单核细胞增生李斯特氏菌检验操作规程

单核细胞增生李斯特氏菌测定

1 提示

1.1 注意无菌操作。

2目的

用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的测定

3检测依据

《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌测定（GB 4789.30-2016）》。

4适用范围

本法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的测定。

5试验材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

5.1冰箱。

5.2 恒温培养箱。

5.3 均质器。

5.4 显微镜。

5.5 电子天平。

5.6 锥形瓶。

5.7 无菌吸管、微量移液器及吸头。

5.8 无菌平皿。

5.9 无菌试管。

5.10 离心管。

5.11 无菌注射器。

5.12 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效标准菌株。

5.13 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效标准菌株。

5.14 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效标准菌株。

5.15 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效标准菌株。

5.16 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他产β-溶血环金

5.17 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效标准菌株。

5.18 小白鼠:ICR体重18g～22g。

5.19 全自动微生物生化鉴定系统。

6.培养基和试剂

6.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):。

6.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):。

6.3 李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2):。

6.4 1%盐酸吖啶黄(acriflavineHCl)溶液:。

6.5 1%萘啶酮酸钠盐(naladixicacid)溶液:。

6.6 PALCAM 琼脂:。

6.7 革兰氏染液:。

6.8 SIM 动力培养基:。

6.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:。

6.10 5%～8%羊血琼脂:。

6.11 糖发酵管:。

6.12 过氧化氢试剂:。

6.13 李斯特氏菌显色培养基。

6.14 生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统。

6.15 缓冲蛋白胨水:见A.11。

7检验程序

第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验

8操作步骤 8.1 増菌

以无菌操作称取样品25g(mL),放入盛有225mL LB 1增菌液无菌均质袋内,在拍击式均质器上连续均质1min ～2min 或放入盛有225mL LB 1增菌液无菌均质杯中，以8000r/min ～10000r/min 均质1min ～2min 。于30±1℃培养24h ±2h ，移取0.1ml,转种于10mlLB 2增菌液内，于30±1℃培养24h ±2h 。 8.2分离

取LB 2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM 琼脂平板, 于36℃ ±1℃培养24h ～48h ,观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈, 有些菌落有黑色凹陷; 在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征, 参照产品说明进行判定。 8.3初筛

自选择性琼脂平板上分别挑取3个～5个典 型 或 可 疑 菌 落, 分 别 接 种 木 糖、鼠李糖发酵管,于36℃±1℃ 培养2 4h ± 2h , 同时在 T S A - Y E 平板上划线, 于36℃±1℃培养18h ～24h , 然后选择木糖阴性、 鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

8.4 鉴定( 或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等)

8.4.1 染色镜检: 李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4μm ～0.5μm) ×(0.5μm ～2.0μm)；用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

8.4.2 动力试验: 挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或SIM 动力培养基,于 25℃～30℃培养48h ,李斯特氏菌有动力,在半固体或SIM 培养基上方呈伞状生长, 如伞状生长明显,可继续培养5d,

再观察结果。

8.4.3 生化鉴定: 挑取纯培养的单个可疑菌落, 进行过氧化氢酶试验, 过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和 M R - V P 试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1 。

8.4.4溶血试验: 将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为2 0个~ 2 5个小格, 挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上, 每格刺种一个菌落, 并刺种阳性对照菌( 单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌) 和阴性对照菌( 英诺克李斯特

培养2 4h ~ 4 8h , 于明亮处观察, 单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈, 斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈, 英诺克李斯特氏菌无溶血圈, 伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β- 溶血区域, 若结果不明显, 可置 4 ℃冰箱2 4h ~ 4 8h再观察。

注:也可用划线接种法。

8.4.5协同溶血试验c AM P ( 可选项目) : 在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌, 挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间, 垂直线两端不要触及平行线, 距离 1 mm~2mm, 同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌, 于3 6 ℃± 1 ℃培养2 4h ~ 4 8h 。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm 的β- 溶血增强区域, 斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域, 伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~ 1 0mm 的“箭头状”β- 溶血增强区域, 英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不明显, 可置4 ℃冰箱2 4h ~ 4 8h再观察。注: 5 %~ 8 %的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一端有溶血增强现象。