第二章 植物组织培养的基本技术与设施
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植物组织培养设备及条件
光照设备：提供植物生 长所需的光照
温度控制系统：控制培 养箱内的温度，保持恒
定
培养基制备设备：制备 培养基，包括培养基的
配制、灭菌等
灭菌设备
高压灭菌 锅：用于 培养基、 器皿、工 具等灭菌
紫外灯： 用于培养 室、操作 台等空间 灭菌
酒精灯： 用于培养 基、器皿、 工具等灭 菌
超净工作 台：用于 培养基、 器皿、工 具等灭菌
培养环境控制
温度：植物组织 培养的最佳温度 为25-30℃
光照：植物组织 培养的光照强度 为2000-3000勒 克斯
湿度：植物组织 培养的湿度为7080%
气体：植物组织 培养的气体成分 为氧气和二氧
恒温培养箱：提供稳定的温度条件，保证 植物组织的正常生长
显微镜：观察植物组织的生长和发育情 况，进行细胞学研究
培养设备
培养箱：提供稳定的温度、 湿度和光照条件
气体交换设备：提供植物 生长所需的氧气和二氧化
碳
湿度控制系统：控制培养 箱内的湿度，保持恒定
培养瓶：用于培养植物 组织，包括培养基、培
养液等
植物组织培养设备及条件
汇报人：
植物组织培养设备 植物组织培养条件
植物组织培养设备
实验室设备
培养箱：用于培养植物组织，提供适宜的 温度、湿度和光照条件
超净工作台：提供无菌环境，防止植物 组织受到污染和感染
光照培养箱：提供光照条件，促进植物 组织的生长和发育
离心机：用于分离植物组织中的细胞和 细胞器，提高培养效率
培养条件
温度：植物组织培养的温度一般在20-30℃之间，不同植物种类和培养阶段对温度的要求不同。
光照：植物组织培养的光照强度和光照时间对植物生长和分化有重要影响，一般采用人工光源 进行光照。
第2章植物组织培养的设备与培养条件
试管——特别适合于用少量培养基及试验各种不同配方 时选用，在茎尖培养及花药和单子叶植物分化长苗培 养时更显方便。有圆底的和平底的两种。 三角瓶——是植物组织培养中最常用的培养器皿，适合 于各种培养，固体或液体、大规模或小规模都行。 其优点是：采光好、瓶口较小不易失水和污染。 L形管和T形管——为专用的旋转式液体培养试管。 培养皿——适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培 养和无菌发芽。 角形培养瓶和圆形培养瓶——适于液体培养用。 果酱瓶或罐头瓶——常用于试管苗大量繁殖，200ml500ml规格 太空玻璃杯——可机械化洗瓶，适于工厂化生产
（3）磨口瓶 用于存装试剂、分装母液。 （4）滴瓶 盛装酸液（1N盐酸和1N氢氧化钠） （5）锅具：配置和熬制培养基
2.2.1.3计量容器 （1）容量瓶：培养基配置时定容 （2）移液管和移液枪 （3）量筒、量杯
2.2.2器械用具 组织培养所需要的器械用具，可选 用医疗器械和微生物实验所用的 器具。常用的器械用具如图： （1）镊子：可用于接种和转移植 物材料 （2）剪刀：一般在转移植株时用。 （3）解剖刀： （4）显微接种工具：包括接种针、 接种钩及接种铲，用来接种花药 或转移植物组织。
（1）功能：植物材料的灭菌、接种以及培养 物的继代转接等。 （2）仪器设备及用品： 超净工作台，紫外灯、小推车、搁架、接种 工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通 剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌 过滤器等），紫外灯，换气扇，空调。
超净工作台
接种工具
无菌操作室消毒的方法： 照射灭菌： 紫外灯， 15—20分钟（接种前） 熏蒸灭菌 ：甲醛加高锰酸钾（定期）（一般 每立方米用甲醛2mL、高锰酸钾1g。 ） 超净工作台的消毒方法： 每次接种前，用70%酒精药棉擦拭台面。
第二章——植物组织培养实验室
（1）鉴定室 细胞学鉴定室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研 究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和 灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中， 应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成 分随时进行取样检查。 离心机、酶联免疫检测仪、天平、 PCR仪等。
D、金属用品洗涤
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水 洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。
E、除菌过滤器
除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后 用蒸馏水冲洗，晾干备用
（二）灭菌技术
1.灭菌工作是极其重要的。
首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴： 有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、 超净工作台的台面，未处理的工具和手等。 无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）如：火烤后的物体；
（二）药品贮存和配制仪器设备
1.冰箱 • 作用：低温保存材料，存放药品、
培养基母液、激素、酶制剂。
2.天平
• 陈列于制备室中 • 作用：称取大量元素、微量元素、
酶制剂
3.酸度计
• 陈列于制备室中 • 作用：测定培养基及酶制剂的pH值
PHS-802中文台式酸度计
通用型或经济型酸度计
（三）观察分析仪器设备
5.摇床和旋转床
• 进行液体培养时用以改善气体状况
小型臭氧发生器
不锈钢蒸馏水器（单蒸水）
三、玻璃器皿及用具
（一）玻璃器皿 1.培养器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等 2.分注器 类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、
量筒漏斗式分注器 3.其他玻璃仪器 烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等
D、金属用品洗涤
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水 洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。
E、除菌过滤器
除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后 用蒸馏水冲洗，晾干备用
（二）灭菌技术
1.灭菌工作是极其重要的。
首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴： 有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、 超净工作台的台面，未处理的工具和手等。 无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）如：火烤后的物体；
（二）药品贮存和配制仪器设备
1.冰箱 • 作用：低温保存材料，存放药品、
培养基母液、激素、酶制剂。
2.天平
• 陈列于制备室中 • 作用：称取大量元素、微量元素、
酶制剂
3.酸度计
• 陈列于制备室中 • 作用：测定培养基及酶制剂的pH值
PHS-802中文台式酸度计
通用型或经济型酸度计
（三）观察分析仪器设备
5.摇床和旋转床
• 进行液体培养时用以改善气体状况
小型臭氧发生器
不锈钢蒸馏水器（单蒸水）
三、玻璃器皿及用具
（一）玻璃器皿 1.培养器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等 2.分注器 类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、
量筒漏斗式分注器 3.其他玻璃仪器 烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等
植物组织培养复习笔记【最新】
植物组织培养复习资料第一章绪论一、概念：植物组织培养：在无菌条件下，将离体的植物器官.组织，细胞以及原生质体. 培养在人1:培养基上和人工控制的环境中，使其生长，分化，增殖，甚至长出新的植株的过程和技术。
外植体：在无菌条件下，离体培养于人工培养基上的，用于达到某种培养目的的原始植物材料C培养基：根据植物营养原理和植物组织离体培养的要求而人匚配制的营养基质即为培养基。
细胞全能性：植物体每一个细胞都含有该植物全部的遗传信息，在合适的条件下，具有形成完整植株的能力。
脱分化：一个成熟细胞恢复到分生状态或胚性细胞状态的现象。
再分化：是脱分化细胞重新恢复细胞分化能力，沿若正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞C二、组织培养的类型，不同分类依据（根据培养材料不同）可分为植株培养，胚胎培养，器官培养，组织或愈伤组织培养.细胞或原生质休培养5类：（根据培养目的）可分为试管嫁接，试管受精，试管加倍，试管育种等：（根据培养方法）可分为平板培养，微室培养，悬浮培养，单细胞培养等：（根据培养过程）可分为初代培养和继代培养：（根据培养基类型）可分为固体培养和液体培养。
三、三个发展阶段的关键人物1,haberlandt-一于1902年提出植物细胞全能性理论，被称为“组织培养之父”。
2,white—于1943年出版《植物组织培养手册》。
3,murashine和skoog -- 在1962年筛选出MS培养基。
四、植物全能性表达的过程培养一►脱分彳~再分化一培养五、组织培养的特点：1、植物基础学科研究的良好系统。
2、生物技术的基础。
3、经济高效.管理方便，利于自动化。
4、技术含量高，实验误差小，人工控制能力强。
5、生长周期短，生长速度快，实验重复性好。
6、实验材料经济，来源单一。
六、缺点：需要设备负复柴，投入资金多，电能消耗大：对人员技术水平要求高，对实验场所要求也高，不能代替田间试验。
第二章植物组织培养设备与培养条件一、实验室的组成及主要仪器和设备准备室：干燥箱，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，水浴锅，冰箱。
第二章 植物组织培养基本技术
5.天然有机附加物：如椰汁、香蕉汁、马铃 薯汁、酵母提取液等。
（四）植物生长调节剂： 1、生长素类： （1）组培中的作用： ①促进细胞伸长； ②促进生根； ③诱导愈伤组织的形成； ④2,4-D会诱导某些植物不定胚的形成。
（2）常用的生长素：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸 （IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸 （2,4-D）
2、微量元素：指小于0.5mmol／L的元素，包括
Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Co等。
Fe：常用FeSO4·7H20，因其在pH值5.2以上，易形 成Fe(OH)3的不溶性沉淀，通常FeSO4·7H20 和 Na2—EDTA结合成络合物使用。
B：H3BO3 Mn，Cu，Zn：常用其硫酸盐；
Mo：Na2MoO4 Co: CoCl2
含量较高 （2）适用范围：广泛地用于植物的器官、花
药、细胞和原生质体培养
2.White培养基：其特点是无机机盐数量较低，适用
于生根培养，胚胎培养及一般的组织培养也可以
用，应用较广泛。
3.B5培养基：其主要特点是含有较低的铵，较高的 硝酸盐和VB1，铵对植物的生长有抑制作用。木本 植物尤其适宜在B5培养基上生长。
褐的作用。
3.氨基酸：
培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸， 其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬 氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时 应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，用量在101000mg／L之间。
4.肌醇：使用浓度一般为50~l00mg／L，适 当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及 胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、 分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作 用。
第二章 植物组织培养的 基本技术
第一节 培养基及其配制
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作
c.不少培养基颜色加深。 d.体积和浓度有所变化。 e.营养成分有时受到破坏。
3、不耐高温材料的灭菌：
采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天然有机 添加物等。
4、外植体的表面灭菌：
采用70－75％乙醇（10-30秒）、有 效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1 －0.2%的氯化汞（2-15分钟）等杀菌剂 中加入几滴吐温－20或80（Tween－20 或80）效果较好。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙 醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：
采用高压蒸汽灭菌。120℃ 15－20 分钟。
培养基体积越大，灭菌时间越长。
高温高压灭菌对培养基成分的影响： a.pH值普遍下降。 b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反
应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生 磷酸钙沉淀。
166
MgSO4·7H2O
185
KH2PO4
400
(NH4)2SO4
463
KI
0.8
H3BO3
1.6
MnSO4·4H2O
4.4
ZnSO4·7H2O
1.5
组成成分 Na2－EDTA FeSO4·7H2O 蔗糖
pH
烟酸 盐酸吡哆醇 甘氨酸 盐酸硫铵
(mg/l) 37.3 27.8 50 5.8 0.5 0.5 2.0 1.0
大量元素中的氮通常采用硝态氮 或铵态氮，但铵态氮浓度过高会对 有些植物的培养物造成伤害，不适 宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸、 丝氨酸等来代替。
2、微量元素：
植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如 造成蛋白质变性、酶失活,代谢障碍等。
各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白 质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成； 锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的 重要元素。
3、不耐高温材料的灭菌：
采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天然有机 添加物等。
4、外植体的表面灭菌：
采用70－75％乙醇（10-30秒）、有 效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1 －0.2%的氯化汞（2-15分钟）等杀菌剂 中加入几滴吐温－20或80（Tween－20 或80）效果较好。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙 醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：
采用高压蒸汽灭菌。120℃ 15－20 分钟。
培养基体积越大，灭菌时间越长。
高温高压灭菌对培养基成分的影响： a.pH值普遍下降。 b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反
应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生 磷酸钙沉淀。
166
MgSO4·7H2O
185
KH2PO4
400
(NH4)2SO4
463
KI
0.8
H3BO3
1.6
MnSO4·4H2O
4.4
ZnSO4·7H2O
1.5
组成成分 Na2－EDTA FeSO4·7H2O 蔗糖
pH
烟酸 盐酸吡哆醇 甘氨酸 盐酸硫铵
(mg/l) 37.3 27.8 50 5.8 0.5 0.5 2.0 1.0
大量元素中的氮通常采用硝态氮 或铵态氮，但铵态氮浓度过高会对 有些植物的培养物造成伤害，不适 宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸、 丝氨酸等来代替。
2、微量元素：
植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如 造成蛋白质变性、酶失活,代谢障碍等。
各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白 质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成； 锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的 重要元素。
植物组织培养(全)
(3)胚培养
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
植物组织培养第二章
（三）Байду номын сангаас细胞胚胎发生的基因表达机理（略）
二、植物体细胞胚胎发生途径
（一）体细胞胚胎发生的方式 由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种： 直接途径和间接途径。 直接途径：从外植体某些部位的胚性细胞直接 诱导分化出体细胞胚胎。这种“胚性细胞”是在胚 胎发生之前就已决定了的。 间接途径：外植体先脱分化形成愈伤组织， 在从愈伤组织的某些细胞，即重新决定为胚性细胞 的细胞分化出体细胞胚胎，多数体细胞胚胎的形成 是通过间接途径产生的。
植物愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下，形成 外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长 和发育的一门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植 体形成愈伤组织，标志着植物离体培养的开始。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化 后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。 潜在全能性的原因：基因表达的选择性
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一 定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就 可能表现出全能性，发育成完整的植株。 人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。
三、植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离
体细胞胚胎具有两个明显特点： 1、双极性 2、与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为 孤立的状态，即存在生理隔离。
（一）体细胞胚胎发生的极性
单个胚性细胞与合子胚一样，具有明显的极性，第一次 分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基 细胞进行少数几次分裂形成胚柄。 （二）体细胞胚胎发生的生理隔离
第二章
植物组织培养的基本原理
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核 心理论。 离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的 基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细 胞经历脱分化和再分化过程
植物组织培养
一些变态茎、叶器官，离体培养易于形成相应的变 态器官。
②影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种
类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不 能使所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物种类再分化的能力差异较大（遗传背景）； （2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。
有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物
及裸子植物容易。
4、愈伤组织（Callus）培养
①愈伤组织生长过程
在脱分化的过程中，多形成Callus, 其细胞结构无明 显极性。
• （1）诱导期：细胞准备进行分裂， 细胞大小几乎不变，
生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。
• （2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成
小芯。细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。在原培养 基上，细胞会发生分化，及时转移，其可无限制地进行细 胞分裂，维持不分化状态。
• （3）分化期：细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能
各异的细胞。
②愈伤组织的生长特性
（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在受伤 组织表面形成一层愈伤组织， Callus的细胞数目迅速增 多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可 以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
组织培养的奠基人
细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离 体再生的基础。
②影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种
类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不 能使所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物种类再分化的能力差异较大（遗传背景）； （2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。
有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物
及裸子植物容易。
4、愈伤组织（Callus）培养
①愈伤组织生长过程
在脱分化的过程中，多形成Callus, 其细胞结构无明 显极性。
• （1）诱导期：细胞准备进行分裂， 细胞大小几乎不变，
生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。
• （2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成
小芯。细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。在原培养 基上，细胞会发生分化，及时转移，其可无限制地进行细 胞分裂，维持不分化状态。
• （3）分化期：细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能
各异的细胞。
②愈伤组织的生长特性
（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在受伤 组织表面形成一层愈伤组织， Callus的细胞数目迅速增 多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可 以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
组织培养的奠基人
细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离 体再生的基础。
植物组织培养的基本技术
植物组织培养的基本技术《植物组织培养的奇妙世界》嘿，朋友们！今天来和大家聊聊植物组织培养这神奇的事儿。
咱先说说这植物组织培养的第一步呀，那就是选材。
就好比咱做饭得先挑好食材一样，这植物组织培养也得选对“料”。
要找那些健康的、活力满满的植物部分，比如一小段茎呀，或者一片叶子啥的。
可别小看这一步，选得好那后面的事儿就顺溜多啦。
然后呢，就是给这些选好的材料来个“大清洁”，把它们身上的脏东西都洗掉，让它们干干净净地去开启新旅程。
接下来就到了关键的一步啦，把它们放到合适的培养基里。
这培养基就像是植物的小“温床”，给它们提供各种营养，让它们能快快长大。
培养的环境也很重要哦！温度呀、湿度呀都得调节好，就像咱人得在舒服的环境里才开心一样，植物在合适的环境里才能茁壮成长。
有时候我就想啊，这些小植物就像一个个小娃娃，得精心呵护着。
看着那些小小的组织在培养基里一点点长大、分化，真的特别神奇。
就好像看着一颗小种子慢慢发芽、开花一样，心里别提多有成就感了。
有一次我培养了一些多肉植物的组织，天天盯着看，盼着它们能快快长出小多肉来。
嘿，还真别说，过了一段时间，真的看到了一些小小的多肉雏形，那感觉，就像自己创造了一个小奇迹似的。
植物组织培养的好处可多啦！可以快速繁殖好多好多的植物，让那些珍稀的品种也能被更多人欣赏到。
而且还可以对植物进行改良，让它们变得更优秀。
我觉得植物组织培养就像是一门神奇的魔法，能让我们用小小的组织创造出大大的奇迹。
它让我们更深入地了解植物的世界，也让我们能更好地和这些绿色的小伙伴们相处。
所以呀，大家都来试试植物组织培养吧，感受一下这个奇妙的过程，说不定你也会像我一样爱上它呢！让我们一起在植物组织培养的世界里探索、发现，创造属于我们自己的绿色奇迹！。
组织培养 植物组织培养基本操作
2020/3/24
一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
2020/3/24
大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
2020/3/24
⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
2020/3/24
4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
2020/3/24
5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
2020/3/24
一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
2020/3/24
大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
2020/3/24
⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
2020/3/24
4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
2020/3/24
5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
2020/3/24
组织培养基本原理和设施
4. 温室
在具备温室条件的地方，可以在温室栽培
材料，供植物组织培养取材只用。温室为植 物提供良好的生长环境，可以根据需要随时 栽培，也可以为组织培养提供健康的植物材 料，从而使初代污染得到有效控制。同时， 温室也为试管苗的移栽提供良好的炼苗场所， 温室内应配置有温度控制装置、通风口、喷 雾装置、光照调节装置、杀菌杀虫工具及相 应药剂等。
（2）培养设备 培养设备是为培养物创造适宜的光、
温、水、气等条件的设备. ① 空调 ② 加湿器或去湿机。 ③ 定时器。 ④ 培养架。 ⑤ 摇床或旋转床 ⑥ 恒温恒湿光照培养箱。
（3）药品贮存和配制仪器设备 ① 冰箱。 ② 天平。 ③ 酸度计。 ④ 微波炉或电磁——用以融化琼脂。
倒置显微镜 原生质体观察
普通显微镜 染色体和叶片气孔观察
荧光显微镜 细胞活力观察
解剖显微镜
立体观察
需配备光学相机或数码相机。
（5）其他仪器设备 ① 离心机。进行原生质体分离时，需要
离心机。 ② 蒸馏水制备装置。需要时，还可进行重
蒸馏水来获得纯度更高的蒸馏水。 除此之外，电炉、水浴锅、药品柜和晾
冰箱 陈列于制备室中
作用：低温保存材料，存放药品、培养基
母液、激素、酶制剂。 天平
陈列于制备室中
作用：称取大量元素、微量元素、
酶制剂
酸度计
陈列于制备室中
作用：测定培养基及酶制剂的ｐＨ值
PHS-802中文台式酸度计 通用型或经济型酸度计
（4）观察分析仪器设备
陈列于观察室中
类型：
体视显微镜 用以植物组织形态分化的实 体观察，不定芽、不定胚的早期识别，植 物茎尖的切取
（二）主要仪器和设备 1、常用设备
（1） 无菌操作设备 包括超净工作台、高压蒸汽灭菌和烘箱等。
第二章植物组织培养的基本原理ppt课件
第二章 植物组织培养的基本原理
第一节 细胞全能性与细胞分化 一、细胞全能性理论的提出与发展：
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。
1839年, Schwann提出有机体的每一个生活细胞在适宜的外 部
环境条件下都有独立发育的潜能。
1901年, Morgan首次提出一个细胞应具有发育出一个完整 植
小孢子分裂的末期产生的成膜 体，形成一个细胞板，随后，变 为分隔营养细胞和生殖细胞的壁。 由于胞质分裂高度的不均等性， 形成大小悬殊的营养细胞和生殖 细胞。
茎切段有极性。
2、作用： 使细胞内生活物质的定向和定位，表现两极分化，导致
两极不对称性。
3、决定因素： 微管结构决定细胞分裂的取向，决定着细胞最终的形态。 质膜作为接受外界刺激的最初反应部位，其局部变化及
其与微丝的结合可能是极性形成并稳定的基础。
微管的结构
➢微 管 (microtubule) 是 存在于细胞质中的由微 管 蛋 白 (tubulin) 组 装 成 的中空管状结构。
➢微管的主要结构成分是由α-微管蛋白 与β-微管蛋白构成的异二聚体，这些微 管蛋白组成念珠状的原纤丝，由13条原 纤丝按行定向平行排列则组成微管。
株的能力。
1902年，Haberlandt 首次提出细胞培养的概念。
1934年, White用离体的番茄根建立了第一个活跃生长的 无
性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成 功。提出B族维生素的重要性。
1944年，Skoog报道DNA的降解产物腺嘌呤, 可以促 进愈伤组织的生长，解除生长素对芽形成的抑 制作用，诱导芽的形成。
”。即在没有生长素的培养基上也能生长一段时间。
3）质地： 愈伤组织的质地分为：松散、致密两类。在适宜
第一节 细胞全能性与细胞分化 一、细胞全能性理论的提出与发展：
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。
1839年, Schwann提出有机体的每一个生活细胞在适宜的外 部
环境条件下都有独立发育的潜能。
1901年, Morgan首次提出一个细胞应具有发育出一个完整 植
小孢子分裂的末期产生的成膜 体，形成一个细胞板，随后，变 为分隔营养细胞和生殖细胞的壁。 由于胞质分裂高度的不均等性， 形成大小悬殊的营养细胞和生殖 细胞。
茎切段有极性。
2、作用： 使细胞内生活物质的定向和定位，表现两极分化，导致
两极不对称性。
3、决定因素： 微管结构决定细胞分裂的取向，决定着细胞最终的形态。 质膜作为接受外界刺激的最初反应部位，其局部变化及
其与微丝的结合可能是极性形成并稳定的基础。
微管的结构
➢微 管 (microtubule) 是 存在于细胞质中的由微 管 蛋 白 (tubulin) 组 装 成 的中空管状结构。
➢微管的主要结构成分是由α-微管蛋白 与β-微管蛋白构成的异二聚体，这些微 管蛋白组成念珠状的原纤丝，由13条原 纤丝按行定向平行排列则组成微管。
株的能力。
1902年，Haberlandt 首次提出细胞培养的概念。
1934年, White用离体的番茄根建立了第一个活跃生长的 无
性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成 功。提出B族维生素的重要性。
1944年，Skoog报道DNA的降解产物腺嘌呤, 可以促 进愈伤组织的生长，解除生长素对芽形成的抑 制作用，诱导芽的形成。
”。即在没有生长素的培养基上也能生长一段时间。
3）质地： 愈伤组织的质地分为：松散、致密两类。在适宜
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驯化的方法:炼苗
由培养室转移到半遮荫的自然光下锻炼，在自然光下恢复植物体内叶 绿体的光合作用能力和健壮度 打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗 周围的环境就会逐步与自然环境相似。
试管苗的驯化
（三）、试管苗的移栽
常规移栽法 直接移栽法 嫁接移栽法 指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗 作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。
（二）产生玻璃化苗的因素
（三）预防措施
适当控制培养基中无机营养成分； 适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度； 适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度； 增加自然光照，控制光照时间； 控制好温度； 改善培养器皿的气体交换状况 在培养基中添加其他物质， 加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻 璃化。 如添加马铃薯汁液法可降低油菜玻璃苗的产生频率； 0.5mg／L多效唑或10mg／L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化 的发生； 1.5～2.5g/L的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化 。 加入 0.3％的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率。
八、 试管苗的驯化与移栽
试管苗的特点
试管苗的驯化
试管苗的移栽 提高试管苗移栽成活率的途径
（一）、试管苗的特点
试管苗的生态环境 高温且恒温；高湿；弱 光；无菌。 试管苗的特点 试管苗生长细弱，茎、 叶表面角质层不发达； 试管苗茎、叶虽呈绿色， 但叶绿体的光合作用较 差； 试管苗的叶片气孔数目 少，活性差； 试管苗根的吸收功能 弱。 蓝莓
试管苗和普通苗的根解剖比较
（二）、试管苗的驯化
驯化的目的: 在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能 力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。
驯化的原则：
应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数 天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培 条件相似，从而达到逐步适应的目的。
芽
高CTK/IAA
根
完 整 植
外植体
愈伤组织
脱 分 化
再 分 化
低CTK/IAA
株
根
芽
生长调节物质控制器官分化的模式
五、污染的原因及其预防措施
污染
概念：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。
原因：
细菌
菌斑呈黏液状物。 除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外，操作人员的不慎 也是造成细菌污染的重要原因。因此接种人员的手应经常用 70％酒精擦净，镊子和接种 针在使用前必须在火焰上烧红。
4、根及地下部器官的消毒
预先用自来水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤及污 染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。
可采用0.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸钠溶液浸10～ 15min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。
三、外植体的接种和培养
（一）无菌操作
（二）外植体的培养
2、定期检查和细胞学观察
接种后3～7天内，主要是检查其污染情况。 增殖、继代培养，建立了无菌培养系。 细胞学观察：一般每隔3～5天观察一次。及时 记录。 观察方法根据培养方式灵活掌握： 可用显微镜进行定点观察如平板培养 可用倒置显微镜观察如液体培养
四、外植体的成苗途径
1．外植体先形成愈伤组织，再分化成完整 的植株。
（四）、提高试管苗移栽成活率的途径
试管苗的生理状况 植物生长调节物质 无机盐浓度 活性炭 环境因子 移栽过程中试管苗 从无菌向有菌逐渐过渡
复习思考题
1．进行植物组织培养需要哪些设备？各有何作用? 2．植物组织培养主要包括哪些环节?各环节的主要工 作内容是什么? 3．培养基包括哪些基本成分?其作用是什么?如何配 制? 4．如何对外植体、 培养基、培养器皿、接种器械进 行灭菌？ 5．离体培养的植物材料对光、温、湿度有何要求？ 如何调控？ 6. 何谓玻璃化？何谓褐化？如何克服？
（一）无菌操作
植物组织培养的接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分
离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作 过程，是一种无菌技术。
在操作过程中引起的污染来源：主要是由材料本身带菌和工作 人员本身引起的。
1、接种室的消毒
污染的主要来源是空气 中的细菌和真菌孢子 每次接种前半小时 地面：用70％酒精喷 雾使空气的灰尘沉降。 紫外线灯照射20分钟。 工作台面要用新洁尔灭 或酒精擦洗。
毒的还可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒5min。
胚或胚乳培养时，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%～ 10%的次氯酸钠溶液浸泡8～10min，经无菌水冲洗后，即可取出接
种。
3、花药的消毒
70％酒精擦洗花蕾，或浸泡 数秒钟
饱和漂白粉上清液：浸泡10
分钟；或次氯酸钠液2％～5％： 8～10分钟 无菌水冲洗几次后，吸去水 分，剥取花药或胚珠接种。
第一节 植物组织培养的操作方法概述
一、外植体的选择
二、外植体的灭菌
三、外植体的接种和培养
四、外植体的成苗途径
五、污染的原因及其预防措施
六、外植体的褐变及其防止措施
七、培养物的玻璃化现象及其防止措施
八、试管苗的驯化与移栽
一、 外植体的选择
外植体（Explants）：指植物离体培养的各种接种材
料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。
接种
盖好瓶塞
（二）外植体培养
1、培养条件：
温度：常保持在23±2℃，夜温低1—2℃
光照时数：大多数情况下为16h（暗培养不需要光照，例如 起始培养的前几天不需要光照）
光照强度：1000—3000lx ，白色荧光灯，光的作用是满足 形态建成的需要（诱导） 相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当 调整培养间湿度
上。
3、材料的切取
切取和接种较大的材料肉眼观 察即可操作分离，较小的材料需 在双筒解剖镜下操作。 分离工具一定要放好，切割动 作要快，防止挤压使材料损伤而 失败。 接种时要防止交叉污染的发生
4、 接种的具体操作
酒精擦拭手
外植体消毒 浸泡5min 器 械 消 毒
酒精灯灼烧
旋转灼烧
取外植体
2、工作人员要求
入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟 入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准 讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把 工具在火焰上消毒。 必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖 前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖
操作人员
六、外植体的褐变及其防止措施
（一）褐变的原因
1.基因型
2.外植体的生理状态 3.培养基的成分 无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转 移时间过长。 （二）褐变的防止措施 1.选择适宜的外植体 2.最佳培养基 3.连续转移 4.加抗氧化剂 5.活性炭
七、培养物的玻璃化 现象及其预防措施
2．胚状体发生
3．外植体经诱导后直接形成根与芽，发育 成完整的植株 4．原球茎型---图片
石斛兰的原球茎
根、芽 愈伤组织 芽 根 外植体 胚状体 根 芽
试
管
根、芽
苗
外植体的成苗途径
不 定 芽 形 成 多 细 胞 Fra bibliotek 与---
胚状体形成过程--单细胞参与
体细胞胚的发育过程
低
低CTK/IAA
CTK/IAA
（三）几种外植体的灭菌方法
1、茎尖、茎段及叶片等的消毒 消毒前要经自来水较长时间的冲洗。 消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～10%
的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几
滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒后，用 无菌水冲洗3次后方可接种。 2、果实及种子的消毒 用自来水冲洗10～20分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。 果实用2%次氯酸钠溶液浸 10min后，用无菌水冲洗2～3次。 种子要先用10%次氯酸钠浸泡 20～30min甚至几小时。对难以消
次氯酸钙 次氯酸钠 漂白粉 溴 水 过氧化氢 升 汞 酒 精 抗菌素 硝酸银
9～10 2 饱和溶液 1～2 10～12 0.1～1 70～75 4～5（mg/L） 1
易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难
5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30
自:曹孜义
很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好
（二） 外植体灭菌的一般步骤
1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将 准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材 料，其表面仍有很多细菌和真菌。 2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒 精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。 3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活 化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖 上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须 把玻璃瓶摇动2～3次。 4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无 菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复3～4次。
外植体的选择依据
优良的种质 健壮的植株 大小适宜的外植体 适宜的发育时期 适宜的部位 适宜生理状态和发育年龄的器官 细胞培养材料的选择
二、外植体的灭菌
（一）常用灭菌剂的使用及其效果
（二） 外植体灭菌的一般步骤
（三）各种外植体的灭菌方法
（一）常用消毒剂
消毒剂 使用浓度（％） 去除的难易 消毒时间（分） 效果