分泌型乙型肝炎病毒包膜M蛋白在毕赤酵母中的表达_丁云菲

ISSN 1007-7626CN 11-3870 Q 中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2002年6月18(3):265～271·研究快报·分泌型乙型肝炎病毒包膜M 蛋白在毕赤酵母中的表达丁云菲,　刘　勇,　刘红岩,　马雁冰,　孙强明,　孙茂盛,　戴长柏＊(中国协和医科大学中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室,昆明　650118)摘要　将乙肝病毒包膜中蛋白M 基因插入酵母整合型表达质粒pAO818的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建携带8拷贝M 表达盒的重组载体,经电穿孔转化SMD1168菌株和G418筛选,得到了高效分泌表达M 蛋白的毕赤酵母菌株,表达量超过50mg L .经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,重组蛋白具有preS2和S 抗原性,可以形成颗粒,并具有一定程度的糖基化.所构建的稳定重组菌株和所得到的重组蛋白颗粒,为进一步研究新一代的疫苗提供了必要的材料.关键词　毕赤酵母,高拷贝重组质粒,乙肝病毒包膜中蛋白,分泌表达,性质鉴定中图分类号　R512.62,Q78Expression of the Secretory Hepatitis B VirusMiddle Surface Protein in Pichia pastorisDI NG Yun -fei ,LIU Yong ,LIU Hong -yan ,MA Yan -bing ,SUN Qiang -ming ,SUN Mao -sheng ,DAI Chang -bai＊(Institute of Me dical Bi ology ,Peking Union Medi cal C oll ege ,Kunming 650118,China )A bstract The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been developed as production systems for recombinantpr oteins recently .The favourable and most advantageous characteristics of the species have resulted in an in -cr easing number of biotechnological applications .Gene of hepatitis B virus middle surface pr otein (M )was placed under the control of A O X 1promoter in an integrative Pichia expression vector carrying eight copies of the expression cassette .Through electroporation transformation of SMD1168and G418selection ,a strain of Pichia pastoris capable of secreting M protein into the medium at a level up to 50mg L was c onstructed .After initially purified ,the characterization of the expression products de monstrated that the recombinant protein could be assembled into particles which presented preS2and S antigenicity and a certain extent of glycosyla -tion .These results have provided a good foundation for further research and development of ne w hepatitis B vir -us vaccine .Key words Pichia pastoris ,multi -copy recombinant plasmid ,hepatitis B virus middle surface pr otein ,secret -ed expr ession ,characterization收稿日期:2001-11-09,接受日期:2002-01-29＊联系人　Tel :(0871)8334401,Fax :(0871)8181483E -mail :qiujiang @public .km .yn .cn 丁云菲,女,1973年3月生,博士生Received :November 9,2001;Accepted :January 29,2002＊Corres ponding author Tel :(0871)8334401,Fax :(0871)8181483E -mail :qiujiang @public .km .yn .cn 乙型病毒性肝炎(hepatitis B ,HB )是世界范围内流行的一种严重危害人类健康的疾病,我国是乙肝高流行区.目前,乙肝疫苗对于控制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus ,HBV )的传播,保护健康人群及新生儿免受HBV 的感染起了重要作用.HB V 的包膜蛋白由3种蛋白质组成:大蛋白(large protein ,L )、中蛋白(middle protein ,M )和小蛋白(small protein ,S ).S 分子量最小,由226个氨基酸残基组成,是病毒包膜及亚单位颗粒的主要成分;M 在S 蛋白的N 端另有55个氨基酸残基,由S 基因及其上游的前S2(preS2)基因区编码;L 是由preS1、preS2和S 基因3部分共同编码的HB V 包膜蛋白.有研究证明,L 和M 蛋白N 端的preS 区含有许多重要的抗原决定簇,可增强对S 蛋白的免疫反应,克服无反应性,有助于获得HB 比较全面、持久的免疫效果[1].现在国内广泛使用的乙肝疫苗是用酿酒酵母表达的HBV 小蛋白制备的基DOI :10.13865/j .cn ki .cjb m b .2002.03.002因工程疫苗,这种疫苗的防治效果还有一定的缺陷,仍有5%～10%的接种者反应低下,不能产生有效抗体,且用量大,成本高.有资料报道[2,3],HB V L和M蛋白抗原性和免疫原性比S抗原优越,是目前研究新一代HB V疫苗的热点之一.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)以其具备表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟、分泌蛋白不会发生超糖基化等许多优点,已在近年发展成为分子生物学领域中被广泛用于生产重组蛋白的主要系统之一[4～6].使用我们改建的高拷贝酵母整合型载体pAO818,构建了携带有8拷贝表达盒的乙肝病毒包膜M蛋白重组质粒,在Pichia系统中实现了该融合蛋白的稳定分泌表达,对表达产物的分泌性, pr eS2、S抗原性和颗粒性进行了研究,为制备、开发更为有效而廉价的新一代乙肝疫苗奠定了坚实的基础.1　材料与方法1.1　质粒、菌株和主要试剂Pichia-E.coli穿梭质粒pAO815、pPIC3.5K、pPIC9K和P.pastoris宿主菌SMD1168购自Invitrogen 公司,质粒pHB V-NC1[7]和大肠杆菌菌株DH5α由本室保存.高保真pfu酶购自上海生工生物工程公司,限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4多核苷酸激酶及dNTPs购自宝生物工程(大连)有限公司,DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司,乙型肝炎表面抗原检测试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司.Yeast Nitrogen Base(YNB,without amino acid)和D-生物素为Sigma公司进口分装试剂,G418为GibcoBRL公司产品.标准酿酒酵母(Sac charomyces c ere visiae)表达的HBsAg由本室保存,单抗HBsAb购自晶美生物工程有限公司,鼠抗大肠杆菌表达的pr eS2蛋白的多抗由作者制备.1.2　培养基与培养方法大肠杆菌完全培养基LB[1%胰蛋白胨(Bac-to),1%NaCl,0.5%酵母提取物(Bacto),pH7.0],大肠杆菌选择培养基LB A(含氨苄青霉素100mg L 的LB).大肠杆菌在37℃培养.酵母菌完全培养基YPD(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,2%葡萄糖),酵母选择培养基MD(1.34%YNB,2%葡萄糖,4×10-5%生物素),MM(1.34%YNB,0.5%甲醇,4×10-5%生物素),酵母菌表达培养基YPG(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,2%甘油),YPM(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,1%甲醇).酵母菌在30℃培养.1.3　酵母整合型重组质粒的改建用SacⅠ和SalⅠ双酶切pPI C3.5K、pAO815,构建载体质粒pAO818,酶切鉴定.1.4　引物由宝生物工程(大连)有限公司合成.引物2a:5′-GAG AAA AGAA TG CAG TGG AA C T C C A C A AC A T T-3′引物2b:5′-G GA A T TC T CA AA TG TA TA C C C AA AG A C-3′引物2c:5′-C GG AA T TC GA TC C AA AC GA T G A GA T T T C C-3′引物2d:5′-G GA G T T C C A C TG CA T T C TT T T C T C GA G AG A TA C C C C T-3′1.5　α-M融合基因的构建(1)以含有M编码序列的质粒pHBV-NC1为模板,利用引物2a和引物2b进行PCR扩增,得到可与酿酒酵母α-因子前导肽序列以正确的框架进行融合的M基因.(2)以含有酿酒酵母α-因子前导肽编码序列的质粒pPIC9K为模板,利用引物2c和引物2d 进行PCR扩增,得到α-因子前导肽序列.(3)把纯化后的上述2种PCR产物混合后作为模板,利用引物引物2c和引物2b进行PCR扩增,得到可用于分泌表达的融合基因α-M.1.6　携带多拷贝表达盒的重组质粒构建α-M融合基因PCR扩增产物经Ec o RⅠ单酶切,回收基因片段,T4DNA连接酶连接于同样酶切的质粒pAO818,转化宿主菌DH5α,酶切鉴定重组子,测序.用Bam HⅠ+BglⅡ双酶切重组质粒pAO818-α-M,回收小片段,构建携带同向排列2拷贝表达盒的重组质粒pAO818-2α-M.以此类推,构建携带8拷贝表达盒的质粒pAO818-8α-M.酶切鉴定.1.7　重组Pichia菌株的构建和诱导表达参照Invitrogen公司用户手册[Multi-copy Pichia expression kit(Cat.No.K1750-01)manual]进行.1.8　摇瓶发酵液pH值对分泌表达的影响挑取表达量最高的菌株单菌落,接种含200ml YPD-甘油培养基的1000ml摇瓶,30℃培养20h(菌液A600>10),离心菌液,弃上清.重悬菌体于200ml YPD-甲醇培养基,30℃继续培养120h,每隔24h按培养液1%体积补充无水甲醇,同时用2.5mol L HCl保持培养液的pH值为6.0左右,每隔24h取样,离心,ELISA检测培养液上清中M蛋白的表达量,用不调pH值的培养液作对照.266中国生物化学与分子生物学报18卷1.9　小型发酵罐初探参照Invitrogen 公司相关资料进行.在含3L 低盐发酵培养基的5L 发酵罐中,连续诱导表达48h ,每2h 取样,ELISA 检测发酵液上清中的M 表达.1.10　产物粗提液的制备收获最佳表达的培养液,10000r min 离心1h 后,所得上清再使用Hitachi -RP70T 进行50000r min ,4h 的超速离心,沉淀溶于一定体积的生理盐水中,置4℃保存备用.1.11　粗提液中产物表达水平的估测(1)采用北京检定所提供的啤酒酵母(S .cere vi -siae )表达的纯化HBsAg 为标准品,做多点稀释,用ELISA 检测,根据测得值做标准曲线.由此标准曲线估测待测样品中表达产物相当于HBsAg 的表达量.(2)按照Bradford 法测定粗提液中总蛋白的浓度,再根据SDS -PAGE 蛋白电泳扫描分析,估测粗提液中产物的含量.1.12　M 蛋白的性质鉴定按试剂盒说明书进行ELISA 检测S 抗原性;对表达产物的粗提液进行负染后电镜检测;参照Biola -bs 公司相关资料进行Endo -H f 糖苷酶解反应;按Sambrook 等[8]的方法,进行Western 印迹免疫学鉴定.2　结果2.1　表达载体的构建载体质粒pAO818通过pAO815和pPI C3.5k 而构建,用Bam H Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定,可得到1585bp 和7376bp 的2个片段;同时用Eco R Ⅴ、Hin d Ⅲ和Hin c Ⅱ鉴定说明改建正确(Fig .1).以pHB V -NC 1为模板,引物2a 和引物2b PCR 扩增产物长度为861bp ;以pPIC9K 为模板,引物2c 和引物2d PCR 扩增产物长度为270bp ;引物2c 和引物2b 扩增产物长度为1131bp ,与预期值完全相符(Fig .2).经Ec o R Ⅰ单酶切的α-M 融合基因PCR 扩增产物,克隆到pAO818载体中,酶切鉴定和DNA 序列分析(Fig .3)表明,α-M 基因以正确的方向和读码框架插入了pAO818酵母整合型表达载体的预期位点.Fig .4所示结果表明,多拷贝表达载体的构建正确. Fig .1　Reconstruction of plas mid pAO818(A )R econstruction of pAO8181.DNA molecular weight standard DL15000;2.pAO818di gested with Bam H Ⅰ+Sal Ⅰ(1585bp +7376bp );3.pAO815digested with Sac Ⅰ+Sal Ⅱ(2659bp +5050bp );4.pPIC3.5k digested with Sac Ⅰ+Sal Ⅰ(2698bp +6306bp );5.DNA molecular weight standard DL2000(B )Schematic map of pl as mid pAO818(C )Restriction analysis 1.pAO818diges ted with Bam H Ⅰ+Sal Ⅰ(1585bp +7376bp );2.pA O818digested with Ec o R V (3883bp +5078bp );3.DNA molecular weight s tandard DL15000;4.pAO818digested with Hin d Ⅲ(4002bp +4959bp );5.pAO818di gested with Hin c Ⅱ(1041bp +2379bp +5541bp )267第3期丁云菲等:分泌型乙型肝炎病毒包膜M 蛋白在毕赤酵母中的表达　Fig .2　PCR a mplification of α-M fusion geneM .D NA molecular s tandard DL -2000.1.PCR product of α-M fus ion gene (1131bp );2.PCR product of M coding region (861bp );3.PCR product of α-factor s ignal sequence (270bp)Fig .3　Analysis of recombinant plasmid pAO818-α-M (A )Sequence anal ys is of pAO818-α-M (positive and negative res ults )(B )Restricti on analys is of pAO818-α-M M .D NA molecular weight s tandard DL15000;1.pAO818-α-M diges ted with Ps t Ⅰ(1241bp +1837bp +2555bp +4439bp );2.pAO818-α-M diges ted with Hin c Ⅱ(413bp +1041bp +1497bp +1580bp +5541bp );3.pAO818-α-M diges ted with Ec o R Ⅰ(1131bp +8961bp );4.pAO818-α-M digested with Bam H Ⅰ+Bgl Ⅱ+Pvu Ⅰ(731bp +1564bp +1672bp +2388bp +3717bp )2.2　表达菌株的构建转化菌液涂布MD 平板72h 后,取140个最大的菌落接种到含0.5g L G418的YPD 平板上,30℃培养48h .共80个转化子在含0.5g L G418的YPD 平板上生成菌落,表明外源表达盒已经整合到了宿主细胞染色体上,形成稳定整合转化子,其中的5个可以在含3g L G418的YPD 平板上快速长出菌落,将这5个转化子进行基因表达水平的比较.我们所筛选到的1个高效分泌表达菌株在MM 平板和MD 平板都能正常生长,为Mut +(Mut +Methanol utilization plus )表型.2.3　重组抗原的分泌表达小三角瓶表达试验表明,开始诱导12h 后,5个稳定转化子都可以高效表达M 蛋白,取未浓缩的培养基上清50μl 进行ELISA 检测,可见明显的S 蛋白抗原性(Table 1).用甲醇作为碳源连续诱导表达120h ,以标准品为对照,推算出表达量为20～50mg L 发酵液.在诱导表达的过程中,培养液的pH 值保持6.0～7.0的状态,ELISA 检测S 蛋白的抗原性一直很低,而对于不调pH 调的培养液,pH 值处于7.0～8.0的状态,S 蛋白的抗原性有明显的增高(Table 1).小型发酵试验表明,开始诱导6h 后可见明显表达,连续诱导40h 后的表达量即相当于摇瓶诱导120h 后的水平.2.4　表达产物电镜检测为了检测摇瓶和发酵罐表达产物是否可以形成颗粒,将产物粗提液直接负染进行电镜检测的结果证实产物可以形成直径约22nm 的球形或管形颗粒(Fig .5).图中可见,有明显成串的和散在的,实心的和空心的颗粒.268中国生物化学与分子生物学报18卷Fig.4　R es triction anal ysis of recombinant plas mid(A)Recombinant plas mids di gested with Eco RⅤ.M:DNA molecular weight standard DL15000;1:pA O818-8α-M(5078bp+21710bp);2:pAO818-4α-M(5078bp+12158bp);3:pA O818-2α-M(5078bp+7382bp).(B)R ec ombinant pl as mids diges ted with Bam HⅠ+BglⅡ+PvuⅠ.M1:D NA mol ecul ar wei ght standard DL15000;1:pAO818-8α-M(731 bp+1564bp+1672bp++3717bp+19104bp);2:pAO818-4α-M(731bp+1564bp+1672bp+3717bp+9552bp);3:pA O818-2α-M(731bp+1564bp+1672bp+3717bp+4476bp);M2:D NA mol ecul ar wei ght standard DL2000Table1　ELISA of HBsAg in M protein at defferent time and pH (A450m m)Inductive ti me h HBsAg at pH7.8～8.0HBs Ag at pH6.0～7.0 120.122240.9270.386361.148481.6160.235722.5420.462962.526Fig.5　Secreted M protein particles were vis ualised by electron mi-croscopy after negative stainingThe scal e refers to50nm at the l eft bottom2.5　表达产物的Endo-H f酶切检测粗提液经Endo-H f处理18h后,SDS-PAGE(Fig.6)结果表明,粗提液中40kD左右的条带在处理后消失,而在28kD左右出现了1条新的条带,与中蛋白的预期分子量接近.这表明,中蛋白在SMD1168中的表达产物带有一较短的N-连接的高甘露糖链.Fig.6　Analysis of the gl ycosylation form of the express ion productM:Protein molecular weight s tandard(middle range);1:Nothing with En-do-H f treatment;2:Recombinant M protein without Endo-H f treatment;3: R ecombinant M protein with Endo-H f treatment2.6　重组M蛋白的免疫学鉴定M蛋白可与单抗HBsAb形成特异的抗原-抗体结合反应,鼠抗大肠杆菌表达的preS2的多抗也能与重组M蛋白形成特异的抗原-抗体结合反应.Western 印迹结果见Fig.7.269第3期丁云菲等:分泌型乙型肝炎病毒包膜M蛋白在毕赤酵母中的表达　Fig.7　Western-bl ot anal ys is of Recombinant M protein(A)D etection of preS2antigenicity(B)Detection of S antigenicity1.Secreted protein in P.past or is having pA O818;2.M protein express ed in P.pastori s;3.controllable HBsAg of nonglycos yl ation form express ed in S.cer evis iae;M.Protein mol ecular wei ght standard(middle range)3　讨论实现一个外源基因在P.pastoris中高效表达的关键,是要有合适的载体.Vassileva等[9]在Pic hia系统中分泌表达了HB V包膜S蛋白颗粒.我们利用这一系统分泌表达了天然的乙肝病毒包膜中蛋白M基因,小规模摇瓶培养的结果表明分泌至培养基中的M蛋白浓度为20～50mg L,表达水平比Vassileva的报道高.外源表达盒在宿主染色体上整合的拷贝数,即基因剂量对于外源蛋白的表达量影响很大.许多实例表明,含单拷贝表达盒的宿主菌足以得到最佳产量[10].但多数情况下,随着拷贝数的增加表达产物量也会相应增加.目前,国际上流行有胞外和胞内两种高拷贝构建方法[5],一般可以筛选出20拷贝以下的整合转化子.我们改建的pAO818载体兼有这2种构建方法的优点,理论上可以构建携带100拷贝以上的外源表达盒的重组毕赤酵母工程菌株.我们将乙肝病毒包膜中蛋白M基因插入该酵母整合型表达质粒的醇氧化酶(AOX1)强启动子下游,构建携带8拷贝表达盒的重组载体pAO818-8α-M,实现了高拷贝表达载体的胞外构建.重组质粒经酶切线性化后,电转化导入酵母细胞内,再通过G418的筛选,又实现了高拷贝的胞内构建.由此,巴斯德毕赤酵母这种真核表达体系发挥出它巨大的潜力,让我们得到了较高浓度的重组蛋白.重组蛋白因为其基因与α-分泌信号基因3′端融合,能够在α-信号肽的引导下穿过细胞膜,被分泌到培养基中;但是,α-信号肽能否被完全、正确切割,还必须通过氨基酸末端测序才能确定.M蛋白颗粒的S 抗原性可以通过ELI SA检测到;其preS2和S抗原性经Western印迹分析也得到确定,证明所表达蛋白就是HBV M蛋白.表达菌株在连续诱导培养120h后,仍能检测到很高的S抗原性,说明表达菌株的稳定性很高.电镜观察证实,无论摇瓶还是发酵罐的分泌蛋白均能形成略大于天然的22nm的亚病毒颗粒(Fig.5);由于蛋白质的高级结构是一级结构所决定,故推测此颗粒是在胞外组装而成的.另外,我们知道P.pastoris有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),酸性条件利于它的生长繁殖以及抑制一些蛋白酶的活性,而对某些蛋白的表达、分泌有一定的影响.本实验的结果显示了酵母培养液中pH对M蛋白表达及S抗原性的影响,说明M蛋白颗粒的组装需要适当的pH环境;但pH7.0～8.0有益于蛋白酶的活性发挥,所以,我们选用了蛋白酶缺陷菌株SMD1168作为宿主菌,使重组蛋白的降解情况改善.Pichia系统可以对表达产物进行糖基化,包括O-和N-连接的糖基化,以及寡糖的磷酸化,而且所选择的糖基化位点与天然宿主不完全相同[11].其修饰糖链的平均长度为8～14个甘露糖,且不含α-1,3-甘露糖,糖基化形式更接近高等真核生物,避免了啤酒酵母体系产生过度糖基化而影响免疫原性的问题.本研究中Endo-H f糖苷酶解反应分析的结果也证实,分泌的M蛋白是含有高甘露糖型糖链的糖蛋白,根据分子量推测,N-连的糖基数不会多于12个.由于Endo-H f糖苷酶只消化N-连糖链,M蛋白分子上还可能含有O-连糖链,而糖的存在妨碍蛋白在SDS-PAGE 胶上的迁移率[12].加之可能存在着不完全切割的α-信号肽,故在酶解后M蛋白的表观分子量比其理论值32kD大(Fig.6).对Pichia分泌型M蛋白的糖基化形式有待探讨.Western印迹的结果也证明了糖链对糖蛋白电泳的影响.Fig.7B(2)后面一条带的分子量正好是前一条的2倍,是M蛋白颗粒的二聚体形式;而对于没有糖基化形式的标准HBsAg,Fig.7B(3)显示2条带的分子量正好是HBsAg单体的整倍数(2和4),说明乙肝表面包膜蛋白颗粒多聚体的形式较坚实,不易打开.研究表明[2,3],含有preS区的HB V疫苗,可在小鼠体内引发强的细胞和体液免疫应答,比S抗原所诱导产生的S抗体滴度要高,同时还诱导产生了270中国生物化学与分子生物学报18卷pr eS抗体,获得了全面的免疫效果.我们的重组M蛋白能形成颗粒,且通过Western印迹分析,表现出pr eS2和S双重抗原性,说明它将会有很好的应用前景.总之,我们对重组载体成功、稳定的构建,对发酵条件的初步探索,对表达产物的性质鉴定,为研制更高效的新一代乙肝疫苗,提供了必要、有价值的材料.该分泌蛋白颗粒的形成机制、纯化和免疫原性的研究,以及用作乙型肝炎防治的可能性尚在进一步研究中.参考文献(References)1　Milich D R.T-and B-cell recognition of hepatitis B viral antigen.Immu-nology Today,1988,9:380～3862　Jones C D,Page M,Bac on A,Cahill E,Bentl ey M,Chatfield S N.T-cell and anti body res pons e characterisation of a new recominant pre-S1, pre-S2and SHBs antigen-containing hepatitis B vaccine;demonstration of s uperior anti-SHBs antibody induction in responder mice.Vacc ine, 1999,17:2528～25373　Ya mada T,Iwabuki H,Kanno T,Tanaka H,Ka wai T,Fukuda H, Kondo A,Seno M,Tanizawa K,Kuroda S.Physicoc hemical and immu-nological characterization of hepatitis B virus envelope particles excl usive-ly cons isting of the entire L(pre-S1+pre-S2+S)protein.Vacc ine, 2001,19:3154～31634　Cregg J M,Cereghino J L,Shi J,Higgins D R.Recombinant proteinexpress ion in Pic hia past or is.M ol Biotechnol,2000,16(1):23～525　Cereghino JL,Cregg J M.Heterologous 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