大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养

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大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。

2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。

2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。

2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。

原代培养

原代培养：清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。

一般4~7天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，2~3周出现致密细胞层。

待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。

细胞传代：将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。

弃掉清洗液，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为2~4 min。

这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。

在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。

然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。

然后根据细胞密度, 以1: 2~4分瓶培养。

每2~3天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为7~10天)再传代。

hpsusan2006 wrote:我们培养血管平滑肌采用的也是组织块法，尝试想用消化酶消化老养不成，但组织块法从组织块爬出细胞挺费时间，要好几个礼拜，一旦细胞传代后速度就快了，方法和上面说的差不多（北国木棉）但是我们胰酶浓度用的0.2％的，可供大家参考，还用双抗液用的浓度100U/ml。

下面是一张组织块周围爬出的细胞。

我现在的方法是组织块法，效果还是理想的。

就我的经验而言，一般5－7天细胞就可以从组织中爬出来了。

但是那些一开始取材时就游离出来的细胞倒是最快长成集落（一般3到4天）。

有几点我个人的经验：1.取材要熟练，尽量缩短时间，如果可以把从取材到铺瓶的时间缩短到15分钟以内，那么最终的成功率会比较高。

时间拖得越长，最终的细胞长出来的时间越是慢甚至最后会失败。

各类神经元细胞的培养方法

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。

神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。

(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。

(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。

(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。

我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一、鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。

在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。

1、材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。

（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。

（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。

（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。

（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。

2、结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。

大鼠大脑皮质神经元的原代培养

大鼠大脑皮质神经元的原代培养【摘要】目的探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法。

方法体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元，应用免疫细胞化学法及电子显微镜鉴定神经元。

结果用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达85%，生长状态较佳。

结论以Neurobasal-A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳，纯度较高，是体外研究神经系统相关理论的良好模型。

【关键词】大脑皮质; 神经元; 疾病模型，动物；细胞，培养的ABSTRACT: Objective To establish a primary culture method of the rat cortical neurons. Methods Primary culture of cortical neurons was made from newborn rats. Immunocytochemical and electronic micoscopic methods were used to identify the cultured neurons. Results The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 grew quite well and the purity was about 85%. Conclusion The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 medium are active and rather pure and could be a good model for research of the nervous system.KEY WORDS: cerebral cortex; neurous; disease models，animal; cells，cultured; nuride中枢神经系统的各种疾病如缺氧缺血性脑病、中风等对大脑皮质神经元均有不同程度的损伤，为研究其具体的作用机理及防治措施，建立合适的体内外模型至关重要。

神经元细胞原代培养完美版说明(重医舟之行)

神经元细胞原代培养完美版说明1.材料选择。

一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。

胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。

因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA 受体。

和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。

很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。

2.培养基选择(neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。

我强烈不建议用血清培养。

原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量;其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。

严重的毒性会影响许多灵敏实验;再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。

Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。

需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。

培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。

其中，neurobasal是胎鼠培养基，而-A 为新生鼠培养基。

不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。

很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。

由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。

注意!由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27(也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金)，血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。

所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。

另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。

大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.3.解剖过程一定要全程在冰上遇冷。

大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养(严选优质)

大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月一、试剂1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2)DMEM（Invitrogen,11995-065）3)FBS（Invitroge,10099-141）4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5)B27（Invitrogen ,17504-044）6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）10)dd H2O11)10％水合氯醛12)75％酒精二、器械1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）3)200目不锈钢筛4)细胞计数器（求精）5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）10)注射器：50ml、5ml各 111)Pipette and pipette tips12)冰袋、手套、棉球、棉签Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。

2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。

神经元原代培养

神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。

选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。

对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。

将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。

灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。

2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。

3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200µl或400µl/tube分装, -20度储存。

母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。

配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。

用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。

4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50µl/tube，-20℃保存。

使用时需将终浓度调整为25µM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。

配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。

例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。

5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。

6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。

神经细胞图片集锦（高清）

神经细胞培养精美图片一、细胞种类：原代培养大鼠脑皮质神经元细胞培养天数：8天放大倍数：倒置相差显微镜放大200倍细胞状态说明：细胞之间形成明显的神经网络，神经元胞体呈圆形或椭圆形，突起细长多为2到3个。

二、【原创图片】神经细胞1. 细胞种类：胎鼠（16天）皮层神经元2. 培养的天数：5天3. 放大倍数：数码相机套在倒置显微镜镜头上拍的，倍数不确切。

4. 培养基种类：Neurobasal＋B27＋L-glutamine5. 细胞状态与特征简述：贴壁生长，胞体类圆形，见丝状突起连成网络状。

三、1、细胞种类：大鼠脑皮质神经元2、培养的天数：8天3.放大倍数：倒置荧光显微镜×1004. 培养基种类：高糖DMEM培养基＋10％胎牛血清5.细胞状态与特征简述：MAP-2染色阳性的神经元，染色主要集中在神经元的树突和胞体。

四、1、细胞来源：大鼠脑灰质2、细胞种类：活化的小胶质细胞3、培养的天数：8天4、放大倍数：倒置显微镜×4005、培养基种类：高糖DMEM培养基＋10％胎牛血清6、细胞状态与特征简述：小胶质细胞是脑内的免疫细胞，正常静息状态下呈分支状，本照片为脑损伤后CD68鉴定的染成红色的活化的圆形小胶质细胞。

五．【原创】原代海马神经元细胞1.细胞种类：原代海马神经元细胞；2.Wistar新生24小时大鼠3.培养的天数：原代第7天；4.放大倍数：倒置显微镜 X400；5.培养基种类：DMEM/F12加10%胎牛血清和2%B27（换液用的是无血清培养基）；6.细胞状态与特征简述：神经细胞形态典型，胞体粗大，轴突相互交叉，突起成网络。

六、【原创】1.细胞种类：S-D大鼠原代海马神经元2.培养的天数：第七天3.放大倍速：倒置显微镜放大倍数：100倍4.培养基种类：DMEM+5%马血清＋NT-35.细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长，呈锥形或圆形，3－4个突起，透光度很好。

底层有很多扁平的细胞，胞体紧挨着，大部分没有突起，培养第五天时底层以铺满。

新生大鼠皮层神经元原代培养及糖-氧剥夺损伤模型的建立

新生大鼠皮层神经元原代培养及糖-氧剥夺损伤模型的建立目的建立较为简便的新生大鼠皮层神经元细胞原代培养方法并建立糖-氧剥夺细胞损伤模型。

方法取新生的大鼠（24 h）大脑皮层组织，消化后种植在多聚-L-赖氨酸包被的六孔培养皿上，用含10%胎牛血清DEME-HG液种植，4~8 h 后换再用含有B27的Neurobasal培养基维持饲养。

于不同时间点在倒置相差显微镜下观察形态变化，用免疫组化方法对神经元特异性标记物NSE染色鉴定。

选取培养第7 d的神经元随机分为不作处理的对照组和过糖-氧剥夺建立细胞损伤模型组，Western blotting检测NSE蛋白表达。

结果2~8 h神经元细胞贴壁，随着时间的延长，形态呈多变，突起逐渐增多，神经元突起间相互接触形成网络，培养7~10 d时神经元胞体最为丰满，通过免疫组化验证证明所分离培养的是神经元细胞。

糖-氧剥夺细胞损伤模型组NSE蛋白表达量较对照组NSE蛋白表达量明显降低。

结论该神经元方法简单易行，神经元纯度较高，并成功的建立糖-氧剥夺神经元损伤模型。

标签：神经元；原代培养；neurobasal培养基；B27；糖-氧剥夺；细胞模型神经元细胞培养技术是一种常用的技术，广泛用于神经系统疾病的细胞模型[1]，可为神经系统的发病机制和神经保护性药物的筛选提供良好的平台。

在以往关于缺血/缺氧脑损伤的研究中，主要集中在动物体内研究，虽然在体试验更接近动物的实际状态，但易受到其他因素影响。

体外原代培养神经元细胞，可以得到比较均一的细胞，可根据实验要求控制神经元细胞的生成，有利于动态观察神经元细胞的形态学变化，从而避免了体内研究的许多复杂因素的影响[2]。

1资料与方法1.1一般资料出生后新24 h内的SD大鼠，购于新疆医科大学实验动物中心；Neurobasal培养液、B27培养基添加剂、胎牛血清、0.25%胰酶、（life technology-GIBCO）；DEME高糖培养基（Hyclone）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体（abcam公司）；多聚-L-赖氨酸、SP免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。

新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定

新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【摘要】目的探讨新生大鼠视皮层神经元的原代培养方法,以获取数量多、纯度高的视皮层神经元.方法取新生1d内的SD大鼠视皮层,通过胰酶消化法获取单细胞悬液,倒置相差显微镜下计数后种植于6孔培养板内培养.培养24 h后用终浓度10μmol·L-1阿糖胞苷处理,抑制非神经元的生长,作用24h后半量换液,以后每隔1d半量换液1次.每天倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况和形态变化,Nissl染色法进行视皮层神经元鉴定,免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶鉴定培养视皮层神经元的纯度.结果接种4h后,大部分细胞已贴壁,细胞立体感较强；接种后24h,大部分细胞长出短的突起,细胞形态发生变化,胞体呈多边形或三角形,细胞周围有或多或少的光晕；培养4d后,细胞突起伸长、增粗；培养6～8d后,细胞状态较佳,细胞胞体饱满,光晕明显,突起进一步伸长、增粗,且分支多,突起交织成网状,非神经元细胞减少,为实验的最佳时间；培养14 d后,细胞开始退化.培养6d行焦油紫染后,倒置相差显微镜下观察,可见细胞内的尼氏体呈蓝紫色的颗粒或斑块.免疫荧光染色结果显示,原代培养的细胞中,大部分细胞为绿染细胞,形态良好,核大而清晰,神经元所占比例高.结论本研究获得视皮层神经元的方法简单经济,通过形态学观察、Nissl 染色及免疫荧光染色可以对体外培养的视皮层神经元细胞进行准确鉴定.【期刊名称】《眼科新进展》【年(卷),期】2013(033)008【总页数】3页(P733-735)【关键词】视皮层;神经元;原代培养;大鼠【作者】宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【作者单位】453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453000 河南省新乡市,解放军371医院;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室【正文语种】中文视皮层是视觉系统的高级中枢，培养观察视皮层神经元对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的基础研究具有重要的意义。

新生大鼠大脑皮层神经细胞培养及影响因素

实用医药杂志!""#年$"月第!!卷第$"期%&’()*+,-%.’&/0123!!4!""#5$"620$"神经细胞是近代神经学科中研究重点之一，在体外特定环境中，通过培养可以连续地直接观察神经细胞或神经胶质细胞的形态、生长、分化、迁移、突触形成、理化改变以及对环境的反应。

本文结合新生大鼠大脑皮层神经细胞的培养，对影响神经细胞培养的诸因素及其作用做了初步探讨。

$材料和方法$0$材料新生789:’&大鼠、高糖;*<*、新生马血清、=’>?’9液（@ABCDBEF）、混合GB血清、胎牛血清H杭州四季春I、胰岛素、F5多聚赖氨酸HJ8K/’I、阿糖胞苷、青霉素、!L孔培养板HMGFCD6产品I。

$0!方法$0!0$培养孔的准备N$O取无菌!L孔培养板，各加入$""!3 F5多聚赖氨酸使其铺满孔底N!O，静止$#/8>后弃去，培养孔内加入;*<*培养液，PQR、#SCD!孵箱放置$.后备用。

$0!0!新生大鼠脑细胞悬液的制备NPO在无菌条件下取出新生大鼠的大脑，用含$"""T U/3青霉素的=’>?’9液漂洗P 遍，尽量去除脑膜、血管和血细胞，放入无菌青霉素小瓶内，用眼科剪将脑组织剪碎块，加入$/3"0$!#S胰蛋白酶PQR 孵箱!"/8>，$"""&U/8>离心P/8>，弃上清，用含马血清的;*<*重悬沉淀物，自然沉淀后取上清液调节细胞数至!V $"W个U/3备用。

$0!0P神经细胞培养将制备好的细胞悬液接种于培养孔中，按试验设计方案PQR、#SCD!孵箱进行培养。

!结果在笔者施加的各种处理因素下，初接种的神经细胞都呈圆形，多无突起。

大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养

大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月一、试剂1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2)DMEM（Invitrogen,11995-065）3)FBS（Invitroge,10099-141）4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5)B27（Invitrogen ,17504-044）6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）10)dd H2O11)10％水合氯醛12)75％酒精二、器械1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）3)200目不锈钢筛4)细胞计数器（求精）5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）10)注射器：50ml、5ml各 111)Pipette and pipette tips12)冰袋、手套、棉球、棉签Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。

SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外原代培养

SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外原代培养汤婷婷;官志忠;禹文峰【摘要】目的:建立原代培养的SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系.方法:取新生24 ～48 h的SD大鼠,无菌操作取出大脑皮层,剪碎后用胰酶消化、机械吹打制成分散细胞悬液,网筛过滤,将细胞悬液接种培养7～9d;置于摇床(37℃、250 r/min 振摇6h),弃掉含脱离细胞的细胞悬液,去除小胶质细胞及少突胶质细胞,细胞传代,进行GFAP细胞免疫荧光鉴定.结果:成功分离和培养原代星形胶质细胞,GFAP免疫荧光鉴定星形胶质细胞比例在95％以上.结论:采用该培养方法能够成功的建立原代SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系,为研究神经系统疾病及其相关疾病提供了可靠的细胞模型.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2014(039)002【总页数】4页(P158-161)【关键词】大鼠,Sprague-Dawley;星形胶质细胞;大脑皮层;细胞培养,原代;模型,细胞【作者】汤婷婷;官志忠;禹文峰【作者单位】贵阳医学院病理学教研室,贵州贵阳550004;贵阳医学院病理学教研室,贵州贵阳550004;贵阳医学院分子生物学重点实验室,贵州贵阳550004;贵阳医学院分子生物学重点实验室,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】R34-33;R749.1在神经系统所包含的细胞中，胶质细胞数量众多，约占中枢神经系统(CNS)细胞总数的90 %，其中又以星形胶质细胞(AS)所占比例最多。

AS不仅具有支持、营养及协助CNS神经元代谢等作用，还参与CNS内信息的传递与处理，是CNS功能活动的重要参与者，并对维持神经系统内环境起着重要作用[1-2]。

本实验在Mc Carthy[3]细胞培养方法的基础上加以改进，在体外建立可靠的原代AS细胞系，为进一步研究AS在CNS中的生理和病理功能提供实验基础。

1.1 材料新生24～48 h SD(Sprague-Dawley)大鼠由贵阳医学院动物实验中心提供。

一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定_姜茜

·技术方法·一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定姜　茜,姜玉武■,王静敏,秦　炯,吴希如(北京大学第一医院儿科,北京　100034)[摘　要]目的:对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进,以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。

方法:使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理,分离16～17d 胎龄的Wi s t a r 大鼠胎鼠皮层,采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液,经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。

细胞接种当日4～6h 将含有血清的接种培养液换为添加B 27的N e u r o b a s a l 无血清培养基,培养第3天(D I V 3)用终浓度10μm o l /L 的阿糖胞苷(c y t o s i n e a r a b i n o s i d e ,A r a -C )处理24h 抑制胶质细胞增殖,以后每周半量换液1次。

用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e dp r o t e i n 2,M A P 2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度,并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。

结果:与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿,胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比,方法改进以后收获的细胞产量明显增加,且消化过程对细胞损伤小,接种后细胞分散均匀,杂质少,纯度高,树突、突触发育正常,可长期存活。

结论:该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。

[关键词]大脑皮质;神经元;细胞,培养的;木瓜蛋白酶;免疫组织化学[中图分类号]R 329.2 [文献标识码]A [文章编号]1671-167X (2009)02-0212-05d o i :10.3969/j .i s s n .1671-167X .2009.02.019A ni m p r o v e dm e t h o df o r p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n a n d c e l l i d e n t i f i c a t i o nJ I A N GQ i a n ,J I A N GY u -w u ■,WA N GJ i n g -m i n ,Q I NJ i o n g ,WUX i -r u (D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s ,P e k i n g U n i v e r s i t y F i r s t H o s p i t a l ,B e i j i n g 100034,C h i n a )A B S T R A C T O b j e c t i v e :T o i m p r o v e p r e v i o u s m e t h o d o f p r i m a r y r a t c o r t i c a l n e u r o nc u l t u r e t o g e t p u r e ra n d m o r e l o n g -l a s t i n g c e l l s f o r s t u d y .Me t h o d s :T i m e d -p r e g n a n t W i s t a r r a t s a t a g e s t a t i o n a l a g e o f 16o r 17d a y s (16-17d )w e r e u s e d .F e t a lb r a i n s w e r e r e m o v e d a n d t h ec e r e b r a l c o r t i c e s w e r ed i s se c t e d o u t .P a p a i n d i g e s t i o na n dm e c h a n i c a l d i s s o c i a t i o nw e r ec o m b i n e dt oc o n d u c t m o n o -c e l l s u s p e n d i n g m e d i a .F o u r t o s i x h o u r s (4-6h )p o s t -p l a t i n g ,a l l p l a t i n g m e d i a w e r e r e m o v e df r o mc u l t u r e s a n d r e p l a c e d w i t h N e u r o b a s a l m e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h B 27.O n t h e t h i r d d a y ,10μm o l /L c y t o s i n e a r a b i n o s i d e (A r a -C )w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e f o r 24h t o i n h i b i t t h e o u tg r o w t ho f g l i a l c e l l s .H a l f o f th e c u l t u r e m e di u mw a s c h a n g e d e v e r yw e e k .T h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f n e u r o nc e l l s w e r eo b s e r v e db yl i g h t m i c r o s c o p e .D o u b l e i m m u n o -s t a i n i n g o f m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e d p r o t e i n 2(M A P 2)a n d k a r y o n w e r e a p p l i e d t o a s s e s s t h e c u l t u r e p u r i t y .E v a l u a t i o n o f s y n a p s e f o r m a t i o n w a s p r o c e s s e d b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t b o t h p r e -a n d p o s t s y n a p t i c p r o t e i n m a r k e r s .R e s u l t s :T h e i m p r o v e d m e t h o d c o u l dr e -m a r k a b l y i n c r e a s e t h e c e l l n u m b e r a n d r e d u c e n e u r o n a l d a m n i f i c a t i o n .T h e p r i m a r y c u l t u r e w a s c h a r a c t e -r i z e d b y h i g h u n i f o r m i t y ,p u r i t y ,n o r m a l s y n a p s e f o r m a t i o n a n d l o n g t i m e l i v a b i l i t y .C o n c l u s i o n :T h i s i s a s i m p l e a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e f o r t h e i n v i t r o p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n s .K E Y WO R D S C e r e b r a l c o r t e x ;N e u r o n s ;C e l l ,c u l t u r e d ;P a p a i n ;I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270448、30470555、30870865)S u p p o r t e db yN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (30270448,30470555,30870865)■C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 's e -m a i l ,j i a n g y w @263.n e t 神经细胞是构成神经系统的基本结构和功能单位。

原代神经元培养

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。