食品中志贺氏菌检验
志贺氏菌检验方法
03
，如实验服、口罩、手套等。
样品处理注意事项
样品采集时应保证无菌操作，避免污染。
样品应尽快送至实验室进行检验，避免长时间存 放导致细菌繁殖。
样品处理过程中应保持清洁卫生，避免交叉污染 。
检验方法选择注意事项
1
根据样品类型和检验目的选择合适的检验方法。
2
对于不同种类的志贺氏菌，应选择具有针对性的 检验方法。
断结果。
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
利用特异性引物扩增志贺氏菌基因片段，通过凝胶电泳检 测扩增产物，判断是否存在志贺氏菌。
基因测序
对志贺氏菌基因进行测序分析，与其他已知基因序列进行 比对，以确定志贺氏菌的种属和亚种。
生物传感器技术
利用生物传感器检测志贺氏菌的代谢产物或特异性抗原， 通过信号转换器将生物信号转化为电信号，实现快速、灵 敏的检测。
食品样品的处理
采集到的食品样品应尽快送往实验室进行检验，如果不能及时送检，应将样品低 温保存，避免样品变质和污染。
04
志贺氏菌检验的注意事项
实验室安全注意事项
01
实验室应保持清洁卫生，定期进行消毒处理，确保无菌环境。
02
实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染和意外感染。
实验人员应接受专业培训，熟悉操作规程，佩戴个人防护装备
03
志贺氏菌检验的样品采集与处 理粪便样品的采集与处理粪便样品的采集
采集粪便样品时，应确保采集到新鲜 、未被污染的粪便，并尽量多采集一 些，以增加检出率。
粪便样品的处理
采集到的粪便样品应尽快送往实验室 进行检验，如果不能及时送检，应将 样品低温保存，避免样品干燥和污染 。
水样品的采集与处理
《食品检验工》(三级)志贺氏菌
试题单
试题代码：1.1.1
试题名称：乳粉志贺氏菌检验
规定用时：240min
1、操作条件
（1）乳粉样品
（2）生物安全柜
（3）志贺氏菌检验培养基和试剂
（4）检验常用玻璃器皿
（5）检验设备
（6）常用耗材
（7）检验方法标准（GB/T 4789.5-2003）（8）志贺氏菌阳性平板、阳性生化管培养物
2、操作内容
（1）选择检验设备、培养基和稀释液
（2）检验乳粉中志贺氏菌
（3）对考场提供的阳性培养物进行检验操作（4）填写检验原始记录，对检验结果做出判定（5）实验后消毒处理
3、操作要求
（1）正确选择检验设备、培养基和以及试剂（2）按检验方法标准操作
a．无菌操作
b．样品制备
c．检验操作步骤
d．检验结果观察并作判断
（3）逐项填写实验记录
（4）做好实验后消毒处理工作
答题卷
试题代码：1.1.1
姓名：准考证号：1、选用设备和培养基试剂
2、实验记录表
食品检验工（三级）操作技能鉴定试题评分表与参考答案
考评员（签名）：考评日期。
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法Mic伪biological examination of food hygi叨ewe Examination of Salmonellae , Shigellae , and diarrhoea causative及cherich血coli妙means of thed泣agnostic typing phage set for enterobacteriaceae前言本标准对GB/T4789.31一1994袭食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌肠杆菌科噬菌体检验方法》进行修订。
本标准与GB/T4789.31一19料相比主要修改如下：―按照GB/T1.1一2000对标准文本的格式和文字进行修改。
―规范原标准中的“设备和材料”。
本标准自实施之日起，GB/T4789.31一19944同时废止。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。
本标准起草单位：江西省卫生防疫站、中国疚病预防控制中心营养与食品安全所。
本标准主要起草人：何晓青、付萍、计融。
本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。
范围本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要求、操作程序和结果判定本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验．2、规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其墩新版本适用于本标准。
GB／T4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB/T4789.5一2003食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB/T4780.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3、设备和材料3.1恒温培养箱：36℃士1℃。
4789.5志贺菌检验
培养条件：41.5℃±1℃ 厌氧培养
原国标： 37℃需氧培养 ISO： 41.5℃厌氧培养 FDA： 42℃（除宋内其他志贺菌)和44℃（宋内）厌氧培养 NMKL： 42℃厌氧培养
食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验标准的修订
GB 4789.5
志贺氏菌
主要的肠道病原菌之一, 引起人类细菌性痢疾
尽管大量的分类学资料认为这类细菌应包括在大肠杆菌
（E.coli）内，但一些临床微生物学家往往仍当作一个独立的菌属
来对待。
伯杰手册(1984)中将其分为4个血清群(种)
A群痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae） B群福氏志贺氏菌（S.flexneri） C群鲍氏志贺氏菌（S.boydii） D群宋内氏志贺氏菌（S.sonnei）。 这些菌群还可根据血清学再进一步分型。
实验结论
1.通过对五种不同染菌浓度0.1 cfu/g、0.5 cfu/g、 1 cfu/g 、5 cfu/g、 10 cfu/g的样品测定，用GN增菌 液需氧培养，宋内氏志贺菌的最低检出限为5 cfu/g； 福氏志贺氏菌的最低检出限为5 cfu/g；痢疾志贺氏菌 的最低检出限为10 cfu/g；鲍氏志贺氏菌的最低检出 限为10 cfu/g ；所以方法的检出限为5-20 cfu/25g。
现行GB/T 4789.5-2003标准不足 处
1. 采用的GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后大肠菌 的生长速度大大超过志贺氏菌,所以检测效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制
食品微生物学检验 志贺氏菌检验作业指导书
食品微生物学检验志贺氏菌检验1、范围适用于食品中志贺氏菌的检验2、设备和材料2.1恒温培养箱：36℃±1℃2.2冰箱：2℃—5℃2.3厌氧培养装置：41.5℃±1℃2.4电子天平；2.5显微镜2.6均质器；2.7无菌吸管；2.8无菌均质杯；2.9无菌培养皿，直径90mm；2.10生化鉴定试剂盒；2.11比浊管及比浊管架；3、培养基和试剂3.1志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素3.2麦康凯琼脂（MAC）3.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）3.4志贺氏菌显色培养基3.5三糖铁琼脂3.6营养琼脂平面4、操作步骤4.1增菌以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片均质器以8000r/min~10000r/min均质，于41.5℃±1℃厌氧培养16h~20h。
4.2分离取增菌后的志贺氏菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h~24h，观察各个平板上生长的菌落形态，若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h进行观察。
志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1.表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征4.3 初步生化试验(1)自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI.半固体和营养琼脂斜面各一管。
置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。
(2)凡是三糖铁琼脂中斜面产碱，底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）.不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），不产硫化氢，半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的琼脂斜面上长的菌落，进行生化试验和血清学分型。
5、生化试验(1)生化试验（生化鉴定试剂盒）a.菌悬液的制备取一支盛有2ml无菌水的试管；用接种针挑取可疑菌落至无菌水中；仔细研磨，与标准浊度管比较，制成0.5个麦氏浊度的均匀菌悬液。
食品中志贺氏菌检验
食品微生物检验技术
无色至浅粉红色， 半透明、光滑、湿 润、圆形、边缘整 齐或不齐
白色，不透明、圆形、 边缘不整齐，直径1 mm～3 mm，菌落 周围琼脂颜色变为紫 红色
操作规程
已培养的营养琼脂斜面上生 长的菌苔，进行生化试验
二、志贺氏菌检测
ß-半乳糖苷酶
尿素
选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固 体、营养琼脂斜面，36℃1 ℃培养20h～24h，观察结果。
食品微生物检验技术
一、志贺氏菌概况
概述
志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临 床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆 菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌 引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性 中毒性菌痢，死亡率甚高。
一、志贺氏菌概况
需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2-7.4； 在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、
在中等大小的菌落； 宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落
呈玫瑰红色； 在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
增菌：用GN增菌液使处于 濒死状态的细菌恢复活力
报告
二、志贺氏菌检测
操作规程
225ml 志贺氏 菌增菌液增菌
选择性增菌
细胞数量增殖 液体 25mL 摇匀
样品
25g 均质
固体 样品
鉴别培养基
寻找可疑典型菌落
穿刺划斜面
TSI、营养琼脂、半固体培养基
41.5±1℃
16~18h 厌氧培养
4789.5志贺菌检验
对可疑的食品，包括在使用前需用手处理的或 轻微加热的产品，且其酸度范围由PH5.5至6.5 之间。一般来说，当食品中含有大量的大肠菌 群，大肠杆菌与沙门氏菌时，同时即可疑含有 志贺氏菌。
现行GB/T 4789.5-2003标准不足处
1. 采用的GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后大肠菌
的生长速度大大超过志贺氏菌,所以检测效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制 3. 检验方法与现行的其它国家的标准存在差异
修 订 原 则
1.以原国标为基础，保持与原标准的连续性
考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件尽可能 简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法
2.与国际接轨的原则
该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ，部分参 考采用了美国FDA、NMKL等标准
培 养 特 性
志贺氏菌属于革兰氏阴性短杆菌； 无芽孢、无荚膜、无鞭毛、不运动 需氧或兼性厌氧，营养要求不高，能在普通培 养基上生长 能利用葡萄糖与其他碳水化合物，产酸不产气。 除A群外，B 、 C 、 D群均能发酵甘露醇，除 D群外，A 、 C和D群均不发酵乳糖； D群具 有鸟氨酸脱羧酶
菌体（0）抗原 1.型特异性抗原：化学组成为多糖，是光滑型菌株所 含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常 随之消失，根据所含的型抗原不同，可将志贺菌属分 为A、B、C、D四个群及39个抗原型。 2.群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌 体抗原的一种。特异性较低，主要存在于B群。根据所 含的群抗原不同，可将一些菌型分为多种亚型。
西蒙氏柠檬酸盐实验
挑取少量琼脂培养物接种，于36±1℃培 养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌 落生长，培养基从绿色转为蓝色。
PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立
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志贺氏菌检验
志贺氏菌检验志贺氏菌属于肠杆菌科，是一种革兰氏阴性菌，会引起肠道感染，引发肠炎，当人出现连续性腹泻、腹痛等症状的时候，就需要考虑是否感染志贺氏菌。
志贺氏菌的传播途径主要是食物和水，比如沙拉、土豆、金枪鱼、虾、奶制品等，在密闭以及不卫生的条件下志贺氏菌会迅速传播，而且经常出现在人员比较密集的地方，比如餐厅、食堂等地。
食源性志贺氏菌的传播主要是因为从事食品工作的人员感染了志贺氏菌，并且将其传播到食物上所引起的，另外，保存食物的温度不当，也可能引起志贺氏菌。
志贺氏菌检验是临床上检验肠道感染疾病的一个重要途径，在检测过程中常用的方法有以下几种。
一、生化鉴定法常规的生化鉴定方法是志贺氏菌检验过程中的常用方法，需要对细菌进行增殖培养、分离、生化试验、血清学检验等步骤来完成，步骤比较繁琐，而且耗时较长，每一次一般只能检验一个样品，但是检测的结果比较准确，检测稳定性较高，假阳性率低。
二、免疫学检验方法免疫学是检验志贺氏菌最快速、准确的方法，特异性较强，而且灵敏度很高，主要的免疫学检验方法有以下几种：第一，酶联免疫法。
这种方法的灵敏度很高，而且简单快速，检测过程比较稳定，可以进行自动化操作，是志贺氏菌检测过程中最快速的一种方法。
但是，使用酶联免疫法进行检验的时候，影响检测结果的因素较多，而且假阳性率高，所以还需要采用其他的方法进行配合检验。
第二，SPA协同凝集法。
这种方法是使用已知标准血清吸附到含Ａ蛋白的金黄色葡萄球菌表面之后，让金黄色葡萄球菌成为吸附抗体的载体，再根据吸附的结果来诊断是否感染志贺氏菌的一种方法。
三、分子生物学方法分子生物学是建立在很多其他的检测技术基础上的，敏感度高、检测快速，而且特意性高，是生物技术革命的一个重要产物，目前在志贺氏菌的检测过程中十分常见。
志贺氏菌的分子生物学检测方法有以下几种：第一，聚合酶链式反应法，比如常规PCR、多重PCR法、实时荧光PCR法和恒温荧光PCR法等。
以恒温实时荧光PCR法为例，这种方法的原理是利用环介导等温扩增反应为原理进行测量的方法，灵敏度很高，与传统的荧光测量方法相比，灵敏度高出2～5个数量级，而且测量十分迅速，荧光反应的时间较短，一般30-60分钟就可以完成荧光反应。
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
1、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃， PH7.2~7.4。
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第11页
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
(沙门氏菌（红色）侵入人体细胞 第12页
• 2、对营养要求不高，在普通培养基生长良 好，37 ℃，24h，能形成菌落中等大小，直 径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润， 无色半透明，边缘整齐菌落
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第23页
四、微生物检验
（一）、基本步骤（程序定→汇报
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第24页
• 1、前增菌：用无选择性培养基使处于濒死状 态M恢复活力;
• 2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，基它 细菌变到抑制;
BS上菌落
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
SS上菌落
第28页
3、五项生化试验
H2S、靛基质 、 PH7.2尿素酶、KCN 、 赖氨酸脱羧酶
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第29页
（1）三糖铁培养培养
经典沙门氏菌在三糖铁培养上特征： 表面（-）粉红色、底层（+）黄色、 H2S （+）底层有黑色、有动
• 3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长， 无菌膜。
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第13页
• （三）、生化特征
• 1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤 寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）
• 2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇
• 3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-）， 不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（ V—P）（-），
• 3、选择性平板分离培养：分离出所需细菌;
食品中志贺氏菌检验
20g 0.4% 溴麝香草芬兰钠溶液16ml 乳糖12g 氯化钠5g 蔗糖12g 琼 脂20g 甲液20ml HP7.5 ❖ 制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶 解于400ml蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶 解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合 并，冷却，倾注平板，
❖ 7.镜检 从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的 菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。
❖ 8.结果报告
五． 注意事项
1、志贺菌在常温存活期很短。因此，当样品采集后， 应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在 冰箱内，入欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。 2、迄今没有很好的曾菌培养基。目前仍然认为用GN 肉汤曾菌检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。
注意事项
3、增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的 阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于 两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个； 弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS 琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作 为弱选择性培养基使用。 4、动力的观察非常重要。挑取可疑菌落，除接 种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂。
实验结果
志贺菌在培养基上呈现无 色透明不发酵乳糖的菌落
志贺菌在三糖铁琼脂中底沉产酸，不 产气，斜面产碱，不产生硫化氢 无 动力在，在半固体管内沿穿刺线生长。
实验结果
纹和水珠 ❖ 对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行包
扎：要将报纸裁成5-10公分，成30°卷起，结尾处向上折 叠即。
志贺氏菌检测标准
志贺氏菌检测标准志贺氏菌是一类常见的细菌，它造成了许多消化系统疾病。
为了确保消费者的安全，食品厂商和相关组织都需要进行志贺氏菌的检测。
本文将详细介绍有关志贺氏菌检测的标准，以确保消费者的健康和安全。
第一步骤：选择适当的样本检测开始前，需要选择适当的样本。
这可以是从环境，食品或水源中收集得到的，以确定是否存在志贺氏菌。
通常，人们从肉类，奶类以及其他易受污染的食品等选择样本进行检测。
选择适当的样本对于获得准确的结果非常重要。
第二步骤：采集样本在进行检测前，样本需要采集。
采集需采取规范化程序，以确保采集的样品实际上代表了被检测对象的状况。
采集过程需要避免污染样品，否则可能影响检测结果。
第三步骤：样本处理样品处理是保证测试数据准确性的关键，它可以消除干扰物质和旁边生物。
对于厨房和医疗设施，在处理志贺氏菌样品时应该采取严格的操作。
操作过程应精确规范，以保证样品不与其他样品的任何形式发生交叉污染。
第四步骤：实验室测试在实验室中进行测试是一种保证分析的准确性的方式。
志贺氏菌检测一般使用PCR或者培养方法进行。
不同的实验室可能采用不同的实验操作方法，因此测试数据包括实验的操作条件和环境条件等因素可能会有所不同。
第五步骤：分析测试结果在分析测试结果时，需要考虑到数据的相对稳定性和准确性问题。
分析的结果应包括相关的质量控制数据，以便能够确定测试是否正确进行。
正确的数据分析必须满足比如重复性，标准色谱的基本要求，因此必须引入知识和技术。
总之，通过以上五个步骤，我们可以实现对志贺氏菌的高效检测，并确保消费者的食品安全。
当然，我们在使用志贺氏菌检测标准时，需要时刻关注其技术竞争力和检测过程的规范化，这将为消费者提供一个安全的健康环境，成为维护人民健康的重要保障。
食品中志贺氏菌的检验
菌落形态学
• 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、 质地等等，都是区分细菌的重要手段。
弗 氏 志 贺 氏 菌 的 菌 落 特 征
宋内志贺菌乳糖迟发酵菌株 在麦康凯平板上的菌落特征
细菌在肉汤培养基中的生长
二、志贺氏菌的生物学特性
3、志贺氏菌的生化特性： 本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。 大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵 乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性， VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。 与肠杆菌科各属细菌相比较，志贺氏菌 的主要鉴别特征为不运动，对各种糖的 利用能力较差，并且在含糖的培养基内 一般不形成可见气体。根据生化反应可 进行初步分类。
志贺氏菌的检验
志贺氏菌属 于肠杆菌科志贺氏菌属 ,根据生化特 性不同将其分为四个群: A群--痢疾志贺氏菌；B群----福氏志贺氏菌 C群--鲍氏志贺氏菌；D群----宋内氏志贺氏菌 志贺氏菌属的细菌统称痢疾杆菌.临床上能引起痢疾 症状的病原微生物很多,如志贺氏菌属 、沙门氏菌属、 变形杆菌属、埃希氏菌属等，还有阿米巴原虫及病毒 等。其中以志贺氏菌属 引起的细菌性痢疾最为常见， 是细菌性痢疾的主要病原菌。通过食品和饮水传播， 引起人的疾病。人对志贺氏菌的易感性很高，人是它 的唯一宿主。所以在食物和饮用水的卫生检验时，常 以是否含有志贺氏菌作为指标。
志贺氏菌属的四个群
根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本 属细菌分为四个群、39个血清型（包括亚型） • A群：也称志贺氏菌群，有10个血清型。不发酵甘 露醇，无鸟氨酸脱羧酶，与其他各群细菌无血清 学联系。 • B群：也称福氏菌群，已有13个血清型（包括亚型 和变种）。最近又发现3个亚型（1c、4c、5b）。 发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。抗原结构较复杂， 各型间有交叉凝集。每一福氏菌型具有二种抗原， 即型特异性抗原和群抗原，前者只存在于同型菌 株中，后者有许多种，存在于福氏各菌型中。例 如福氏1b型除含有1型特异性抗原外，尚含有4、6 群抗原。
食品中志贺氏菌的检验
• （4）凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气 （福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力的 菌株，可以做血清学分型和进一步的生化试验。 • 即：凡是三糖铁反应符合志贺氏菌属特征者（斜 面产碱或不变色，底层产酸，H2S（-），产气（），但福氏6型产生少量气体）、无动力；在半固 体管内沿穿刺线生长的菌株，疑是志贺氏菌，可 做血清凝集试验和进一步的生化试验。
Байду номын сангаас
（二）、培养基与试剂 GN培养基 HE琼脂平板 SS琼脂培养基 三糖铁琼脂 麦康凯琼脂 氰化钾培养基 氨基酸脱羧酶试验培养基 伊红美兰琼脂（EMB) 半固体管 葡萄糖铵琼脂 尿素琼脂 西蒙氏柠檬酸盐琼脂 糖发酵管 乳糖发酵管 蛋白胨水、靛基质试剂 志贺氏菌属诊断血清
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食品中志贺氏菌的检验
GB/T 4789.5-2003
• 志贺氏菌属是无鞭毛、无芽孢的革兰氏阴 性杆菌，可引起细菌性痢疾，是一种常见 的肠道传染病菌 • 志贺氏菌在食品中的存活时间较短，在检 验时无理想的增菌方法
• （一）、设备： 培养皿 9cm 均质机 接种针、接种环 显微镜 培养箱
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（三）操作步骤 1、增菌 以无菌操作取检样25克（毫升），加入装有225毫升GN增菌液的广口瓶内， 固体食品用均质器以8000r/min~10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨 碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6h~8h。培养时 间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 2、分离和初步生化试验 （1）取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个；另取一环 划线接种于麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂平板一个，于36℃培养18h~24h，志 贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。 （2）挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各一管。一般 应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18h~24h，分别观察结果。 （3）下述培养物可以弃去： a）在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； b）在18h~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物； c）不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物； d）产气的培养物； e）有动力的培养物； f）产生硫化氢的培养物。
实验六 食品中志贺氏菌的检验
实验六食品中志贺氏菌的检验一、实验目的要求1、了解食品的质量与志贺氏菌检验的意义。
2、掌握志贺氏菌的生物学特性。
3、掌握志贺氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。
4、掌握志贺氏菌属血清学试方法。
5、掌握食品中志贺氏菌检验的方法和技术。
二、原理志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。
临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。
人类对痢疾杆菌有很高的易感性。
在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。
所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。
志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。
不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。
志贺氏菌属的主要鉴别特征为：无鞭毛，不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。
志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。
三、试剂和仪器（一）最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶1个制增菌液3、250ml三角瓶6个制培养基4、18×180mm试管8支制三糖铁培养基5、13×100mm试管40支制蛋白胨水等6、1ml移液管2支7、10ml移液管 2 支8、直径为90 mm平皿12套制SS、EMB平板9、250ml量筒1支（二）应灭菌的其它器材剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量（三）应准备的培养基和试剂培养基总量所用容器1.GN 增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶2.EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶3.SS琼脂100ml/瓶1瓶250ml三角瓶4.三糖铁斜面6ml/支6支15×150mm试管5.葡萄糖半固体培养费基4ml/支5支13×100mm试管6.蛋白胨水2ml/支5支13×100mm试管7.5%乳糖发酵管3ml/支5支13×100mm试管8.甘露醇发酵管3ml/支5支13×100mm试管9.棉子糖发酵管3ml/支5支13×100mm试管10.甘油发酵管3ml/支5支13×100mm试管11.兔血浆3ml/支1支13×100mm试管12.多价血清和26种因子血清四、实验内容样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→血清学试验鉴别→→结果报告第一天样品处理和增菌培养（一）、样品处理无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。
食品微生物检验：志贺氏菌、弧菌
1～5又可分为两个亚型，还有x、y两个变种， 这些型、亚型和变种之间通过大量的共同抗 原联系在一起。
C群:鲍氏志贺氏菌，有15个血清型，其中
D群:宋内氏志贺氏菌，只有一个种(血清
有的血清型有甘露醇阴性的变种。
型)，它具有I相(光滑型)和Ⅱ相(粗糙型)的
变异。
(一)形态与染色
志贺氏菌属的形态，与肠杆菌科细菌的形态相似。
如宋内氏志贺氏菌对乳糖能迟缓发酵， 鲍氏志贺氏菌9型的一些培养物能发酵，痢 疾志贺氏菌I型少数培养物能迟缓发酵。
(四)抗原结构 志贺氏杆菌有O抗原和K抗原。
1、O抗原
脂多糖，耐热，稳定。
不同的志贺氏菌O抗原不同。
每群志贺氏菌中不同的O抗原用罗马数字表示 Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ· · · ·
同一群志贺氏菌中不同菌型所带的O抗原也不 同。
为革兰氏阴性短杆菌，两侧平行、末端钝圆，长约
2µm～3µm，宽约0.5µm～0.7µm。
无荚膜、无鞭毛、不形成芽胞，无动力，是与沙 福氏志贺氏菌的1a、2a、2b、3、4a、5、x、y血
门氏菌不同之处。
清型有I型菌毛，容易附着在肠粘膜上皮细胞上。
本菌为兼性厌氧菌，但厌氧培养时，生长较不 营养要求不高，在普通培养基上易于生长。 最适温度为37℃左右，但在10℃～40℃范围内
旺盛。
亦可生长，最适pH约为7.2。
在固体培养基上经培养18h～24h后，菌落 圆形、透明、隆起并微凸、直径约2mm～3mm、 表面光滑、湿润、边缘整齐。
在普通琼脂培养基上无色。
志贺氏菌菌落形态
HE上不发酵乳糖的肠道菌，
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实验结果
志贺菌在培养基上呈现无 色透明不发酵乳糖的菌落
志贺菌在三糖铁琼脂中底沉产酸，不 产气，斜面产碱，不产生硫化氢 无 动力在，在半固体管内沿穿刺线生长。
实验结果
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培养基的制备
❖ 5、伊红美蓝琼脂（EMB） ❖ 成分：蛋白胨 10g 2%伊红溶液20ml 乳糖10g 0.65%美兰溶液10ml 磷酸二氢
钾28g 蒸馏水1000ml 琼脂17g PH7.1 ❖ 制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解于蒸馏水中，校正ph，分装于烧杯内，
121c高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶解琼脂，冷却，加入伊 红和美蓝溶液，摇匀。倾注平板。 ❖ 6、三糖铁琼脂的配制 ❖ 成分：蛋白胨4.8g 牛肉膏0.6g 乳糖1.2g 蔗糖1.2g 葡萄糖0.12g 氯化钠 0.6g 硫酸亚铁胺0.024g 硫代硫酸钠0.024g 琼脂0.72g 酚红0.003g 蒸馏水 120mL pH7.4 ❖ 制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂， 加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装 量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。
5支 13×100mm试管
5支
13×100mm试管
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四、实验步骤
流 程 图
实
操
验
作
步
步
骤
骤
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流程图
采样 ↓
样品处理 ↓
选择性增菌 ↓
选择性平板划分 ↓
生化实验 ↓
镜检 ↓
结果报告
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实验前的准备
包扎灭菌
❖ 对烧杯、玻璃棒、移液管、试管、培养皿、锥形瓶的清洗 ❖ 注意：洗涤后的仪器应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条
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注意事项
3、增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的 阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于 两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个； 弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS 琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作 为弱选择性培养基使用。 4、动力的观察非常重要。挑取可疑菌落，除接 种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂。
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培养基的制备
❖ 3、SS琼脂液的配制 ❖ 成分：牛肉膏0.6g 琼脂2.04g 三号胆盐0.42g 蒸馏水120ml，月示胨0.6g ❖ 制法：将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入600ml蒸 ❖ 馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合121℃高压灭菌15min,保存备用。 ❖ 4、麦慷慨琼脂液的配制 ❖ 成分：蛋白胨2.04g 脙胨0.36g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g 氯化钠0.6g 琼脂
志贺氏菌检验
1
一、实验目的
1 了解食品安全与志贺氏菌检验关系 2 了解志贺氏菌生理形态化学性质 3 掌握志贺氏菌检验方法和结果判断 4 检验食品中是否有志贺氏菌
2
二.实验原理
需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长， 最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时 后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整 齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵乳 糖，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分 解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。
纹和水珠 ❖ 对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行包
扎：要将报纸裁成5-10公分，成30°卷起，结尾处向上折 叠即。
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培养基的制备
❖ 增菌液 ❖ 成分:胰蛋白胨20g 柠檬酸钠5g 磷酸二氢钾1.5g 葡萄糖1g 去氧胆碱
酸钠0.5g 氯化钠5g 甘露醇2g 磷酸氢二钾4g 蒸馏水1000ml ph7.0 ❖ 制法：按上述成分配好，加热溶解，校正PH。分装每瓶225ml ，
115 C高温灭菌15min ❖ 2、HE琼脂 ❖ 成分：蛋白胨12g 水杨素2g 蒸馏水1000ml 乙液20ml 牛肉膏3g 胆盐
20g 0.4% 溴麝香草芬兰钠溶液16ml 乳糖12g 氯化钠5g 蔗糖12g 琼 脂20g 甲液20ml HP7.5 ❖ 制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶 解于400ml蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶 解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合 并，冷却，倾注平板，
❖ 7.镜检 从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的 菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。
❖ 8.结果报告
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五． 注意事项
1、志贺菌在常温存活期很短。因此，当样品采集后， 应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在 冰箱内，入欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。 2、迄今没有很好的曾菌培养基。目前仍然认为用GN 肉汤曾菌检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。
2.04g 蒸馏水120mL 乳糖1.2g 0.01%结晶紫水溶液1.2mL 0.5%中性红水 溶液 0.6mL ❖ 制法： ⅰ将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2， ❖ 将琼脂加入于600ML蒸馏水中， 加热溶解。将两液合并，分装于121℃高压 灭菌15min备用。 ⅱ 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃ 时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后 倾注平板。
❖
12、显微镜
数量 1个 1个 4个
5副 1个
1个 1台
用途 稀释样品 制增菌液 制培养基 制三糖铁培养基 制蛋白胨水等
制SS、EMB平板
镜检
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培养基与试剂
❖ GN增菌液
225ml/瓶
❖ EMB培养基
100ml/瓶
❖ SS琼脂
100ml/瓶
❖ 三糖铁斜面
6ml/支
❖ 葡萄糖半固体培养费基 4ml/支
❖ 蛋白胨水
2ml/支
❖ 5%乳糖发酵管
3ml/支
❖ 甘露醇发酵管
3ml/支
❖ 棉子糖发酵管
3ml/支
❖ 甘油发酵管
3ml/支
1瓶 500ml三角瓶
1瓶 250ml三角瓶
1瓶
250ml三角瓶
6支 15×150mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
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操作步骤
❖ 1.灭菌 ❖ 干热灭菌：剪刀及棉绳等干热灭菌 ❖ 湿热灭菌：均质袋、纱布、各种培养基、生理盐
水、增菌液 ❖2.采样 从食堂中取一个鸡蛋 ❖3.样品处理 将鸡蛋打碎放入无菌碗里，然后用杀
菌的玻璃棒搅拌，在放入到均质袋中用均质器打 匀 ❖4. 增菌 称取检样25g，加入装有225mlGN增菌液 的50
操作步骤
❖ 5.分离 取增菌液一环 ，划线接种于SS琼脂平板一个，伊 红美蓝琼脂平板一个，于（36±1）℃培养18-24小时。志 贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
❖ 6.生化试验 挑取平板上的可疑菌落，接种三塘铁琼脂和 半固体各一管，一般应多挑取几个以防遗漏，志贺菌属在 三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面产碱， 不产生硫化氢，无动力，在半固体管内，沿穿刺线生长。
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培养基的制备
❖ 7、生理盐水的配制 ❖ 成分Nacl0.9g,蒸馏水100ml ❖ 制法一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml
蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入 500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包 扎后于121度高压灭菌15min ❖ 8、氯化钠结晶紫增菌液的配制 ❖ 成分：蛋白胨2.4g 氯化钠4.8g 0.01%结晶紫溶液0.6mL 蒸馏水 120mL pH9.0 ❖ 制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧 化钾溶液4.5mL，校正pH。加热煮沸， 过滤。再加入结晶紫溶液， 混合后分装试管。121℃高压灭菌15min
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三、实验的试剂和仪器
试剂和仪器
仪器与设备
培养基与试剂
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仪器与设备
❖
规格名称
❖
1、500ml广口瓶
❖
2、500ml三角瓶
❖
3、250ml三角瓶
❖
4、18×180mm试管
❖
5、13×100mm试管
❖
6、1ml移液管
❖
7、10ml移液管
❖
8、直径为90mm平皿
❖
9、250ml量筒
❖
10、玻璃棒
❖
11.、恒水浴箱