糖类的检测法

糖类的检测法

前期阐述了糖类的分离法，本期就「检测法」（主要中性糖）进行阐述。

■检测法的种类

在选择某一物质的检测时，首先要看该物质的构造。就以糖类的构造而言，显著的官能团只有「OH基」，下一步，就是怎样检测⋯⋯。使用HPLC的糖类检测大致有以下几种方法。·紫外可见检测

⋯⋯直接（190～195nm）

⋯⋯衍生（柱前、柱后）

·示差折光

·荧光检测

⋯⋯衍生（柱前、柱后）

·电化学检测

⋯⋯Cu电极，Au电极

·蒸发光散射检测

下面，分别进行简单说明。

■紫外可见检测

糖类的紫外吸收只在190～195nm附近。因此，直接紫外检测时，由于受到在低波长区域的限制，流动相只能是水的条件才行，除非是相当干净的试样，否则在实用上很困难。以紫外可见检测为目标的柱后反应衍生法是很早就使用的，可利用苔黑酚一硫酸法等的显色反应的方法，但是需用耐腐蚀的装置，而且操作也麻烦，现在已不用。其他，柱前反应衍生法也不是实用的方法。

■示差折光检测

示差折光检测法是只要试样成分和流动相的折射率有差别就可检测的通用检测法，在糖类分析中作为指定的检测方法得到广泛采用。虽然还不能期望达到预想的检测灵敏度，但是，最近由于装置性能的提高，在水系流动相中也可达到nmol级检测。可是，由于是通用检测法，检测的选择性较差。另外，由于不能使用梯度

洗脱法，在使用分配法的低聚糖分析和采用硼酸络合体阴离子交换法的多成分分析上效果不好。而且，在分配法中高灵敏度时产生基线「波形」。这是由于在固定相表面上流动相（乙腈/水混合液）的平衡状态只要温度稍有变化就产生微妙的偏差，这种微小的偏差，转变为折射率的变化，并用检测器检出。其他，硼酸络合体阴离子交换法由于硼酸的杂质峰（系统峰）很象糖的峰出现，请务必注意。

■荧光检测

荧光检测法在灵敏度和检测选择性方面都优越，但是，要求成分必需是发荧光性的。由于糖类不是发荧光性的，必须对荧光衍生法进行种种研究。柱前反应衍生法是试剂中使用2氨基吡啶的吡啶氨基衍生化，广泛用于糖蛋白的糖链构造解析，可做到pmol级的检测。可是，柱前反应衍生法常常是衍生化处理相当的费时费事。而在这点上，柱后反应衍生法由于衍生化反应自动化，在常规分析中受到欢迎。柱后反应衍生法在1980年代提出了使用2-氰乙酰胺、乙醇胺等的多种方法的方案。在同一时期，笔者们也发现碱性氨基酸精氨酸在硼酸存在下，与糖类加热反应生成强的发荧光衍生体，构筑了应用此发荧光衍生物的分析系统。此系统一直到现在有许多用户还在使用，开发者感到无限喜悦。

■电化学检测

电化学法也是高灵敏度的检测法，在用于糖类方面有使用Cu或Au电极的方法。特别是，Au电极与脉冲方式相组合的方法可检测数pmol级的糖。可是，由于反应液必须保持强碱性，根据流动相条件，柱洗脱液中必须用另外的泵注入高浓度的氢氧化钠。另外，由于检测的选

择性不高，在与杂质成分的分离上存在问题。

8

■蒸发光散射检测器

蒸发光散射法是柱洗脱液进行喷雾，流动相经蒸发除去后，用光照射溶质，检测它的散射光的方法，可检测任何不挥发性成分的检测器。约20年前已有市售的装置。但是在灵敏度和操作性等各点还存在困难，未能很好善及。然而，最近出现了性能良好的装置，作为通用检测器重新得到广泛使用。由于可适用于梯度洗脱法，在糖类检测中，特别是在用分配法进行的低聚糖分析上效果好。可是，从它的原理上，不能使用不挥发性流动相（例如缓冲液），这点须注意。

以上，在进行糖类的分析时，分离法加起来，检测法也有许多更细的选择，应根据目的选择最佳的检测法。