PCR
pcr知识点总结归纳
pcr知识点总结归纳PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种用于抑制、合成、扩增DNA的技术。
PCR技术广泛应用于科学研究、临床诊断、法医鉴定和生物工程等领域。
PCR技术的出现不仅提高了DNA的扩增速度，而且在很大程度上解决了DNA分析的难题和可行性问题。
PCR技术的关键在于DNA的扩增，通过特定的引物（primer）和热稳定的DNA聚合酶在不同温度下进行多次循环反应，使目标DNA片段扩增成百上千倍。
PCR技术的应用可以在较短时间内获得充足的DNA，为后续的实验提供了可行性基础。
PCR技术是分子生物学研究的重要工具，掌握PCR技术的原理和操作方法对于分子生物学研究者来说至关重要。
下面将对PCR技术的知识点进行总结和归纳，包括PCR的基本原理、PCR反应体系、PCR引物设计、PCR技术的优缺点以及PCR技术在生物学研究中的应用等方面。
一、PCR的基本原理PCR技术是通过DNA的酶解、DNA的引物延伸、DNA的片段合成来实现DNA扩增。
PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。
1. 变性步骤：将DNA的双链解链成两条单链，即使DNA解链。
2. 退火步骤：将引物与DNA模板结合成双链，即使DNA复性。
3. 延伸步骤：在退火变性条件下将引物作为起始核酸，然后DNA聚合酶将其扩增成DNA。
通过以上三个步骤的循环反应即可实现DNA的多次扩增。
二、PCR反应体系PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、四种dNTPs、缓冲液和辅助剂等。
1. DNA模板：PCR反应的起始材料，可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA模板。
2. 引物：在退火步骤中将与DNA模板特异性结合，为DNA的扩增提供起始核酸。
3. DNA聚合酶：用于合成DNA，PCR反应中通常采用热稳定的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。
4. dNTPs：即脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是DNA聚合的四种脱氧核苷酸单体。
PCR技术简介
Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓 度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过 低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失 败，出现假阴性。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
Mg2+浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应中
的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl 等），而MgCl2浓度不同（由 0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)， 由此来摸索最佳Mg2+浓度。
PCR技术的应用
研究领域：
基因克隆；DNA测序；分析突变； 基因重组与融合；检测基因的修饰； 鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列； 转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；
构建克隆或表达载体； 检测某基因的内切酶多态性等。
PCR技术的应用
临床诊断： 细菌；病毒；螺旋体；支原体；衣原
体；立克次氏体；分枝杆菌等病原体 的鉴定； 人类遗传病的鉴定；
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
模板因素引起假阴性解决方案：
1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活：
1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活引起假阴性解决方案：
1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq 酶；
2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
引物：
1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
PCR
3’
5’
3’
5’
限制性内切酶的识别序列
启动子序列 定点突变 探针标记
PCR反应条件
1）PCR反应成分 （1）模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶
来自水生栖热菌 Thermusaquaticus
良好的耐热性 在70～80℃具有最高聚合活性 在95 ℃仍然可以有50%活性
其它特性: Mg2+依赖性 无校正功能
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• • •
• 无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无；
原 因
1. 模板:含有抑制物，含量低 2. Buffer对样品不合适 3. 引物设计不当或者发生降 对 解 策 4. 反应条件：退火温度太高，延
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量 2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚 体和链内二级结构）或者换一 管新引物 4. 降低退火温度、延长延伸时间
操作步骤
①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯 包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内 源性过氧化物酶.
②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的 组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶 K. ③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加 液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环 扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置. ④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原 位杂交
PCR详细讲解
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡 核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
半定量 RT-PCR
基本概念
半定量 RT-PCR （ semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特 异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增， 并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。 定量RT-PCR（quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体
PCR扩增体系
模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
扩பைடு நூலகம்产物长度。
DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的机
器。扩增效率和保真性。
缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子强度，为
pcr的原理和应用领域
PCR的原理和应用领域1. PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。
它是由美国生物学家凯瑟琳·梅利斯（Kary B. Mullis）在1983年发明的，因其在分子生物学领域的重要应用而获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的原理主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.1 变性（Denaturation）将待扩增的DNA样品加热至94-98℃，使双链DNA解开成两条单链DNA。
这一步是为了使DNA分子的双链结构完全解链，以便后续的退火步骤。
1.2 退火（Annealing）将待扩增的DNA样品降温至50-65℃，加入引物（寻找特定靶序列的DNA寡核苷酸链），使引物与单链DNA序列互补配对结合。
这一步是为了使引物与待扩增的DNA序列特异性地结合，以启动PCR反应。
1.3 延伸（Extension）将待扩增的DNA样品在72℃下加入DNA聚合酶（如Taq聚合酶），使DNA引物双链结构被DNA聚合酶复制成两条新的DNA双链。
这一步是为了合成新的DNA链，使扩增物数量呈指数倍增。
经过多个循环的变性、退火和延伸步骤，可以在短时间内扩增出大量特定目标序列的DNA片段。
2. PCR的应用领域PCR技术具有高效、灵敏、特异性强等优点，因此在许多领域得到了广泛应用。
2.1 分子生物学研究PCR技术在分子生物学研究中扮演着重要角色，广泛应用于：•基因克隆和表达研究：PCR可以扩增特定基因片段，用于克隆和构建重组DNA。
可以通过PCR检测基因在不同组织和细胞类型中的表达水平，研究基因的功能和调控机制。
•突变检测和基因诊断：PCR可以检测基因突变，用于遗传病的诊断和预测。
例如，PCR可以用于检测致病基因的特定突变，如BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关联。
•DNA指纹和个体识别：PCR可以扩增DNA中的特定序列，用于DNA指纹分析和个体识别。
PCR
例: 以下为一段cDNA序列,试设计一对引物扩增划 线部分的序列。
5’ ttccagggga tgatctcaga gctgaaggta cgcaaaaccc cccgggtgag 5’tgatctcaga gctgaaggtac3’ GC%=47 ccctgtgcac tgtctggatg aagaagatga tgatgaagac cgggcatctg
靶DNA序列
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•引物决定PCR扩增产物的特异性与长度 •PCR技术的特异性取决于引物和模板 DNA结合的特异性。 •理想的引物应该有效地与靶序列杂交， 而不与模板其它序列杂交
5’ 3’
3’
5’
11
引物设计原则
1.引物长度： 特异性一般通过引物长度和退火温度 控制。寡核苷酸长度一般为16~30bp。引 物长度增加，能提高特异性，但是在扩 增退火时被引发的模板会减少，而降低 反应效率。
21
• 错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循 环次数的影响 • Taq DNA聚合酶在反应体系中的终浓度 常为2~2.5U/100μL。酶量过少合成产物 量低，酶量过高则非特异性产物随之增 加。
22
（四）缓冲液
• 用于PCR的标准缓冲液含： 50mmol/L KCl 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 1.5mmol/L MgCl • 另加入保护Taq酶试剂: 牛血清白蛋白（100μg/ml） 或明胶(0.01%)或二硫苏糖醇(DTT)等
1 2 3 4 M
37
常用PCR介绍
（七）荧光PCR（着色互补PCR） 用不同的荧光染料，如红色的罗丹 明和绿色荧光素等分别标记于不同寡核 苷酸引物上，同时扩增多个DNA区段。 反应完毕后，用紫外线照射扩增产物， 就能显示某一种或几种荧光染料的颜色 组合，为临床自动化诊断打下基础。
什么是PCR
什么是PCR？定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），聚合酶链式反应具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
编辑本段发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。
20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。
但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。
Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。
但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。
1985年，美国科学家Kary Mullis 在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。
从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis 也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。
1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。
尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。
也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。
数字pcr和qpcr的区别
数字PCR和qPCR的区别1. 引言PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因分型、病原体检测、DNA测序等领域。
随着技术的发展，PCR也分为了数字PCR（digital PCR）和qPCR（quantitative PCR）两种类型。
本文将介绍数字PCR和qPCR的区别。
2. 数字PCR数字PCR是一种精确计数目标序列拷贝数的方法。
它通过将待检测样本分成许多独立的反应区块，每个区块中只存在0个或1个目标序列。
数字PCR的主要步骤包括样本划分、PCR扩增、读取结果等。
数字PCR的主要优点是能够精确计数目标序列拷贝数，而不受PCR扩增效率的影响。
这种方法对于低拷贝目标的检测非常敏感，并且能够检测目标序列的变异情况。
另外，数字PCR的结果可以通过可视化的方式展现，对于分析数据非常方便。
然而，数字PCR的缺点是相对较为复杂，需要使用特殊的设备和试剂盒。
此外，数字PCR的通量相对较低，不能进行高通量的样本处理。
3. qPCRqPCR是一种定量检测目标序列拷贝数的方法。
它基于标准曲线法，通过PCR扩增的同时测量扩增产物的数量。
qPCR的主要步骤包括模板DNA制备、引物探针设计、PCR 扩增、扩增曲线分析等。
qPCR的优点是简单快速，可以同时检测多个基因或样本。
它可以精确地定量目标序列的拷贝数，并且具有高通量的优势。
另外，qPCR还可以分析目标序列的表达水平和变异情况。
然而，qPCR的缺点是对PCR扩增效率敏感，需要进行标准曲线法的建立和验证。
此外，由于PCR扩增过程中产生的非特异性产物，可能会导致假阳性结果。
4. 比较数字PCR和qPCR在原理、应用以及优缺点上存在一些区别。
•原理：数字PCR通过样本分区计数目标序列，而qPCR通过PCR扩增测量目标序列的拷贝数。
•应用：数字PCR常用于低拷贝目标的检测和变异分析，而qPCR适用于目标序列的定量和表达水平分析。
•优点：数字PCR能够精确计数目标序列拷贝数，对低拷贝目标敏感；qPCR快速简便，可同时检测多个样本或基因。
PCR分为几类
PCR分为几类PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外迅速扩增DNA 片段。
PCR的应用广泛，可以用于基因检测、疾病诊断、遗传学研究等领域。
根据PCR 的目的和方法不同，可以将其分为以下几类。
1. 标准PCR标准PCR是最基本的一种PCR方法，也是最常见的一种。
它包括三个主要步骤：变性、引物结合和扩增。
在变性步骤中，样本中的DNA被加热使其解旋成两条单链。
然后，在引物结合步骤中，两个特异性引物与目标DNA序列的两端结合。
最后，在扩增步骤中，DNA聚合酶通过引物在目标序列上进行扩增，生成大量目标DNA。
2. 实时定量PCR实时定量PCR是一种可以定量测定起始DNA数量的PCR方法。
与标准PCR不同，实时定量PCR在扩增过程中同时进行荧光信号检测。
这种PCR方法可以利用荧光染料或探针来监测PCR产物的数量，从而在扩增过程中实时定量目标DNA的起始数量。
实时定量PCR在基因表达分析、病原体检测和突变分析等方面有广泛的应用。
通过测定样品中特定基因的表达水平或病原体的数量，可以获得有关相应生物学过程或疾病状态的重要信息。
3. 反转录PCR（RT-PCR）反转录PCR是一种结合了逆转录和PCR的技术。
逆转录是将RNA转录为DNA的过程，通过反转录酶，目标RNA可以合成互补的DNA（cDNA）。
然后，使用PCR方法扩增cDNA，以便测定RNA的存在和定量。
RT-PCR广泛应用于基因表达研究和病毒检测等领域。
通过测定目标基因的mRNA 水平或检测病毒RNA的存在，可以了解基因表达的水平或病毒感染的情况。
4. 数字PCR数字PCR是一种精确测定DNA分子数量的PCR方法。
与传统PCR不同，数字PCR 将DNA分为许多微小的反应容器，并分别进行扩增。
通过计算阳性和阴性反应容器的数量，可以确定样品中DNA的精确浓度。
数字PCR在基因拷贝数分析、细胞自由DNA检测和胚胎植入前遗传诊断等方面有广泛的应用。
pcr概念和基本原理
pcr概念和基本原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种基于DNA复制的体外合成DNA的技术。
它是由克利夫·库里思和凯瑟琳·穆利斯于1983年发明的，该技术后来获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理如下：
1. 反应体系：PCR反应需要DNA模板、DNA引物、DNA聚合酶、dNTPs（四种脱氧核苷三磷酸）以及缓冲液等组成的反应体系。
2. Denaturation（变性）：反应开始时，将反应体系加热至高温（通常为94-98℃），使DNA双链分离成单链。
这一步骤将使模板DNA的两条链分开，使引物能够结合。
3. Annealing（退火）：将反应体系降温至50-65℃，使引物与模板DNA的单链互补配对。
引物是一段短DNA序列，它会识别并结合模板DNA的特定区域。
4. Extension（延伸）：将反应体系温度升高至72℃，加入DNA聚合酶以及dNTPs。
DNA聚合酶会从引物结合的位置开始向模板链的3'端延伸，并在每个引物的序列上合成一条新的DNA链。
以上的三个步骤构成了PCR的一个循环。
在一个PCR反应过程中，这个循环可以重复多次，通常需要进行20-40个循环。
每次循环都会使目标DNA区域的数量成倍增加，因此可以在
几小时内从极少量的DNA样本中合成大量的DNA。
PCR可以用于多种应用，包括基因突变的检测、DNA序列的测定、基因克隆、疾病诊断等。
它在分子生物学研究、医学诊断和法庭鉴定等领域起着重要作用。
PCR详细讲解
常见问题
2.为什么出现多条非特异性条带？
①反应体系被污染。
②引物特异性差。
③退火温度不合适。
常见问题
3.为什么PCR产物很少？
①聚合酶活性过低。
②循环次数偏低。
③模板DNA浓度过低。
常见问题
4.为什么PCR产物出现片状拖尾？
①DNA聚合酶过多或酶活性差。
②dNTP和Mg2+浓度过高。
③退火温度过低，PCR循环数偏多。
逆转录PCR的原理
逆转录PCR的反应体系
1、模板RNA
2、逆转录酶
3、逆转录引物
变性
• 94℃ 30s
93-96℃，较高的温度变性 更快更彻底，尤其是对富含G+C 的靶序列而言。
退火
• 45~65℃ 30s
退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
高温变性
低温退火
中温延伸
• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。 • 实际：由于引物和底物的消耗， 酶活力的下降等因素，扩增产物 的增加，逐渐由指数形式变为线 性形式，所以实际上进行30个循 环后，扩增倍数一般可达106 ～ 107。
Easy Taq：1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min FastPfu: 2-4kb/min
循环数：
在其他参数都已优化的条件下， 最适循环数取决于靶序列的初始浓 度。一般情况下30-35个循环即可。
循环数太多：会增加非特异扩增产 物的数量和复杂性。 循环数太少：PCR产量太低。
④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。
基因工程pcr技术
基因工程pcr技术
PCR技术是一种基因工程技术，它是一种快速、高效、准确的DNA复制技术。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶酶的特性，在体外复制DNA分子。
PCR技术的应用非常广泛，包括基因克隆、基因检测、基因表达分析等。
PCR技术的基本步骤包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性是将DNA分子的双链分离成两条单链，这个步骤需要高温。
退火是将引物与DNA分子的单链互相结合，这个步骤需要低温。
延伸是将DNA聚合酶酶作用于引物与DNA分子的单链，使其合成新的DNA 分子，这个步骤需要适当的温度和时间。
PCR技术的应用非常广泛，其中最重要的应用之一是基因克隆。
基因克隆是指将一个DNA分子复制成多个完全相同的DNA分子。
PCR技术可以用来扩增DNA分子，从而得到大量的DNA分子。
这些DNA分子可以用来进行基因克隆，从而得到大量的目的基因。
PCR技术还可以用来进行基因检测。
基因检测是指检测某个基因是否存在或者是否突变。
PCR技术可以用来扩增目的基因，从而得到足够的DNA分子进行检测。
PCR技术还可以用来进行基因表达分析。
基因表达分析是指研究某个基因在不同组织或者不同条件下的表达情况。
PCR技术可以用来扩增目的基因，从而得到足够的DNA分子进行表达分析。
PCR技术是一种非常重要的基因工程技术，它可以用来进行基因克隆、基因检测、基因表达分析等。
PCR技术的应用非常广泛，可以应用于医学、生物学、农业等领域。
随着技术的不断发展，PCR技术的应用将会越来越广泛。
PCR
生活上的应用
在大家了解 PCR 技术后，应该不难了解它 的各种应用了吧。 是的，由于它的许许多 多优点，所以在生活上也扮演着举足轻重 的重要角色呢。 最常使用的，就算是刑事 案件和亲源鉴定了。
其他领域
PCR技术还在动植物研究领域、组织和群 体生物学等领域已得到了广古学
由于PCR技术对基因组的完整性要求不高， 因而对分子考古学极为有帮助，科判定生 物种类间的亲缘关系、进化途径等。 如： 1997年德国慕尼黑大学动物研究所科学家 宣称10，他们对欧洲原始人——欧洲尼安 德特人化石中的基因残余物进行分析，结 果表示著名的欧洲原始人尼安德特人不是 欧洲现代人的祖先，这一结果又得到了英 国、俄罗斯和瑞典科学家的进一步证实， 为现代人的起源提供了新的论据。
• PCR技术运用传统生物技术结合近代基因 工程原理，包含反转录PCR技术、定量 PCR技术、实时荧光定量PCR技术、重组 PCR技术、反向PCR技术、多重PCR技术、 不对称PCR技术等多种传统PCR技术和原 位PCR技术、巢式PCR技术等一系列新兴 PCR技术。
PCR技术的最新进展
结核杆菌诊断PCR； 病毒学PCR技术； HIV感染PCR； 检测人COX病； DMS/BMD基因； 地中海贫血PCR； 血友病A基因。 在工业在分子生物学、临床医学、考古学等众多领域取得 了巨大成就，不但只是局限于研究领域，而且还从实用角 度证明了PCR技术是一项令人类值得自傲的技术。
四.PCR技术的作用领域
1．遗传病的产前诊断 2．致病病原体的检测 3．癌基因的检测和诊断 4．DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法 医物证 5．动、植物检疫 6．高科技生物医学领域中的应用
五.PCR技术的应用及实例
分子生物学理论研究 临床医学 考古学 生活上的应用 其他领域
pcr技术的基本步骤
pcr技术的基本步骤
PCR技术的基本步骤如下：
1. DNA模板制备：从待扩增的组织内提取DNA，纯化并定量，同时设计引物。
2. 反应体系制备：将DNA模板与引物、dNTP、Taq聚合酶和缓冲液混合，最终成为PCR反应混合液。
3. DNA扩增：将PCR反应混合液加入PCR热循环仪中进行循环温度变化，即变性、回温和延伸。
温度变化的快慢控制PCR循环的速度，扩增特定目标序列。
4. PCR产物分析：可用琼脂糖凝胶电泳等方法对PCR反应产物进行分析和鉴定，确定扩增是否成功，检测扩增产物大小及数量。
5. 结果分析：根据PCR扩增结果，可以进行序列分析、基因检测、疾病诊断、基因工程等一系列应用。
PCR百度百科
PCR百度百科PCR是一个英文简称缩写，通常用于很多学术名词的缩写，包括生物学的聚合酶链式反应，电子信息学的光电导继电器，计算机学的程序控制暂存器，电子学的节目时钟参考，口腔行业的术语表膜清洁率。
目录1.生物学的聚合酶链式反应2. 电子信息学的光电导继电器3. 计算机学的程序控制暂存器4. 电子学的节目时钟参考1.生物学的聚合酶链式反应2. 电子信息学的光电导继电器3. 计算机学的程序控制暂存器4. 电子学的节目时钟参考展开1.生物学的聚合酶链式反应定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），聚合酶链式反应具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。
技术原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR反应三个步骤依次为哪三步进行
PCR反应三个步骤依次为哪三步进行PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，它可以扩增DNA片段。
PCR 反应的原理是通过不断重复三个步骤，使目标DNA片段得以高度放大。
这三个步骤依次为：变性、退火和延伸。
变性（Denaturation）在PCR反应的第一个步骤中，目标DNA的双链结构被加热至高温（通常为94-98°C），使其双链分离成两条单链DNA。
这个步骤的目的是打开DNA的双链结构，使其在后续步骤中可以作为模板参与扩增。
退火（Annealing）在退火步骤中，反应体系中的温度降低至适宜的退火温度（通常为50-65°C）。
在这个温度下，引物（primers）与目标DNA的互补序列结合，形成DNA引物与模板DNA的复合物。
引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，它们分别与目标DNA序列的两端互补结合，为DNA扩增提供起始点。
延伸（Extension）在延伸步骤中，反应体系中的温度升高至适宜的延伸温度（通常为65-72°C）。
在这个温度下，Taq DNA聚合酶（一种热稳定酶）在引物的诱导下，开始沿着模板DNA链合成新的DNA链。
这个步骤的完成意味着扩增目标DNA的片段已被合成出来。
PCR反应的这三个步骤通常被不断地重复，以实现对目标DNA的高度扩增。
一个PCR反应循环包括以上三个步骤，通常一个循环的时间约为1-3分钟。
根据需要，PCR反应可以进行多个循环，每个循环都会使目标DNA的数量成倍增加。
通过PCR反应，我们可以快速而准确地从一个较小的DNA样本中扩增大量的目标DNA片段。
PCR技术的应用非常广泛，涵盖了生命科学的各个领域。
例如，在基因检测中，PCR可以被用来检测特定序列的基因突变或变异。
在遗传学研究中，PCR可以用来验证基因型或分析个体之间的遗传关系。
此外，PCR还可以应用于重组DNA技术、病原体检测、DNA测序等众多领域。
总结起来，PCR反应的三个步骤依次为变性、退火和延伸。
PCR
PCR自测题一、名词解释1、PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。
2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
4、延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。
5、逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。
9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3‘端和5’端引物扩增未知序列。
10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。
11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。
1、简述PCR反应的基本步骤。
PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。
（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;（2）退火（annealing）：当温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链，这一过程称退火。
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Real Time PCR解析方法
3 Real Time PCR解析方法
1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析
3. 绝对定量和相对定量解析方法
实时荧光定量PCR介绍
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绝对定量解析方法
提取样品
流
引物设计 标准品制备
程
Real Time PCR反应
数据分析
实时荧光定量PCR介绍**来自•绝对定量解析方法
3. 绝对定量和相对定量解析方法
实时荧光定量PCR介绍
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标准曲线制作
扩增曲线 标准曲线
105 104 3 10 2 10 1 10 0 10
105 104 103 102 101 100
• 标准品梯度的选择：5～6个梯度
• 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10
实时荧光定量PCR介绍
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对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。
实时荧光定量PCR介绍
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相对定量应用例分析某基因缺失情况
检测方法 SYBR Green I 荧光嵌合法 管家基因 ACTB基因 目的基因 X基因
实时荧光定量PCR介绍
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相对定量应用例
详细的实验资料获取
分析某基因缺失情况
实验设计及引物 设计、合成
3’ 末端序列
★
△ 3’ 末端碱基最好为G 或C
△ 3’ 末端碱基尽量避免为T
互补性 特异性
RT-PCR用引物
★★★ ★★★ ★★★
△ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 △ 引物3’ 末端避免2 base以上的互补序列
使用BLAST检索，确认引物特异性 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增
通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病 毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。
检测样品
105 104 103
102
101
扩增曲线图
实时荧光定量PCR介绍
检测样品
标准曲线图
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相对定量解析方法
进 行 相 对 表 达 量 分 析 必 要 性
Sample A
实际上目的基因表达量分析
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实时荧光定量PCR介绍
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Real Time PCR探针设计原则
Real Time PCR用TaqMan探针设计原则
Probe长度 Tm值 序列 5’ 末端序列 互补性
特异性
★★ ★★★ ★ ★ ★★★ ★★★
20-24 bp 探针的Tm比引物高8-10℃
△ 目的序列GC含量相对较高的区域设计 △ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich (特别是3’
实时荧光定量 PCR介绍
主要内容
1
2 3 4
Real Time PCR基础知识
Real Time PCR实验方法 Real Time PCR解析方法 Real Time PCR应用实例
实时荧光定量PCR介绍
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Real Time PCR基础知识
1
Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
引物筛选及预实验
样品Real Time PCR反应
数据整理及报告撰写
相对定量计算及 数据分析
实时荧光定量PCR介绍
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基本概念
阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线。
实时荧光定量PCR介绍
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基本概念
起点定量重现性好，终点定量误差大（扩增效率）；阈值最佳选取范围是指数 增长期；荧光域值的仪器设置是 基线期荧光信号的标准偏差的 10 倍 。
实时荧光定量PCR介绍
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3’ 端标记一个淬灭基团（Quencher）。
R
Q
实时荧光定量PCR介绍
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TaqMan Probe法原理示意图
热变性
Primer
R
Q
退
火
Primer
Pol.
R
Q
延
伸
Primer Pol.
R
Q
实时荧光定量PCR介绍
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SYBR Green I 法与Probe法比较
SYBR Green I 法 简便易行 价格便宜 要求反应的特异性 不能进行多重PCR
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基本概念
CT 值. C 代表 Cycle , T 代 表 threshold(阈值)，每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数 。
实时荧光定量PCR介绍
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Real Time PCR基础知识
1
Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
连续，A/C连续
端)；避免T/C
探针5’ 末端的第一个碱基不能是G
Probe内部或Probe与两条引物之间避免3 base以上的互补序列
BLAST检索确认Probe特异性
实时荧光定量PCR介绍
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反应性能确认
相关系数（r2）：大于0.98 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2
线性关系、扩增效率确认
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Real Time PCR引物设计原则
扩增片段大小 Primer长度
GC含量
Tm值 序列
★ ★ ★ ★★★ ★
80-150 bp(尽量限制在300 bp以内) 17-25 base 40-60%(最好45-55%) 两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值
△ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端) △ 避免T/C连续，A/G连续 △ 3’ 末端避免GC rich或AT rich
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绝对定量应用例
探针的选择
Template SARS Control RNA or SARS Genomic RNA
对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量
Primer 共用
TaqMan® Probe 5’ 端报告基团 FAM标记 3’ 端淬灭基团 Eclipse标记
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标准品的种类
DNA样品定量标准品
基因组DNA 质粒
RNA样品定量标准品
Total RNA & cDNA
体外转录RNA
实时荧光定量PCR介绍
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质粒标准品构建流程
目的基因
基因组DNA
PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因
质粒
质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
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理想的标准品扩增曲线
基线平整
Negative Control为水平线
指数区较明显，陡度大
平台区汇于一起 线性范围宽
实时荧光定量PCR介绍
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理想的标准曲线
相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。
扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。
扩增效率（E）计算方法
标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1 扩增效率
相关系数
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Real Time PCR解析方法
3 Real Time PCR解析方法
1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析
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Real Time PCR引物设计
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。 => 对引物设计要求严格
实时荧光定量PCR介绍
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Real Time PCR的检测方法
SYBR Green I
荧光染料嵌合法
荧光探针法
TaqMan Probe
Molecular Beacon
……..
实时荧光定量PCR介绍
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荧光染料嵌合法（SYBR Green I）
SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。
细胞起始数相同
Sample B
RNA提取效率相同
目的基因扩增效率相同
以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。
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实时荧光定量PCR介绍
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相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因,
如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
根据文献提供 通过具体实验筛选
3. 绝对定量和相对定量解析方法
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融解曲线分析
SYBR Green I 法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。