国家重点实验室,福建厦门361005;泉州师范学院化学与生命科学学院,福建泉州362000;厦门大学,海洋与环境学院,近海海洋环境科学国家重点实验室,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】Q78抗菌肽具有广谱高效抗菌活性，不易产生抗性，在生物体天然免疫反应中起着非常重要的作用.抗菌肽分布广泛，在动物、植物和微生物中均有发现［1－2］.抗菌肽被认为是鱼、虾、贝等防御系统的主要成分之一.甲壳动物中发现的抗菌肽较少，主要有来源于凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）的Penaeidins家族和血蓝蛋白（hemocyanin）的C端、蓝蟹的callinectin以及拟穴青蟹（Scylla paramamosain）中具有很强抑菌活性的抗菌肽scygonadin等［3－6］.与其他种类相比，来源于鱼、虾、蟹等水生动物的抗菌肽杀菌作用更强，其抗菌肽更具良好的应用前景［7］.目前，抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点，主要集中在应用基因工程技术克隆与表达抗菌肽基因等.在病原菌对抗生素的耐药性日趋严重的情况下，抗菌肽将可能成为新的抗菌药物来源.随着各种表达系统研究的发展，体外表达的抗菌肽将在医学领域中具有更广阔的应用前景.许多研究结果证明，体外表达的抗菌肽与其天然分子同样具有明显的抗菌活性［8－9］.关于水产类的抗菌肽基因体外表达的研究报道较少.美洲黄盖鲽的pleurocidin抗菌肽基因和拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因在大肠杆菌中进行了融合表达［10－11］.黑鲷抗菌肽hepcidin和大菱鲆抗菌肽hepcidin分别在毕赤酵母（Pichia pastoris）中成功表达出具有抗菌活性的蛋白［12－13］.由于抗菌肽对原核宿主菌通常具有很强的杀伤作用，因此一般采用融合表达或在酵母中表达.由于原核融合表达后下游加工过程复杂，本文采用P.pastoris系统在体外重组表达拟穴青蟹抗菌肽scygonadin.1 材料1.1 表达载体与菌株表达载体pPIC9K、毕赤酵母菌株GS115、宿主菌Escherichia coli TOP10F’购自Invit rogen公司（San Diego，CA）；检测用菌株有大肠杆菌（E.coli，DH5α）、溶壁微球菌（Micrococcus luteus）由厦门大学海洋与环境学院提供. 1.2 酶与试剂各种酶、DNA Ligation Kit购自TaKaRa公司；胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxiod公司；丙烯酰胺、N，N’－亚甲基双丙烯酰胺购自BBI公司；Qiaquick Gel Extraction Kit购自QIA GEN公司；G418硫酸盐购自华美生物工程有限公司；质粒小量纯化试剂盒购自U－gene公司；硅珠DNA提取试剂盒购自鹭隆公司；Multi－Copy Pichia Expression Kit购自Invitrogen公司；低分子量标准蛋白质Marker购自BIO－RAD公司；其他试剂均为分析纯.2 方法2.1 引物设计、PCR扩增和pMD－18 T－Scy质粒的构建以Scy的5＇race cDNA（编码102个氨基酸，本实验室黄文树提供）为模板，按图1设计引物，引物 W1：其中划线部分为EcoRⅠ 和NotⅠ 的酶切位点（图1）.图中箭头表示信号肽断裂位点；星号表示终止密码子；划线部分为引物结合位点.引物合成由上海Invitrogen公司完成.用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增.产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析，目的条带用Gel Extraction KitⅡ回收.将纯化的扩增产物与pMD－18Simple T vector质粒按照说明书进行连接.转化至E.coli DH5α感受态细胞中，对具有氨苄青霉素抗性的单菌落进行PCR扩增及质粒酶切鉴定后，进行DNA核苷酸序列测定，该质粒标记为pMD－18T－Scy.图1 青蟹scygonadin在酵母中的分泌表达序列和推测的氨基酸序列2.2 pPIC9k－Scy表达载体的构建按照常规方法进行DNA分子的酶切、连接和转化.以pMD－18T－Scy质粒为模板，W1和 W2为引物，利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增scygonadin片段.切胶回收后，用EcoRⅠ和NotⅠ内切酶酶切并清洗回收.大量制备pPIC9K真核表达载体用NotⅠ酶和EcoRⅠ酶分别进行酶切，并用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化后以DNA凝胶回收试剂盒进行回收和纯化.将具有相同粘性末端的pPIC9K真核表达载体与拟穴青蟹scygonadin基因的回收片段及T4DNA连接酶在16℃下连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞中；挑取具有氨苄青霉素抗性的单菌落进行PCR 扩增及质粒酶切鉴定，再进行序列测定，重组质粒标记为pPIC9K－Scy.2.3 pPIC9K－Scy表达载体在毕赤酵母中的转化将pPIC9K－Scy表达载体用SalⅠ限制性内切酶线性化，用电击法将线性化的载体转化GS115酵母感受态细胞中（参照Bio－Rad电转仪和试剂盒说明书）.以转入空白pPIC9K载体的酵母作为对照.转化后的细胞涂于不含His的MD平板上，30℃培养48h至产生单克隆，筛选出发生同源重组的His＋转化子.2.4 酵母多拷贝转化子的筛选和PCR鉴定将各个His＋转化子置于96孔细胞培养板进行连续传代培养，使之达到相同细胞浓度.取20μL细胞悬液于含有不同终浓度（分别为0.5，1.0，1.5和2.0mg／mL）G418的YPD培养基中孵育，终体积为200μL.30℃培养2～5d后筛选多拷贝转化子.将筛选的克隆子先后在MM和MD平板上平行培养，进行Mut S（利用甲醇缓慢）表型鉴定.挑取His＋Mut S表型的克隆子接种于5mL YPD培养基中，30℃培养24h后离心收集菌体，用硅珠DNA提取试剂盒提取酵母基因组DNA.重组P.pastoris基因组中的scygonadin以5’AOX1引物（5’－GACTGG TTCCAATTGACA AGC－3’）和引物 W2为引物进行基因组PCR鉴定.PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析.以无基因插入的空载体转化克隆为阴性对照，观察有目的基因整合的酵母阳性菌株.2.5 pPIC9K－Scy酵母重组子的诱导表达挑取经过筛选鉴定的6个His＋Mut S表型重组酵母转化子，以10mL BMGY培养基进行小规模的表达实验，优化酵母的发酵条件，包括接种菌的OD值、时间、温度、培养基的pH 值、甲醇浓度等，确定重组scygonadin的最佳表达条件.将细胞继续在400mL的BMGY培养基上培养，直到培养基达到OD600＝5（对数生长期，大约16～18h），1500～3000g室温下离心5min收集细胞.将细胞重悬在400mL BMMY培养基中用甲醇诱导蛋白质的表达96h（250～300r／min，每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5%，用0.22μm滤膜过滤除菌）.每24h取1mL 表达培养基离心取上清，经三氯乙酸法浓缩后，进行16.5%Tricine－SDS－PAGE 电泳分析表达产物，银染法检测表达产物.2.6 scygonadin表达蛋白抗菌活性的检测采用琼脂孔穴扩散法，以E.coli DH5α和溶壁微球菌为实验菌株，将100μL E.coli DH5α悬浮液（A650＝0.15）均匀涂布于营养肉汤琼脂平板上（含琼脂1%）.在平板上用灭菌的打孔器（直径5mm）打孔，孔中滴加100μL浓缩10倍的诱导72h后的待测表达上清，以同体积的pPIC9k空载体转化酵母的10倍浓缩上清作为阴性对照，100μg／mL的氨苄青霉素（Amp）为阳性对照，培养至菌体长出后观察抑菌效果，测量抑菌圈直径.大肠杆菌的培养温度为37℃，溶壁微球菌的培养温度为28℃.3 结果与分析3.1 scygonadin成熟肽序列扩增及含有成熟肽片断的质粒pMD－18 T－Scy的构建利用特异性引物W1和W2扩增scygonadin基因，1.5% 琼脂糖凝胶电泳图谱见图2.图中M为DL2000 DNA Marker，1为空白对照，2为PCR扩增产物.由图中可见，1条特异性条带约300bp，与预期的目的条带大小相符.将纯化的扩增产物与pMD－18Simple T vector质粒进行连接，构建pMD－18T －Scy质粒，利用特异性引物W1和W2，以pMD－18T－Scy质粒为模板扩增出约300bp的片断，与预期扩增条带大小一致.同时，提取质粒进行EcoRⅠ和NotⅠ内切酶酶切鉴定见图3.图中M为DL2000DNA Marker，1为经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后线性化的pMD－18T－Scy质粒.由图中可见在300bp处有一条与目的片段大小一致的条带.3.2 酵母表达载体的构建及重组酵母菌株的筛选与鉴定将电泳带切胶回收后连到具有相同粘性末端的线性化的pPIC9K载体上，转化入E.coli TOP10F’中，经过PCR、酶切鉴定后测序，结果表明连接到毕赤酵母分泌表达载体上的基因片段为scygonadin，并确定读码框正确.用G418来筛选多拷贝克隆子，结果显示大部分克隆子能抗1.5mg／mL G418.将这些克隆子在MM和MD琼脂平板上同时培养以鉴定其生长表型，结果显示均为利用甲醇缓慢型Muts.挑取MD板上His＋Muts表型的克隆提取酵母基因组DNA，PCR反应扩增出与pPIC9K／Scy质粒阳性对照大小相同的特异条带（图4），图中M为DL 2000DNA Marker，1为重组酵母基因组为模板的PCR产物，2为以pPIC9K／Scy质粒为阳性对照的PCR产物.由图可知，目的基因已经成功整合到酵母基因组中.3.3 重组scygonadin在毕赤酵母中的分泌表达及表达产物的鉴定将表达量较高的重组酵母单克隆接种到BMGY培养基中培养到OD600＝5后，转到BMMY培养基中诱导.在24～96h中每24h取上清保存，并在浓缩后进行电泳观察见图5.图中M为低分子量蛋白Marker，2～5分别为重组子在甲醇诱导24，48，72和96h后的TCA浓缩上清.由图可知，诱导不同时间后均在约10ku位置出现1条蛋白质条带，与预期的目的蛋白分子量相当，表达量随着时间的延长逐渐增加，在96h表达量达到最高（1.0mg／L）.3.4 重组scygonadin的抗菌活性抗菌实验的初步结果显示，重组scygonadin对革兰氏阳性菌溶壁微球菌有较好的杀菌活性，抑菌圈直径为1.60cm，对革兰氏阴性菌E.coli DH5α的杀菌活性相对较弱，抑菌圈直径为1.10cm，而阴性对照pPIC9K转化子诱导的上清无显示抑菌活性，如图6所示.图中1为pPIC9K转化子诱导的上清，2为pPIC9K／Scy酵母重组酵母转化子诱导的上清，3为100μg／mL的Amp.图5 Tricine－SDS－PAGE电泳检测重组scygonadin不同诱导时间的表达量图6 重组scygonadin对大肠杆菌（A）、溶壁微球菌（B）的抑菌活性测定4 讨论目前，抗菌肽的来源有3种：天然提取、人工合成和基因工程表达.但是天然抗菌肽含量太低，而人工合成抗菌肽成本高且活性不稳定，因而实际应用中较少采用.目前较多使用的是利用微生物发酵生产抗菌肽.在过去的研究中，研究者更倾向于利用真核表达载体.毕赤酵母真核表达系统表达量高，蛋白翻译后经过修饰、加工及折叠后往往具有生物活性，发酵条件简单，适合高密度培养，很适合于表达外源活性蛋白.相较于在大肠杆菌中融合表达的美洲黄盖鲽的pleurocidin抗菌肽基因，其产物活性因重组抗菌肽C末端添加Gly而受到显著影响，在毕赤酵母中表达的黑鲷抗菌肽hepcidin则显示了较强的抗菌活性，其表达产物具有很强的热稳定性，能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长［12－13］.此外，在大肠杆菌中进行融合表达的拟穴青蟹抗菌肽scygonadin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，但对酵母和真菌没有体现抑制作用［11］.毕赤酵母真核表达系统更容易使表达产物具有生物活性.本研究构建了拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因的胞外分泌型表达载体，并利用毕赤酵母菌株GS115在体外成功大量表达，获得了对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抗菌活性的表达产物.该结果与国内外报道的相关抗菌肽的抗菌作用类似［11，14－15］.不同的是，本研究表达的重组蛋白对大肠杆菌（E.coli DH5α）具有一定的抑菌活性，而原核融合表达的scygonadin重组蛋白对大肠杆菌没有体现抑菌活性［11］.尽管在本实验中，浓缩的表达产物抑菌直径比氨苄青霉素的抑菌直径小，使用的细菌数量较少，但经过进一步的改进和更多的抑菌实验，将会提高产物的表达量、活性及应用范围，且由于抗菌肽无公害、无耐药性等优点，在医药卫生和食品保健美容等方面仍然具有良好的开发前景.本研究的结果将为进一步研究拟穴青蟹抗菌肽scygonadin的性质和功能，开发绿色环保型的抗菌肽工程菌株作为水产品饲料添加剂、增强水产养殖病害防治提供理论依据.参考文献：［1］MARSHALL S H.Antimicrobial peptides：a natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology［J］.Electronic Jounal of 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一种杂合抗菌肽毕赤酵母工程菌制备方法及应用[发明专利]
![一种杂合抗菌肽毕赤酵母工程菌制备方法及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f6ff9217f705cc1754270913.png)
专利名称：一种杂合抗菌肽毕赤酵母工程菌制备方法及应用专利类型：发明专利
发明人：李本涛,李帅伟
申请号：CN201210149859.X
申请日：20120515
公开号：CN103205370A
公开日：
20130717
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种杂合抗菌肽LFB_Mel和编码该蛋白的基因Lfcin B_Mel，其DNA序列如序列表中1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中2所示。
本发明根据酵母偏爱密码子重新设计杂合抗菌肽基因Lfcin B_Mel，合成其DNA序列转化于毕赤酵母中表达，形成杂合抗菌肽基因的毕赤酵母工程菌。
同时优化该菌发酵条件，达到高密度发酵和高效表达的效果。
该工程菌发酵液对Gram菌、Gram菌及真菌等均有明显的抑制作用。
将发酵液制成的产品应用于猪的饲料中，均有较好的饲养效果。
该抗菌肽制品能够代替抗生素，能够预防消化道疾病、促进生长、增加体重，可以作为畜禽饲料添加剂。
申请人：广州格拉姆生物科技有限公司
地址：510000 广东省广州市萝岗区科学城科汇发展中心(自编A-5栋602房)
国籍：CN
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厚壳贻贝Mytilin-1成熟肽在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性
厚壳贻贝Mytilin-1成熟肽在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性张亚莉;陶妍;谢晶;钱韻芳【摘要】贻贝素(Mytilins)是一类主要在贝类血细胞中表达的阳离子小分子抗菌肽,包括多种同工型,它们在免疫系统中发挥了重要作用,Mytilin-1是其中的一种同工型.厚壳贻贝(Mytilus coruscus)Mytilin-1的一级结构由信号肽、成熟肽和C端的延伸肽组成;其成熟肽决定了Mytilin-1的生物学活性,它由34个氨基酸残基组成,其中8个保守的半胱氨酸残基在空间上能形成4对二硫键,对Mytilin-1的稳定性和活性起了关键作用.以厚壳贻贝的Mytilin-1成熟肽为重组DNA表达的目的蛋白,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性对编码该成熟肽的密码子进行优化,合成的目的基因\"mMy1\"与表达载体pPICZαA连接后电转至毕赤酵母X-33,通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子,获得的阳性转化子在29℃、250 r/min、pH6.0的条件下,使用1％甲醇诱导表达96 h;培养液上清经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析证明:重组mMy1在毕赤酵母X-33中得到成功表达,其分子量为4.8 kD.抑菌试验表明,重组mMy1对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及革兰氏阴性的大肠杆菌(Escherchia coli)具有抑菌活性.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2019(035)007【总页数】7页(P54-60)【关键词】厚壳贻贝;Mytilin-1成熟肽;毕赤酵母;重组表达;抑菌活性【作者】张亚莉;陶妍;谢晶;钱韻芳【作者单位】上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306;上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306;上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306【正文语种】中文近年来，随着水域环境的污染，水生生物遭受病原微生物侵染的问题越来越严重。
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目前，抗生素的耐药性问题已引起人们的广泛关注，因此，研制新型抗生素或其替代品已迫在眉睫［1-2］。
迄今为止，已有500多种抗菌肽被分离鉴定，可大致分为4类：天蚕素（Ceropins）、蛙皮素（Ma－gainin）、蜂毒素（Melittin）、防御素（Denfensin）。
这些抗菌肽除了具有广谱的抗菌活性外，还具有高效的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤活性。
随着对抗菌肽作用机制、分子结构与功能关系等研究的逐步深入，人们在发掘新抗菌肽的同时，更注重寻找高效、广谱、低毒、肽链较短的抗菌肽，杂合肽即为一类这样的新型抗菌肽［3-5］。
人工设计杂合肽是目前研究的热点之一，即选择一种抗菌肽为蓝本，对某些氨基酸进行替换、删减其本身的一些氨基酸残基、在此基础上与另外一种抗菌肽的片段拼接。
研究表明，一些经过改造的抗菌肽具有与蓝本相似或更高的活性，毒副作用降低，而且变短的肽链也为降低合成成本奠定了基础［6-7］。
毕赤酵母具有对外源蛋白翻译后正确加工、安全性好且易于发酵等特点，已广泛应用于基因工程产品的生产［8-12］。
本实验人工合成杂合抗菌肽CA （1-11）CD（12-37）ME（1-18）（ADM），在毕赤酵母中进行表达，并对其生物活性进行鉴定，为相关新药的研发奠定了基础。
1.材料与方法1.1菌株及质粒大肠杆菌DH5α购自TaKaRa公司；E.coli基金项目：辽宁省教育厅资助（2008427）．作者单位：辽宁医学院（辽宁锦州121000）．通讯作者：马鸣潇，E-mail：lnmcwsq1968＠126．com 【基础研究】一种新型杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性王书全李明马鸣潇【摘要】目的在毕赤酵母中表达杂合抗菌肽CA（1-11）CD（12-37）ME（1-18）（ADM），并检测其抗菌活性。
方法根据毕赤酵母（Pichia pastoris）偏爱密码子，合成杂合抗菌肽CA（1-11）CD（12-37）ME（1-18）基因，插入pPIC9K载体，构建重组表达质粒pPIC9K-ADM，电转化至毕赤酵母GS115，筛选阳性菌株，甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE检测ADM蛋白的表达，并对其抗菌活性进行初步检测。
结果重组表达质粒pPIC9K-ADM经双酶切和测序鉴定证明构建正确；阳性酵母转化子的PCR产物可见目的基因条带；杂合抗菌肽在毕赤酵母GS115中获得分泌表达，可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13％；且对E.coli DH5α、E.coli JM109和金黄葡萄球菌具有一定的抗菌活性。
结论已在毕赤酵母GS115中表达了具有一定抗菌活性的杂合抗菌肽ADM，为相关新药的研究奠定了基础。
【关键词】杂合子；抗菌肽；毕赤酵母；基因表达；抗菌活性【中国图书分类号】R978．1Q789【文献标识码】A【文章编号】1004-5503（2011）02-0173-04Expression of a Novel Hybrid Antibacterial Peptide in Pichia pastoris and Its Antibacterial ActivityWANG Shu-quan，LI Ming，MA Ming-xiao（Liaoning Medical University，Jinzhou121000，Liaoning Province，China）【Abstract】Objective To express hybrid antibacterial peptide CA（1-11）CD（12-37）ME（1-18）（ADM）in Pichia pastoris and determine its antibacterial activity．Methods Hybrid antibacterial peptide ADM gene was synthesized by using P.pastoris-refer－ent codon，and inserted into vector pPIC9K．The constructed recombinant plasmid pPIC9K-ADM was transformed to P.pastoris GS115by electron transformation，and positive recombinants were screened for expression under induction of methanol．The ex－pressed ADM protein was identified by Tricine-SDS-PAGE and determined for antibacterial activity．Results Both restriction analy－sis and sequencing proved that recombinant plasmid pPIC9K-ADM was constructed correctly．Target gene fragment was amplified from the positive recombinants．Hybrid antibacterial peptide ADM was expressed in P.pastoris GS115．The expressed product in sol－uble form contained about13％of total somatic protein，and showed certain antibacterial activities to E.coli DH5α，E.coli JM109 and S.aureus．Conclusion The hybrid antibacterial peptide with a certain antibacterial activity was expressed in P.pastoris GS115，which laid a foundation of development of relevant new drugs．【Key words】Heterozygote；Antibacterial peptide；Pichia pastoris；Gene expression；Antibacterial activityJM109和金黄葡萄球菌（S.aureus）为辽宁医学院畜牧兽医学院微生物实验室保存；毕赤酵母菌GS115和毕赤酵母穿梭表达载体pPIC9K购自Promega公司。
1.2主要试剂质粒小量提取纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和基因组提取试剂盒为北京威格拉斯技术有限公司产品；DNA marker DL2000和DNA markerλ-E－coT14Ⅰ为宝生物工程（大连）有限公司产品；限制性内切酶SnaBⅠ、NotⅠ、Taq聚合酶和DNA Ligation Kit Ver.2.1为TaKaRa公司产品；Lipofectamine TM2000为Invitrogen公司产品。
1.3基因的设计及合成根据GenBank中登录的几种抗菌肽的成熟肽段氨基酸序列（0708214A、CAA29872、P68408），选用酵母偏爱密码子，利用DNASTAR软件设计杂合抗菌肽CA（1-11）CD（12-37）ME（1-18），为了保证抗菌肽CA（1-11）CD（12-37）（AD）与ME具有天然N-端，在其N-端加上Kex2蛋白酶裂解位点，在C-端添加上终止密码子TAA，并在两端分别引入SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，基因全长198bp，由宝生物工程（大连）有限公司协助合成。
1.4重组表达质粒的构建将合成的抗菌肽基因片段及pPIC9K质粒分别经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切，回收目的基因片段及载体片段，按摩尔体系比4∶1经DNA Ligation Kit Ver.2.1 16℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于含50mg／L氨苄西林的LB琼脂板，倒置于37℃恒温箱中过夜培养；次日挑取单菌落，接种于10ml含50mg／L氨苄西林的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；提取质粒，进行双酶切SnaBⅠ／NotⅠ鉴定，阳性菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pPIC9K-ADM。
1.5酵母转化将重组表达质粒pPIC9K-ADM和空载体pPIC9K 分别电击转化感受态毕赤酵母GS115，涂布于MD 平板，30℃孵育2～3d，将阳性菌株分别接种于MM和MD选择培养基平板上，挑选在MM平板上生长缓慢，而在MD平板生长良好的菌株（His＋Mut s 表型），用基因组提取试剂盒提取酵母基因组DNA，以其为模板，用酵母载体上通用引物（α-Factor：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1：5′-GC-AAATGGCATTCTGACATCC-3′，购自上海生工生物工程技术服务有限公司）进行PCR扩增。
反应条件为：94℃预变性5min；94℃1min，55.5℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.6目的基因的诱导表达将阳性转化子接种于100ml BMGY培养基中，30℃培养至菌体A600＝5.8时，5000r／min离心15min，收集菌体，经20ml BMMY培养基重悬，继续培养，每隔24h加入终浓度为1％的甲醇诱导表达，5d后离心收集菌体和上清，进行Tricine-SDS-PAGE分析［13］。
1.7杂合抗菌肽抗菌活性的测定采用琼脂孔穴扩散法，以E.coli DH5α为实验菌株，将10μl A600＝0.5的E.coli DH5α菌悬液与25ml50℃LB固体培养基混匀后倒平板，待其凝固后用无菌打孔器（直径5mm）打孔，在孔中加入30μl GS115／pPIC9K-ADM诱导表达上清（ADM含量为2.3μg），37℃培养8～10h，观察并测量抑菌圈直径。
以加入15μl Amp（20mg／ml）作为阳性对照，GS115／pPIC9K的诱导表达上清作为阴性对照。
1.8杂合抗菌肽抗菌谱的测定按照1.7项方法检测抗菌肽对E.coli DH5α、E.coli JM109和金黄葡萄球菌的抑菌效果。
2.结果2.1重组表达质粒的鉴定重组表达质粒pPIC9K-ADM的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见198bp和9276bp两条带，大小均与预期一致，见图1。
测序结果表明重组表达质粒构建正确。
1：DNA markerλ-EcoT14Ⅰ；2：DNA marker DL2000；3：质粒pPIC9K-ADM经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切图1重组表达质粒pPIC9K-ADM的双酶切鉴定Fig1.Restriction map of recombinant plasmid pPIC9K-ADMbp123bp2000100075050025010092761982.2酵母转化子的鉴定GS115／pPIC9K-ADM 的PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见393bp 的条带（抗菌肽与侧翼α因子信号肽195bp 之和），而空载体转化子可见195bp 的条带，阴性转化子未见特异条带，见图2。