食品中志贺氏菌检验

2.04g 蒸馏水120mL 乳糖1.2g 0.01%结晶紫水溶液1.2mL 0.5%中性红水 溶液 0.6mL ❖ 制法： ⅰ将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2， ❖ 将琼脂加入于600ML蒸馏水中， 加热溶解。将两液合并，分装于121℃高压 灭菌15min备用。 ⅱ 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃ 时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后 倾注平板。
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培养基的制备
❖ 3、SS琼脂液的配制 ❖ 成分：牛肉膏0.6g 琼脂2.04g 三号胆盐0.42g 蒸馏水120ml，月示胨0.6g ❖ 制法：将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入600ml蒸 ❖ 馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合121℃高压灭菌15min,保存备用。 ❖ 4、麦慷慨琼脂液的配制 ❖ 成分：蛋白胨2.04g 脙胨0.36g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g 氯化钠0.6g 琼脂
纹和水珠 ❖ 对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行包
扎：要将报纸裁成5-10公分，成30°卷起，结尾处向上折 叠即。
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培养基的制备
❖ 1.CN 增菌液 ❖ 成分:胰蛋白胨20g 柠檬酸钠5g 磷酸二氢钾1.5g 葡萄糖1g 去氧胆碱
酸钠0.5g 氯化钠5g 甘露醇2g 磷酸氢二钾4g 蒸馏水1000ml ph7.0 ❖ 制法：按上述成分配好，加热溶解，校正PH。分装每瓶225ml ，
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实验结果
志贺菌在培养基上呈现无 色透明不发酵乳糖的菌落
志贺菌在三糖铁琼脂中底沉产酸，不 产气，斜面产碱，不产生硫化氢 无 动力在，在半固体管内沿穿刺线生长。
实验结果
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三、实验的试剂和仪器
试剂和仪器
仪器与设备
培养基与试剂
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ຫໍສະໝຸດ Baidu
仪器与设备
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规格名称
❖
1、500ml广口瓶
❖
2、500ml三角瓶
❖
3、250ml三角瓶
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4、18×180mm试管
❖
5、13×100mm试管
❖
6、1ml移液管
❖
7、10ml移液管
❖
8、直径为90mm平皿
❖
9、250ml量筒
❖
10、玻璃棒
❖
11.、恒水浴箱
❖ 7.镜检 从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的 菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。
❖ 8.结果报告
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五． 注意事项
1、志贺菌在常温存活期很短。因此，当样品采集后， 应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在 冰箱内，入欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。 2、迄今没有很好的曾菌培养基。目前仍然认为用GN 肉汤曾菌检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。
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培养基的制备
❖ 5、伊红美蓝琼脂（EMB） ❖ 成分：蛋白胨 10g 2%伊红溶液20ml 乳糖10g 0.65%美兰溶液10ml 磷酸二氢
钾28g 蒸馏水1000ml 琼脂17g PH7.1 ❖ 制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解于蒸馏水中，校正ph，分装于烧杯内，
121c高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶解琼脂，冷却，加入伊 红和美蓝溶液，摇匀。倾注平板。 ❖ 6、三糖铁琼脂的配制 ❖ 成分：蛋白胨4.8g 牛肉膏0.6g 乳糖1.2g 蔗糖1.2g 葡萄糖0.12g 氯化钠 0.6g 硫酸亚铁胺0.024g 硫代硫酸钠0.024g 琼脂0.72g 酚红0.003g 蒸馏水 120mL pH7.4 ❖ 制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂， 加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装 量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。
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操作步骤
❖ 5.分离 取增菌液一环 ，划线接种于SS琼脂平板一个，伊 红美蓝琼脂平板一个，于（36±1）℃培养18-24小时。志 贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
❖ 6.生化试验 挑取平板上的可疑菌落，接种三塘铁琼脂和 半固体各一管，一般应多挑取几个以防遗漏，志贺菌属在 三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面产碱， 不产生硫化氢，无动力，在半固体管内，沿穿刺线生长。
5支 13×100mm试管
5支
13×100mm试管
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四、实验步骤
流 程 图
实
操
验
作
步
步
骤
骤
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流程图
采样 ↓
样品处理 ↓
选择性增菌 ↓
选择性平板划分 ↓
生化实验 ↓
镜检 ↓
结果报告
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实验前的准备
包扎灭菌
❖ 对烧杯、玻璃棒、移液管、试管、培养皿、锥形瓶的清洗 ❖ 注意：洗涤后的仪器应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条
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培养基的制备
❖ 7、生理盐水的配制 ❖ 成分Nacl0.9g,蒸馏水100ml ❖ 制法一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml
蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入 500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包 扎后于121度高压灭菌15min ❖ 8、氯化钠结晶紫增菌液的配制 ❖ 成分：蛋白胨2.4g 氯化钠4.8g 0.01%结晶紫溶液0.6mL 蒸馏水 120mL pH9.0 ❖ 制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧 化钾溶液4.5mL，校正pH。加热煮沸， 过滤。再加入结晶紫溶液， 混合后分装试管。121℃高压灭菌15min
115 C高温灭菌15min ❖ 2、HE琼脂 ❖ 成分：蛋白胨12g 水杨素2g 蒸馏水1000ml 乙液20ml 牛肉膏3g 胆盐
20g 0.4% 溴麝香草芬兰钠溶液16ml 乳糖12g 氯化钠5g 蔗糖12g 琼 脂20g 甲液20ml HP7.5 ❖ 制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶 解于400ml蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶 解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合 并，冷却，倾注平板，
❖
12、显微镜
数量 1个 1个 4个
5副 1个
1个 1台
用途 稀释样品 制增菌液 制培养基 制三糖铁培养基 制蛋白胨水等
制SS、EMB平板
镜检
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培养基与试剂
❖ GN增菌液
225ml/瓶
❖ EMB培养基
100ml/瓶
❖ SS琼脂
100ml/瓶
❖ 三糖铁斜面
6ml/支
❖ 葡萄糖半固体培养费基 4ml/支
志贺氏菌检验
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一、实验目的
1 了解食品安全与志贺氏菌检验关系 2 了解志贺氏菌生理形态化学性质 3 掌握志贺氏菌检验方法和结果判断 4 检验食品中是否有志贺氏菌
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二.实验原理
需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长， 最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时 后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整 齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵乳 糖，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分 解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。
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操作步骤
❖ 1.灭菌 ❖ 干热灭菌：剪刀及棉绳等干热灭菌 ❖ 湿热灭菌：均质袋、纱布、各种培养基、生理盐
水、增菌液 ❖2.采样 从食堂中取一个鸡蛋 ❖3.样品处理 将鸡蛋打碎放入无菌碗里，然后用杀
菌的玻璃棒搅拌，在放入到均质袋中用均质器打 匀 ❖4. 增菌 称取检样25g，加入装有225mlGN增菌液 的500ml的广口瓶内，于（36±1）℃培养6-8h
❖ 蛋白胨水
2ml/支
❖ 5%乳糖发酵管
3ml/支
❖ 甘露醇发酵管
3ml/支
❖ 棉子糖发酵管
3ml/支
❖ 甘油发酵管
3ml/支
1瓶 500ml三角瓶
1瓶 250ml三角瓶
1瓶
250ml三角瓶
6支 15×150mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
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注意事项
3、增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的 阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于 两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个； 弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS 琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作 为弱选择性培养基使用。 4、动力的观察非常重要。挑取可疑菌落，除接 种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂。