单核细胞增生李斯特氏菌检验操作规程
MMFSCNJ出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法
MM_FS_CNJ_0344出口食品单核细胞增生李斯特氏菌斜射光镜MM_FS_CNJ_0344出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法1.适用范围本方法适用于牛乳、乳制品、水产品、肉及肉制品食品。
其他食品可参照采用。
2.原理概要单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。
在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）、选择性培养基（MMA）等平板上用45°角斜射光照射可观察到蓝色菌落；水解七叶苷并与柠檬酸铁铵反应产生黑色菌落。
3.主要试剂和仪器.主要试剂（包括培养基）胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB－YE）（见B1）；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）（见B2）；增菌培养液（EB）（见B3）；选择性培养基（MMA）（见B4）；牛津琼脂（见B5）；改良缓冲蛋白胨水（MBP）（见B6）；7％羊血琼脂（见B7）；糖发酵培养基（见B8）；半固体琼脂；尿素琼脂；硝酸盐培养基；MR－VP培养基；三糖铁琼脂（TSI）。
胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）；盐酸吖啶黄素；萘啶酮酸；复达新；甘氨酸酐；氯化锂；苯乙醇；放线菌酮；多粘菌素E；头孢双硫唑甲氧；磷霉素；柠檬酸铁铵；七叶苷；酚红；D－葡萄糖；D－甘露醇；哥伦比亚琼脂；酵母浸膏；牛肉浸膏。
.仪器微生物学实验室常用设备；解剖镜；斜射灯；平面镜。
4.过程简述.样品如为冷冻食品，应于2～5℃解冻，且不超过18h，若不能及时检验，应置于－15℃保存。
非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。
.前增菌和增菌前增菌：巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品，冻肉及其它加工食品均应进行前增菌。
无菌操作称取25g样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP）的均质杯内，高速均质1～2min，制成1∶10样品匀液，转入500mL广口瓶内；液体食品可用吸管吸取25mL样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP）的广口内，充分振摇制成1∶10样品匀液，于30℃培养24、48h。
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。
为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。
本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。
实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。
2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。
3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。
4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。
5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。
生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。
若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。
2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。
若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。
3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。
若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。
结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。
(十)-单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。
1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。
1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。
2.4 显微镜:10×～100×.2。
5 电子天平:感量0。
1 g。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2。
7 无菌吸管:1 mL（具0。
01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿:直径90 mm。
2。
9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2。
10 离心管:30 mm×100 mm.2。
11 无菌注射器:1 mL。
2。
12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2。
14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3。
1 含0。
6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。
1.3。
2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
单核细胞增生李斯特氏菌及检验
单核细胞增生李斯特氏菌及检验单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的平安具有危急，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威逼人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必需加以重视。
一、生物学特性1、形态与染色该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在养分丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培育中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
2、培育特性该菌养分要求不高，在20--25℃培育有动力，穿刺培育25天可见倒立伞状生长，肉汤培育物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培育温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.84.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培育基上，菌落初始很小，透亮，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透亮。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培育后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照耀菌落，通过解剖镜垂直观看，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
3、生化反应该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
新版单核细胞增生李斯特氏菌的测定1
一、编制目的为规范本单位单核细胞增李斯特氏菌的检验方法，编制本指导书。
二、适用范围本指导书规定了食品单核细胞增李斯特氏菌的检验方法。
第一法适用于食品中单核细胞增李斯特氏菌的定性检验；第二法适用于单核细胞增李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增李斯特氏菌的计数；第三法适用于单核细胞增李斯特氏菌含量较低（<100CFU/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增李斯特氏菌的计数，特别是牛奶、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品。
三、编制依据GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。
四、设备和材料4.1冰箱:2℃一5℃。
4.2恒温培养箱:30℃±1℃ , 36℃士1℃。
4.3均质器。
4.4显微镜:lOX一100X。
4.5电了天平:感量0.1 g。
4.6锥形瓶:100mL、500mL。
4.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
4.8无菌平皿:直径90mm。
4.9无菌试管:16mm×160mm。
4.10离心管:30mm×100mm。
4.11无菌注射器:1mL。
4.12金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。
4.13马红球菌(Rhodococcus equi)。
4.14小白鼠:16g-18g。
4.15全自动微生物生化鉴定系统。
五、培养基和试剂5.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)。
5.2含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆琼脂(TSA-YE)。
5.3李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2)。
5.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl)溶液。
5.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid)溶液。
5.6 PALCAM琼脂。
5.7革兰氏染液。
5.8 SIM动力培养基。
5.9缓冲葡萄糖蛋白陈水（甲基红(MR)和V-P试验用）。
5.10 5%-8%羊血琼脂。
5.11糖发酵管。
5.12过氧化氢试剂。
单增李斯特氏菌及其检测方法
单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。
李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。
其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。
它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。
LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。
在血琼脂平板上有β溶血环。
在显色培养基上呈蓝绿色。
2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。
⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。
3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。
单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则
单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则1、目的根据《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验进行单核细胞增生李斯特氏菌检验。
2、适用范围适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。
3、职责检测人员负责按照本规程对被测样品进行检测；校核人员负责对检测操作人员是否规范以及检测结果是否准确进行审核；授权签字人负责综合管理和检测报告的签发。
4、试剂及器材4.1 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株4.2 马红球菌4.3 小白鼠：16-18g4.4 TSB-YE4.5 TSA-YE4.6 EB增菌液4.7 李氏增菌液（LB1，LB2）4.8 三糖铁琼脂4.9SIM动力培养基4.10 琼脂4.11 改良的Mc Bride琼脂（MMA）4.12 硝酸盐培养基4.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水4.14 糖发酵培养基4.15 过氧化氢4.16 1%盐酸丫啶黄溶液4.17 1%萘啶酮酸盐溶液5、仪器设备5.1 恒温培养箱：30±1℃、24℃±1℃5.2 恒温水浴锅：46±1℃5.3 离心机：4000r/min5.4 显微镜5.5 均质器6、检测步骤6.1样品的收集及处理：无菌取样25g（ml）放灭菌均质器中加225mlEB和LB1增菌液中，充分搅拌成均质。
如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。
6.2增菌培养：EB增菌液30℃培养48小时，LB1增菌液225ml放30℃培养24小时，吸取0.1ml，加入10ml LB2增菌液中二次增菌。
6.3分离培养：将EB增菌液和LB2二次增菌分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30℃48小时，挑选可疑菌落，用白织灯45。
角斜光照射平板。
6.4选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁琼脂和SIM动力培养基，培养于25℃。
一般观察2天-7天，阳性者可做下一步鉴定。
6.5纯培养：将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于TSA-YE上纯培养，做以下鉴定。
李斯特氏菌检验指导书
一、适用范围：本方法参照SN0184-93的标准。
适用于出口水产品中单增李斯特氏菌的检验二、原理:单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。
它能引起人畜的李氏病，感染后，主要表现为败血症，脑膜炎和单核细胞增多。
在牛津琼脂（OX A）平板上可观察到黑色菌落，在血平板上观察到窄小通明的 型溶血环。
显微镜镜下可观察到典型的运动镜检。
三、设备和材料显微镜：1600倍双目光源镜恒温培养箱：36±1℃灭菌吸管：1.0 ml 10.0 ml灭菌试管：10.0 ml灭菌平皿\酒精灯\ 玻片\盖玻片\玻璃棒\药匙\接种环\接种针广口瓶：500 ml 锥形瓶：100ml四、培养基和试剂的配制（A）盐酸吖啶黄溶液精确称取盐酸吖啶黄素40mg溶于10ml的蒸馏水，摇匀，充分溶解，高压灭菌。
（B）萘啶酮酸溶液精确称取40mg萘啶酮酸溶于10ml的0.05mol/L氢氧化钠溶液，振摇均匀，充分溶解，高压灭菌后备用。
（C）0.05 mol /L氢氧化钠溶液精确称取0.1g氢氧化钠溶于50ml灭菌蒸馏水，振摇均匀，充分溶解，备用。
（D）缓冲蛋白胨水精确称取4.5g (±0.1 g)BPW,倒入500 ml锥形瓶中加入275ml蒸馏水搅拌均匀,静置10min，加热煮沸至完全溶解后注入500ml的广口瓶中，高压灭菌后冰箱备用。
（E）改良缓冲蛋白胨将已灭菌过的缓冲蛋白胨水每225ml加盐酸吖啶黄溶液1.8ml。
萘啶酮酸溶液1.1 ml，振摇均匀，备用。
（F）Fraser培养基精确称取的Fraser肉汤，用灭菌蒸馏水定容于10 0 ml的锥形瓶中，加热至完全溶解后，分装于10 ml的试管中，于121℃的高压灭菌15min后备用。
（每100 ml Fraser肉汤加1.7 ml吖啶黄溶液，加0.5 ml萘啶酮酸溶液）。
（G）牛津琼脂（OXA）准确称取6.0g的牛津琼脂用灭菌蒸馏水定容于100 ml的锥形瓶中，摇匀，加热至完全溶解，于121℃的高压灭菌15min，冷却至50-60℃加吖啶黄溶液及萘啶酮酸溶液各1.0ml摇匀，迅速倒入8-10个平皿，存入冰箱备用。
单增李斯特氏菌检测详解
鉴定
血清学检验 菌悬液于80℃水域中加热1h，离心弃上清， 剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清 学玻片凝集试验。
单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B， 1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C， 4D，4E，7
质量控制
每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株 进行质量控制。 样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中 加入新鲜配制的每毫升含有10个～100个单 核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性 培养物，按检验程序进行同步检验。
＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － － ＋/ 产酸， ＋ ＋ ＋ － V － ＋ 不产H2S
＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － － ＋/ 产酸， ＋ ＋ ＋ － V ＋ ＋ 不产H2S
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋/ 产酸， ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ 不产H2S
＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － － ＋/ 产酸， ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ 不产H2S
李斯特氏菌
特征格氏Biblioteka 斯 英诺克李斯 特氏菌 特氏菌β -溶血
－
－
CAMP
－
－
(Staphylococcus
aureus)
CAMP
－
－
(Rhodococcus
equi)
甘露醇
＋
－
α甲基-D－甘 ND
＋
露糖苷
L-鼠李糖
－
d
可溶性淀粉
＋
－
D-木糖
－
－
马尿酸盐水解 －
＋
硝酸盐还原
－
－
小鼠致病力 －
－
绵羊李斯特 氏菌
非冷冻的易腐样品：尽可能及时检验，若不能 及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检 验。
李斯特氏菌检验
对小鼠的致病力试验： 取0.5ml的1010cfu/ml的浓缩菌液注射小 白鼠腹腔3-5只，致病株于3-5日内死亡。单 核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌 对小鼠有致病性。
研究表明，只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特 氏菌症（listeriosis）相关。
概述
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后 主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。易感人群主要为孕妇、 老人、新生儿和免疫缺陷人群。大多数发达国家人类李斯特 菌病发生率约为每一百万人2-15例，死亡率为13%-34%。
+ + + -
鉴定-溶血试验
将羊血琼脂平板底面划分小格，从TSA-YE 上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一 个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特菌 和绵羊利斯特菌)和阴性对照菌(英诺克李斯 特菌)，于35℃培养24h-48h，穿刺时尽量接 近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂 破裂。 于明亮处观察，单增和斯氏在刺种 点周围产生狭小的透明溶血环，无害无溶 血环，伊氏产生大的透明溶血环。
种的生化特征见下表：
溶血 反应 硝酸 盐 还原 尿素 酶 甘露 醇 菌 种 MR/VP 鼠李糖 木糖
单核细胞增生李斯
特氏菌 绵羊李斯特氏菌 英诺克李斯特氏菌 威尔斯李斯特氏菌 西尔李斯特氏菌 格氏李斯特氏菌 默尔李斯特氏菌
+
+ + -
+
-
+/+
+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法
二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
※初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、
鼠李糖发酵管，于36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于 36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续 进行鉴定。
04
一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※生化特征 ※单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）37 ℃、24 h培养,可以 分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水杨苷、鼠李糖，产酸不产气；不分解棉 子糖、肌醇、菊淀粉、卫茅醇、侧金盏花醇、木糖和甘露醇。MR和VP 试验阳性，不产生靛基质，硫化氢阴性。
※ 确认实验-鉴定 ：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试 验cAMP(可选项目)
04
三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※典型菌落计数以及对应的计算公式的应用 ※计数范围要求：选择有典型菌落的平板，菌落数合计在15 CFU~150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。 ※计算公式1计算公式2.
04
三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※样品的接种 ※根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀 液(液体样品可包括原液)，每个稀释度的样品匀液分别吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板，用 无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。
※小鼠毒力试验(可选项目)
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二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
单增李斯特菌PFGE快速分子分型实验室标准操作程序
单增李斯特菌PFGE分型实验室标准操作程序生物安全警示：目前李斯特菌感染剂量尚不确定，取决于宿主的易感性。
高风险感染群体为孕妇、婴儿、免疫力低下病人和老人。
所以，接触李斯特菌的实验人员必须意识到潜在的风险并且注意相关的建议。
Day 0受试培养物单菌落划线于脑心浸液平板，于37℃培养14-18 h。
建议利用螺口管保存菌种一支，并且用同一接种环划线平板。
确保需要时可以对同一培养物进行试验。
Day 11.开启水浴摇床（54-55℃）、水浴箱（55-60℃）和分光光度计。
2.准备TE buffer（10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0），配方如下：10 ml 1 M Tris，pH 8.0，2 mL 0.5 M EDTA，pH 8.0，稀释于1000 mL无菌超纯水（临床实验室试剂用水）。
注意：TE buffer用于SeaKem 琼脂糖胶栓制备、悬浮细胞和洗涤裂解的PFGE胶栓。
3.准备溶菌酶（sigma L7651）母液（20 mg/mL），配方如下：a.称量100 mg溶菌酶（器皿放置于冰上保持低温）b.加入5 mL TE buffer，涡旋混合。
c.分装（250 μL）于eppendorf管中，冷冻备用。
4.TE buffer (10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0)制备1% SeaKem 金琼脂糖+1%SDS，配方如下：a.20% SDS储液置于55-60℃水浴箱预热；b.称取0.25 g SeaKem 金琼脂糖，加入25 ml TE buffer，温和混匀，微波加热至完全溶解；c.加入2.5 ml 10% SDS，混匀，置于55-60℃水浴箱中备用。
5.将培养物编号标记于Falcon2054管，吸取2 mL TE buffer于管中，用灭菌棉签或接种环刮去培养物，轻轻转动接种环（棉签）将培养物悬浮于TE buffer 中，尽量避免产生气泡。
注意：细胞悬浮液体积大小取决于细胞浊度测定仪的使用体积。
水产食品公司实验室出口食品单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法
水产食品公司实验室出口食品单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法1．仪器和设备1．1恒温培养箱：36±1℃1．2恒温水浴箱：45±1℃1．3高压灭菌锅1．4均质器1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm1．7锥形瓶:500ml 250ml1．8平皿：直径为90mm1．9灭菌吸管1．10灭菌均质杯1．11酒精棉1．12天平:感量0.1g2．培养基的制备2．1含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE）称取3.6g药品溶入100ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，冷却后0～4℃冰箱保存备用。
2.2含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE）称取4.7g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却50℃左右倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.3 Fraser肉汤增菌液（FB1、FB2）FB1：称取12.38g药品溶入225ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入FB1添加剂1和添加剂2各1支备用。
FB2：称取1.1g药品溶入20ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入FB2添加剂1和添加剂2各1支备用。
2.4 PALCAM琼脂称取6.61g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入PALCAM添加剂1和添加剂2各0.4ml，倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.5 OXA琼脂称取5.85g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入吖啶黄素、放线菌酮、多粘菌素E各1支，倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.6 7％羊血琼脂2.7 SIM动力培养基称取3.0g药品溶入100ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，制成高层斜面，冷却后0～4℃冰箱保存备用。
DB22T 1607-2012 化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测
0.25 g 100 mL
5.0 g 100 mL
A.1.5.2 成份 将柠檬酸铁（Ⅲ）铵溶于水中，过滤除菌。
A.1.6 全培养基 A.1.6.1 成份
不得翻印
基本成份（A.1.1）
本 氯化锂溶液（A.1.2） 标 萘啶酸钠溶液（A.1.3） 准 吖啶黄盐酸盐（A.1.4） 仅 柠檬酸铁（Ⅲ）铵溶液（A.1.5）
ICS 65.020.30 B 40 备案号：35741-2013
DB22
吉 本标林准仅供省内部地使用
方
标准
DB 22/T 1607—2012
化妆品中单核细胞增生李斯不特得氏翻菌检印测
Detection of listeria monocytogenes in cosmetics
本标准仅供内部使用 不得翻印
仅 见A.1.4 供 A.2.3 柠檬酸铁（Ⅲ）铵溶液
内部 见A.1.5 使用 A.2.4 全培养基
使用前，在各个试管（10 ml）分别加0.1 mlA.2.2溶液和A.2.3溶液，缓缓混合均匀。
不得 A.3 牛津琼脂（Oxford琼脂） 翻印 A.3.1 琼脂基础
A.3.1.1 成份
哥伦比亚琼脂
本 七叶苷 标 柠檬酸铁（Ⅲ）铵 准 氯化锂 仅 水
不得翻 5.0 g 印 5.0 g
5.0 g 5.0 g 20.0 g 12.0 g 1.35 g 1.0 g 3.0 g 0.02 g
6
DB22/T 1607—2012
水
1000 mL
A.2.1.2 制备
本 将以上组份加热溶解，调节pH值至7.2～7.4，分装，121℃高压灭菌15 min。 标准 A.2.2 盐酸吖啶黄溶液
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单核细胞增生李斯特氏菌测定1 提示1.1 注意无菌操作。
2目的用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的测定3检测依据《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌测定（GB 4789.30-2016）》。
4适用范围本法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的测定。
5试验材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1冰箱。
5.2 恒温培养箱。
5.3 均质器。
5.4 显微镜。
5.5 电子天平。
5.6 锥形瓶。
5.7 无菌吸管、微量移液器及吸头。
5.8 无菌平皿。
5.9 无菌试管。
5.10 离心管。
5.11 无菌注射器。
5.12 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效标准菌株。
5.13 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效标准菌株。
5.14 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效标准菌株。
5.15 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效标准菌株。
5.16 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他产β-溶血环金5.17 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效标准菌株。
5.18 小白鼠:ICR体重18g～22g。
5.19 全自动微生物生化鉴定系统。
6.培养基和试剂6.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):。
6.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):。
6.3 李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2):。
6.4 1%盐酸吖啶黄(acriflavineHCl)溶液:。
6.5 1%萘啶酮酸钠盐(naladixicacid)溶液:。
6.6 PALCAM 琼脂:。
6.7 革兰氏染液:。
6.8 SIM 动力培养基:。
6.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:。
6.10 5%～8%羊血琼脂:。
6.11 糖发酵管:。
6.12 过氧化氢试剂:。
6.13 李斯特氏菌显色培养基。
6.14 生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统。
6.15 缓冲蛋白胨水:见A.11。
7检验程序第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验8操作步骤 8.1 増菌以无菌操作称取样品25g(mL),放入盛有225mL LB 1增菌液无菌均质袋内,在拍击式均质器上连续均质1min ～2min 或放入盛有225mL LB 1增菌液无菌均质杯中，以8000r/min ～10000r/min 均质1min ～2min 。
于30±1℃培养24h ±2h ，移取0.1ml,转种于10mlLB 2增菌液内，于30±1℃培养24h ±2h 。
8.2分离取LB 2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM 琼脂平板, 于36℃ ±1℃培养24h ～48h ,观察各个平板上生长的菌落。
典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈, 有些菌落有黑色凹陷; 在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征, 参照产品说明进行判定。
8.3初筛自选择性琼脂平板上分别挑取3个～5个典 型 或 可 疑 菌 落, 分 别 接 种 木 糖、鼠李糖发酵管,于36℃±1℃ 培养2 4h ± 2h , 同时在 T S A - Y E 平板上划线, 于36℃±1℃培养18h ～24h , 然后选择木糖阴性、 鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
8.4 鉴定( 或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等)8.4.1 染色镜检: 李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4μm ～0.5μm) ×(0.5μm ～2.0μm)；用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
8.4.2 动力试验: 挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或SIM 动力培养基,于 25℃～30℃培养48h ,李斯特氏菌有动力,在半固体或SIM 培养基上方呈伞状生长, 如伞状生长明显,可继续培养5d,再观察结果。
8.4.3 生化鉴定: 挑取纯培养的单个可疑菌落, 进行过氧化氢酶试验, 过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和 M R - V P 试验。
单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1 。
8.4.4溶血试验: 将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为2 0个~ 2 5个小格, 挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上, 每格刺种一个菌落, 并刺种阳性对照菌( 单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌) 和阴性对照菌( 英诺克李斯特培养2 4h ~ 4 8h , 于明亮处观察, 单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈, 斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈, 英诺克李斯特氏菌无溶血圈, 伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β- 溶血区域, 若结果不明显, 可置 4 ℃冰箱2 4h ~ 4 8h再观察。
注:也可用划线接种法。
8.4.5协同溶血试验c AM P ( 可选项目) : 在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌, 挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间, 垂直线两端不要触及平行线, 距离 1 mm~2mm, 同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌, 于3 6 ℃± 1 ℃培养2 4h ~ 4 8h 。
单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm 的β- 溶血增强区域, 斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域, 伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~ 1 0mm 的“箭头状”β- 溶血增强区域, 英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。
若结果不明显, 可置4 ℃冰箱2 4h ~ 4 8h再观察。
注: 5 %~ 8 %的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一端有溶血增强现象。
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，于30℃±1℃培养24 h，4000 r/min 离心5 min，弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为10CFU/mL 的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只～5只，每只0.5 mL，观察小鼠死亡情况。
致病株于2 d～5 d 内死亡。
试验时可用已知菌作对照。
单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。
9.结果与报告综合以上生化试验和溶血试验结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。
第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法10检验程序10.1样品的稀释10.1.1以无菌操作称取样品25g(mL) , 放入盛225mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB 肉汤的无菌均质袋内( 或均质杯) 内, 在拍击式均质器上连续均质1m i n ~ 2m i n或以8 0 0 0 r / m i n ~ 1 0 0 0 0 r / m i n均质1m i n ~ 2m i n 。
液体样品, 振荡混匀, 制成1:10的样品匀液。
10.1.2用1m L 无菌吸管或微量移液器吸取1 ∶1 0样品匀液1m L , 沿管壁缓慢注于盛有9 m L 缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B 肉汤的无菌试管中( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释10 .1 . 3 按7 . 1 . 2操作程序, 制备1 0倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次, 换用1支1m L 无菌吸管或吸头。
10. 2 样品的接种根据对样品污染状况的估计, 选择2个~ 3个适宜连续稀释度的样品匀液( 液体样品可包括原液) ,每个稀释度的样品匀液分别吸取1m L 以0 . 3m L 、0 . 3m L 、0 .4 m L 的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板, 用无菌L 棒涂布整个平板, 注意不要触及平板边缘。
使用前, 如琼脂平板表面有水珠, 可放在25 ℃~ 5 0 ℃的培养箱里干燥, 直到平板表面的水珠消失。
10. 3 培养10 .3 . 1 在通常情况下, 涂布后, 将平板静置1 0m i n , 如样液不易吸收, 可将平板放在培养箱3 6 ℃±1 ℃培养1h ; 等样品匀液吸收后翻转平皿, 倒置于培养箱, 3 6 ℃±1 ℃培养2 4h ~ 4 8h 。
10 . 4 典型菌落计数和确认10. 4 . 1 单核细胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准。
10. 4 . 2 选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板, 且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在1 5C F U~ 1 5 0C F U 之间的平板, 计数典型菌落数。
如果:a ) 只有一个稀释度的平板菌落数在1 5C F U~ 1 5 0C F U 之间且有典型菌落, 计数该稀释度平板上的典型菌落;b ) 所有稀释度的平板菌落数均小于1 5C F U 且有典型菌落, 应计数最低稀释度平板上的典型菌落;c ) 某一稀释度的平板菌落数大于1 5 0C F U 且有典型菌落, 但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;d ) 所有稀释度的平板菌落数大于1 5 0C F U 且有典型菌落, 应计数最高稀释度平板上的典型菌落;e ) 所有稀释度的平板菌落数均不在1 5C F U~ 1 5 0C F U 之间且有典型菌落, 其中一部分小于1 5C F U 或大于1 5 0C F U 时, 应计数最接近1 5C F U 或1 5 0C F U 的稀释度平板上的典型菌落。
以上按式( 1 ) 计算。
f ) 2个连续稀释度的平板菌落数均在1 5C F U~ 1 5 0C F U 之间, 按式( 2 ) 计算。
7 .4 . 3 从典型菌落中任选5个菌落( 小于5 个全选) , 分别按5 . 3 、5 . 4进行鉴定。
11结果计数T =A BC d…………………………( 1 )式中:T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A ———某一稀释度典型菌落的总数;B ———某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C ———某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;d ———稀释因子。
T =A1 B1 / C1 +A2 B2 / C21 . 1 d…………………………( 2 )式中:T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A1 ———第一稀释度( 低稀释倍数) 典型菌落的总数;B1 ———第一稀释度( 低稀释倍数) 确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数; C1 ———第一稀释度( 低稀释倍数) 用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;A2 ———第二稀释度( 高稀释倍数) 典型菌落的总数;B2 ———第二稀释度( 高稀释倍数) 确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数; C2 ———第二稀释度( 高稀释倍数) 用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;1 . 1 ———计算系数;d ———稀释因子( 第一稀释度) 。