细胞培养标准操作程序(SOP)
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)GII式显带法 (21)N式显带法 (21)R(反式)显带法 (23)姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)荧光原位杂交操作程序 (25)附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)天平称量操作规程 (27)药匙处理操作规程 (27)PBS配制规程 (28)胰酶配制规程 (28)培养基配制规程 (29)1N HCL配制规程 (29)1N N A OH配制规程 (29)外周⾎培养及染⾊体的识别1. 原理：外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G0期或G1期，⼀般情况下是不分裂的。
当在培养基中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。
经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。
2. 外周⾎培养与收获操作步骤：2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。
2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。
2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。
2.4. 制⽚过程：2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。
SOP-细胞常规维持培养
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞培养液制备SOP
1. 目的规范细胞培养液配制的操作。
2. 范围细胞生长液和细胞维持液的配制。
3.职责3.1.质量管理部：负责本规程的起草。
3.2. 质量管理部QC：负责本规程的操作。
3.3. 总经理：负责本规程的审批。
4. 定义无5. 引用标准无。
6. 材料6.1. 试剂6.1.1 配制好的MEM溶液，见《MEM培养基制备程序》6.1.2 配制好的谷氨酰胺溶液见《谷氨酰胺配制程序》6.1.3 配制好的双抗溶液见《双抗配制程序》6.1.37.5％碳酸氢钠见《双抗配制程序》6.2. 器械、用具6.2.1 移液管6.2.2 配液瓶6.2.3 75％洒精棉6.3 仪器设备6.3.1 高压灭菌器6.3.2 超净工作台7. 流程图无8. 内容8.1.细胞营养液的配制8.1.1. 配制前的准备8.1.2 消毒手部：将手用清水及肥皂洗净，用75%酒精棉球擦拭手的各个部位。
8.1.3. 超净台的启动：接通超净台开关，风机进入标准状态，开启紫外灯，运行20分钟。
8.1.4 将配液所需各种溶液及器具放入超净台。
8.2 配制过程8.2.1 穿好工作衣，带好帽子、口罩。
胳膊放入超净台内带好套袖和手套。
8.2.2. 用75%酒精棉球消毒手臂，解去HL/MEM瓶线，用酒精棉球消毒各种溶液瓶口，每擦一瓶换一块棉球，一瓶擦拭两遍。
8.2.3 轻轻拿下纸帽及棉塞，拔下溶液瓶塞，在酒精灯外焰处，将瓶口灭菌。
顺次加入所需各种营养液。
8.3 加液顺序8.3.1 MEM或DMEM8.3.2 血清 8～10％（或根据需要配制成2～5%，细胞维持液）8.3.3. 双抗 1%8.3.4 L-谷氨酰胺 0.45%。
1.0～2.0%8.3.5. 7.5%NaHCO38.3.6. pH 6.8～7.28.3.7. 盖好胶塞，备用。
9. 注意事项9.1 注意无菌操作9.2 配制好的细胞营养液一周内用完。
10. 附录及派生记录培养基配制记录F-SOP-ZL023-0111. 相关文件无12. 修订记录。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养传代标准操作规程
1、目的:建立Vero细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化.为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。
2、范围：适用于Vero细胞培养传代实验人员。
3、编制依据《企业注册标准WS4—（S-009-2）—2003Z》。
4、Vero细胞培养传代操作规程4。
1试药与试液1、细胞：Vero细胞.2、液体：0。
25％胰蛋白酶溶液；7.5％碳酸氢钠溶液；小牛血清；PBS缓冲液；10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。
4.2仪器与用具1、恒温培养箱;2、倒置生物显微镜。
4。
3操作方法4。
3.1细胞培养、传代1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台30min。
2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞，弃旧生长液。
3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺平培养瓶底为佳),倒置显微镜下观察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去,4、把细胞培养瓶置37.0℃±0。
5℃孵育让残存的胰酶继续消化，（在37℃胰酶消化效果最佳）,每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮,细胞间隙明显增大时，加入先配好的完全培养基适量终止消化，用吸管轻柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。
5、取一滴细胞悬液进行计数(此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多少密度的细胞具体几天可以长满，待有经验后此步骤可以省略。
）6、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等，一般按照1：3—1:5比例进行传代。
先用滴管吹打混匀细胞悬液,平均分配细胞悬液到各个培养瓶中,补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右，平放到培养箱中继续培养。
7、收拾所用物品、用75％酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
4。
3。
2填写记录：1、随试验进程做好试验记录（按实验记录规范要求）,包括试剂的厂家、批号、效期，试验时间，试验结果。
NK细胞培养SOP
NK 细胞培养sop日程：第0天：NK激活剂的处理，分血第2天：补液20ml第4天：补液第7天：装袋第9天：补液第11 天：分袋第13 天：检菌第14、15 天：收获1. 研究背景与目的采用从病人自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使其扩增活化，再静脉回输，将其输回病人体内，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。
2. 定义和缩写2.1. NK 自然杀伤细胞2.2. rhIL-15 人源重组白细胞介素152.3. IL-2 白细胞介素3. 主要仪器、耗材3.1. 仪器3.1.1 生物安全柜3.1.2 流式细胞仪3.1.3 水平低速离心机3.1.4 灭菌锅3.1.5 CO 2 孵箱3.1.6 倒置显微镜3.1.7 血细胞记数器3.1.8 血细胞计数板3.1.9 移液器3.1.10 -20℃-4℃冰箱3.2. 耗材3.2.1 75cm2培养瓶3.2.2 225 cm2培养瓶3.2.3 移液管3.2.4 15ml、50ml离心管、250ml离心管3.2.5 医用塑胶手套3.2.6 一次性帽子、手套3.3. 试剂3.3.1 无血清培养液3.3.2 IL-2 (100万IU/瓶)3.3.3 IL-153.3.4 0.4%苔盼蓝溶液3.3.5 生理盐水3.3.6 人淋巴细胞分离液3.4 原材料3.4.1 外周血，脐血，骨髓等4 操作步骤分血：4.1 培养瓶的处理：吸取NK细胞激活剂500ul，用生理盐水稀释至6ml，加到75cm 2 的培养瓶中混匀后，放置于37°C。
1h后取出备用。
4.2 将不同来源的血样，用生理盐水稀释一倍；4.3 Ficoll密度梯度离心，2000rpm，25分钟；4.4 吸取血浆，置56°C，灭活20min；灭活血浆，3000rpm，15min；4.5 白膜层用移液管吸入到新的50ml离心管中，用生理盐水洗涤细胞两次，第一次为2100rpm，6min；第二次为1500rpm，6min；4.6 从培养箱中取出处理的培养瓶，吸除激活剂，加入生理盐水10ml，轻轻晃动培养瓶，吸除生理盐水；4.7 用10-15mlNK培养液重悬细胞悬液，同时补加10%血浆，1000U/ml的IL-2,50ng/ml IL-15；将细胞置于CO2培养箱中培养。
标准操作规程(SOP)——组织细胞半数感染量滴定
一、目的病毒组织细胞半数感染量—TCID50是病毒感染能力的标化指标。
该SOP 明确病毒组织细胞半数感染量—TCID50滴定的标准方法，保证实验结果的准确可靠。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员测定病毒组织细胞半数感染量。
三、程序（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。
操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP ”（二）材料1．病毒储存液2．MDCK 细胞和细胞培养液试剂MDCK 细胞：低代数的MDCK 细胞（小于25代）MDCK 细胞培养液：D-MEM +5%胎牛血清+抗生素500mL D-MEM 培养液（Gibco, Cat. #11960-051）5.5mL 青、链霉素母液(10000 U/mL 青霉素 G ；10000 µg/mL 硫酸链霉素，Gibco, Cat. #15140-122)25.5mL 胎牛血清，（Gibco, Cat. # 16000），0.22µm 过滤器过滤EDTA-胰酶（Gibco, Cat. #25300-054）3．病毒培养液： DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。
429mL DMEM66mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA ）标准操作规程（SOP ）——染量滴定5mL 100×抗生素TPCK-胰酶（使用浓度为2mg/mL）4．其他平底96孔微量培养板红细胞计数器1％红细胞悬液Hank’s液（三）实验步骤1．MDCK细胞的制备第一天，将细胞瓶中成片生长的MDCK用EDTA-胰酶消化计数，（具体方法见“MDCK细胞培养SOP”及“细胞计数SOP”）以3×104/孔接种MDCK细胞于96孔细胞板中，37ºC 5%CO2孵育24h。
2．病毒的稀释：可采取对数或者半对数稀释的方法。
细胞培养标准操作程序(SOP)
细胞培养标准操作程序(SOP）1．目的:为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：3。
1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min.2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末.3、充分搅拌，按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI—1640配制1000ml需加NaHCO3粉2。
0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌.无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M(1mol/L）HCl 调PH至7。
0左右（细胞适宜在PH7。
2~7。
4生长，配制好后PH值会升高0。
2～0。
3，故配时调PH至7。
0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml.6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取0。
5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放—20℃保存备用.注意：(1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌,干净即可.3。
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。
（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。
(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。
(4)调节pH值至7.2~7.4。
(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。
此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。
(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。
（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。
配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。
3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
细胞培养实验课程SOP
实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞、PK-15：猪肾传代细胞、IBRS-2：猪肾传代细胞、Hela：人的子宫瘤细胞、Vero：非洲绿猴肾细胞、Marc-145：来源于Vero细胞、Sf9：昆虫细胞。
三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
七、传代细胞系培养1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
标准操作规程(SOP)——细胞计数
一、目的细胞计数法是细胞学实验中进行细胞计数的基本方法，通过细胞计数，能够保证实验的准确性、稳定性和可重复性。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行细胞计数的操作。
三、定义细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。
一般利用计数板（红细胞计数板）进行。
即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。
不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。
四、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-2（二）材料1．生长成片的MDCK 细胞2．血细胞计数板3．1mL 、10mL 无菌移液管4．台盼蓝（0.4% PBS 溶液）建议：经常检查试剂使用的有效期（三）实验步骤1．消化细胞（方法见MDCK 细胞培养标准操作规程）。
2．用血细胞计数板来计算细胞悬液中的细胞数，需要充分分散细胞。
3．在18μL 台盼蓝（0.4% PBS 溶液）中加入2μL 细胞悬液，混匀，成10倍标准操作规程（SOP稀释。
死细胞被染成蓝色。
4．将以上细胞悬液加入到血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下计数。
5．计算计数室四个角上三线包围的正方形中的活细胞，压线的细胞计数遵循计数原则，数上不数下，数左不数右。
如果观察到成片或者成团的细胞，应重新悬浮细胞液，重新计数。
用以下公式计算每毫升悬液中活细胞的数量。
C=4个角正方形内的活细胞总数/4×104×10C：每毫升活细胞数；五、参考文件《流行性感冒诊断标准》。
SOP-微生物检测标准操作程序
1.细菌、真菌检测：1.1取1ml 培养上清液，均匀涂布于羊血平皿、沙保弱氏平皿中。
1.2倒置平板，写上患者姓名、日期、批号。
1.3分别于37℃、25℃生化培养箱中培养。
1.4 24h 、48h 、72h 看结果。
1.5 做好记录。
2.支原体检测在获得能提供系统发育学信息的16S rRNA 分子时需要利用通用PCR 引物对16S rRNA 分子进行扩增。
16S rRNA 序列的对比分析需要在这类“通用引物”的脱氧核糖核酸分子的辅助下完成。
27F 5`-----aga gtt tga tcy tgg yty ag----3`519R 5`-----gwa tta ccg cgg ckg ctg-----3` 2.1取1ml 细胞上清液，1000rpm ，离心3min 。
(注：此步骤针对悬浮细胞）2.2取上清至另一个1.5ml EP 管中，13000rpm ，离心10min 。
2.3吸弃上清，留沉淀作为PCR 模板。
2.4 配制反应体系20ul ：Taq 酶（R028A ）（DNA 聚合酶） 10ulPrimer F （前引物） 0.5ulPrimer R （后引物） 0.5ulTemplate （模板） 2ul灭菌水 补足至20ul 细胞制品细菌、真菌、支原体检测标准操作程序制定部门：同济大学医学院干细胞研究同济医院临床转化中心编号：SOP-TJSC-QM-005页数：1/2生效日期 年 月 日 目的：严格按照标准操作规程检测 范围：所有用于细胞制品的检测 职责：实验室质检员2.5反应条件95℃ 5min95℃ 30s55℃ 30s 32 cycles72℃ 50s72℃ 10min2.6 PCR产物扩增完后，配制1.5%琼脂糖支持介质（例：35mLTAE（一倍）缓冲液则加0.525g琼脂糖），凝固待用。
每个EP管加4ul 6×Loading buffer（指示剂、增加密度）。
2.7上样（每格5ul）：凝胶板第一格加DL2000 DNA Marker 5ul凝胶板第二格加阳性对照凝胶板第三格加阴性对照三格以后加检测样品2.7 120V，20min电泳检测。
胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)
一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。
由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM 是500ml。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
细胞培养标准操作程序(SOP).docx
细胞培养标准操作程序（SoP1.目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2 .适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3 •操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 100Oml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2〜3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCo3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml× 10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2〜3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌,按说明添加成分（如InVitrogen公司的RPMl-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g , InVitrogen公司的DMEM需加NaHCo3粉3.7g等），再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M （1mol∕L ）HCl调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2〜7.4生长，配制好后PH值会升高0.2〜0.3 ,故配时调PH至7.0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素80万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml ,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22Um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20 C保存备用。
注意：（1 ）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml× 10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
细胞培养标准操作程序
细胞培养标准操作程序（SOP）1．目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：培养液、PBS、胰蛋白酶的配制1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉等），再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至左右（细胞适宜在～生长，配制好后PH值会升高～，故配时调PH 至左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素80万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解取青霉素和链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。
注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
PBS（平衡盐溶液）的配制NaCl 8gKCl ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000mlNa2HPO4*H2OKH2PO4（1）无需调PH值，其成分溶解后PH为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）（2）Na2HPO4*H2O 则Na2HPO4*12 H2O需（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可%胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉EDTA（乙二胺四乙酸二钠）NaClKCl` +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML NaHCO3Glucose(葡萄糖)酚红（1）配出来的PH值为，在PH值～范围内，故不需调PH值。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
细胞传代标准操作规程
细胞传代标准操作规程-细胞传代培养SOP（消化法）1. 传代前准备：1.1 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
1.5 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
1.6从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
1.7打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶-EDTA消化：2.1 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
3. 吹打分散细胞：3.1吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.3平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。
3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞：4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。
最后要做好标记。
5. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
NK细胞培养SOP
NK细胞制备与培养标准操作流程1 目的与范围：1.1 目的：规范NK细胞培养操作流程，保证NK细胞产品制备的稳定性、均一性。
1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员对NK细胞培养的全过程。
2 文件：2.1 NK细胞制备与培养标准操作流程3 记录：3.1 NK细胞制备与培养记录表、操作1间清场记录表4 试剂、耗材与仪器设备：4.1 试剂：75%酒精、D-PBS缓冲液或生理盐水、淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、自体血清、A/B/C/D/E因子、IL-2。
4.2 耗材：T175培养瓶、1.5L培养袋、15ml离心管、50ml离心管、50ml一次性注射器、5ml一次性注射器、1ml一次性注射器、10ml移液管、1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、巴斯德滴管、0.2ml Ep管、0.22um一次性过滤器。
4.3 仪器设备：超净工作台、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱、水浴锅、电动移液枪、1ml手动移液枪、200ul手动移液枪、医用剪刀、医用止血钳、试管架、50ml注射器支架、托盘。
5 工作程序：5.1 实验前准备：5.1.1 洁净区需经紫外线照射，连续照射时间≥30min，实验室共作过程中风机始终保持开启运行状态。
5.1.2 超净工作台需经过开机紫外线照射，照射时间≥30min，开机风机运行≥10min。
开启超净工作台玻璃防护窗，待超净工作台内部气流稳定后才可使用。
5.1.3 将实验室所需的器械、耗材放于物料传递窗进行紫外线照射≥30min（器械与各规格的移液枪头必须经过高温高压灭菌锅消毒灭菌，且在合格期内），照射完毕后将器械包与所需耗材用75%酒精纱布擦拭外包装消毒后放入超净工作台内备用。
5.1.4 将淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、PBS缓冲液或生理盐水提前30min从4℃冰箱取出，用75%酒精纱布擦拭后放入超净工作台，恢复至室温备用。
5.1.5 A/B/C/D/E因子、IL-2在使用时提前10min从-20℃冰箱取出，即用即取，禁止在常温状态下长期放置。
T细胞培养标准操作规程
百利药业生物药研发部标准操作规程题目：293T细胞传代培养操作规程编号：SOP-M-e-003-制定者：（签名）日期：年月日批准者：（签名）日期：年月日生效日期：年月日题目：293T细胞培养操作规程1目的293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞，因此做好293T细胞的培养，为保证相关实验的正常进行提供必要条件。
2适用范围本部门293T细胞培养3操作方法将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm2新的细胞培养瓶放于生物安全柜中，按照生物安全柜的标准操作规程，将生物安全柜的紫外开启半小时。
将含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。
3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO培养箱中取出，先用75%2的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，用无菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤一次，吸净PBS。
3.2.2将含%tyption用PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加入3ml稀释好的%tyption，让其充分平铺于细胞表面。
盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎牛血清的DMEM终止反应，用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，将细胞液移到15ml无菌的离心管中，1000rpm离心3分钟。
3.2.3将离心上清吸弃掉，用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进行。
3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进行传代培养，每个75cm2的培养箱中培养。
培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO23.2.524小时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进行下一次传代培养。
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细胞培养标准操作程序(SOP)1.目的:为了保证培养细胞的正常生长,实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤,特制订实验室细胞培养操作流程。
2.适用范围:适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3.操作规程:3、1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3、1、1 1000ml培养液的配制1、准备用品:培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml×10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)溶解,并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌,按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2、0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3、7g等),再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺,因该培养基里已含有。
4、用1M(1mol/L)HCl 调PH至7、0左右(细胞适宜在PH7、2～7、4生长,配制好后PH值会升高0、2～0、3,故配时调PH至7、0左右)。
5、用新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取0、5ml青霉素与0、4ml链霉素加入到1000ml培养液中,使其终浓度均为100U/ml,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0、22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中,玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放-20℃保存备用。
注意:(1)配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl与(或)NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)配制。
一般于配制当天制备,以保证水的纯度与质量。
(2)准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)的容器均不需高压灭菌,干净即可。
3、1、2 PBS(平衡盐溶液)的配制NaCl 8gKCl 0、2g ＋新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)至1000mlNa2HPO4*H2O 1、56gKH2PO4 0、2g(1)无需调PH值,其成分溶解后PH为7、4,不需除菌滤膜过滤除菌,放于4℃保存,用前直接高压灭菌(高压时,装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!)(2) Na2HPO4*H2O 1、56g 则Na2HPO4*12 H2O需3、4888g(3)如欲配制500ml,以上成分减半即可3、1、3 0、25%胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉 2、5gEDTA(乙二胺四乙酸二钠) 0、3gNaCl 8、0gKCl 0、4g ` +新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)至1000MLNaHCO3 0、5gGlucose(葡萄糖) 1、0g酚红 0、06g(1)配出来的PH值为7、6,在PH值7、6～7、8范围内,故不需调PH值。
(2)用0、22um的除菌滤膜过滤分装,瓶口用薄膜封口,放-20℃保存备用。
4℃可连续使用1月左右。
(3)用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)的容器均不需高压灭菌,干净即可。
(4)如欲配制500ml,以上成分减半即可3、2 细胞复苏1、准备:紫外线照台30min,准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸;培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。
在操作台上摆放好物品,左边为饭盒、培养液等,中间为酒精灯、试管架等,右边放滴管架、镊子,右上角放废液缸。
2、灼烧培养瓶口及瓶盖,用滴管取培养基5ml加入试管中(一滴约为50ul)。
3、戴手套,从-196℃液氮罐中取出冻存管,立即放入37℃水浴箱中快速解冻,同时不断轻轻摇动冻存管,保证冻存管内细胞1min内融化。
以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
(慢冻快融)4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液,加入到已装有培养基的试管中,塞子塞试管,800rpm离心2min(用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO,因常温下其对细胞毒性大),弃上清,试管底部的白色物质为细胞,轻弹混匀。
往试管中加培养基、FBS(胎牛血清)各80滴与20滴(使FBS 浓度为20％)。
用吸细胞液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀,以免在培养瓶里成团,影响细胞生长。
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出,加到培养瓶中,标记日期、细胞名称,再把培养瓶放入CO2培养箱。
(注意:加入到培养瓶后,培养瓶轻轻平放,用手拿培养瓶侧壁,左右上下轻轻摇晃几次,使细胞均匀贴壁在培养瓶底。
)6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面整洁。
注意:(1)入细胞室前观察CO2%压力,5-7、5mPa左右,减压器表压力不低于0、1mPa！(2)刚复苏的细胞需要的营养成分更多些,让FBS浓度达到20％。
(3)离心时间为1～2min,速度为800转,不要离心太久,避免对细胞伤害较大。
(4)滴管使用注意事项:a、吸细胞液专用一个滴管,各株细胞的滴管一定要严格分开,不能混用,防止细胞间污染。
b、培养基与FBS(胎牛血清)可以用一个滴管,但分开用更好！c、 FBS(胎牛血清)不能与胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。
d.胰酶与PBS(平衡盐溶液)可以用一根滴管,不过最好分开(5)不就是所有的细胞复苏后都能活。
死亡原因:冻存时间太长(如2年以上),技术不过关(如吹打太激烈)、细胞传代数太多等。
(6)关于PBS(平衡盐溶液):a、PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用;PBS高压时其瓶塞一定要插针头。
b、PBS与培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质,但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。
PBS 虽然冲洗杂质效果较好,但它有使细胞易脱壁的倾向,故不可经常冲洗细胞。
c.不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备,使细胞加入胰酶后易消化。
d.消化后暂时不养细胞的培养瓶,可以往其中加入2～3ml PBS(防止培养瓶干燥),培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。
下次用该培养瓶再养同种细胞时,把PBS吸出弃去,再用培养基冲洗一遍即可再用。
(7)DMSO(二甲基亚砜)在常温下对细胞毒性较大,而在4℃时,其毒性大大减弱,故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO(离心后弃去上清),防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！3、3 细胞换液1、倒置显微镜下观察细胞生长状态:a、移动细胞培养瓶时,观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞;b、生长状态良好的细胞:透明度大、折光性强、轮廓不清;能瞧清部分细胞细微结构,细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
c、生长状态不良的细胞: 细胞折光性变弱,轮廓增强,胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质,细胞间空隙加大,细胞变得不规则,失去原有特点。
d、只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代与实验。
2、紫外线照台30min,准备好吸管、试管饭盒,温育培养基,FBS(胎牛血清)可不温。
实验开始时打开照明灯与抽风机,用75%酒精喷双手。
酒精灯点燃放中间。
滴管放滴管架上,从左到右顺序为:吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS(胎牛血清)的滴管。
从水浴箱中取出培养基,擦干水放入操作台的左边。
3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶,在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处(注意不要把胶盖烧焦),滴管(前端90%部位)灼烧。
细胞培养瓶倾斜,用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中,尽量吸干净。
注意:滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内,避免产生气泡,且不要伸入瓶内太多,防止造成污染;滴管尖端悬空弃液,不要触到废液碗(要亲眼瞧到弃液,防止滴管尖端触到废液碗)！4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶(25c㎡)中,再用吸FBS(胎牛血清)的滴管吸取FBS 10滴加入到培养瓶中。
(使FBS浓度为10％)5、旋紧细胞培养瓶盖后,再旋回半圈,以利于空气流通。
平放回CO2培养箱中。
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面整洁。
注意:(1)在打开培养基、FBS(胎牛血清)、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口与瓶盖,严格注意无菌操作。
灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。
(2)镊子每次使用前均需灼烧。
装FBS的瓶子瓶盖小,用镊子夹住盖子灼烧后,再用其夹住瓶盖盖上;取其瓶盖时也就是用镊子夹住瓶盖取下盖子。
(3)滴管在第一次使用前也需灼烧。
注意:除吸取细胞液的滴管外,其她滴管滴加液体时都要悬空滴加。
已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！(4)培养瓶口不要对着自己,不加试剂时要平放。
(5)培养液以没过细胞为宜。
(6)细胞液颜色变黄,死细胞多时换液。
不要求每天换液,容易增加污染机会。
3、4 细胞计数1、原理:(1)计算细胞数目用血球计数盘计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0、1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0、1mm=1、0x10-4ml。
使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。
2、计数方法:(1) 75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板,再用干纱布或棉签再擦一遍,放好盖玻片。
(2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边,再用加样枪吹打混匀该滴液体,从中吸取13ul至盖玻片边缘(注意不要溢出,不要有气泡)。
(3) 观察计数:压线的记左不记右,记上不记下;成团的细胞只记为1个;先用低倍镜(红色,4×)找出大位置,再用中倍镜(黄色,10×)进行计数。
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104(4) 计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板,再用干纱布(或干棉签)擦一遍。
3、5 细胞传代1、紫外线照台30min,准备好细胞培养所需物品。
2、取灭菌试管1支,配完全培养基(含10%FBS)3ml(培养基:FBS=54滴:6滴)。
3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。
4、胰酶消化:加入约1ml(20滴)胰酶到培养瓶里消化。
胰酶铺平培养瓶底为佳。
倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大,但未脱离培养瓶底,立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去,把细胞培养瓶放入CO2培养箱让残存的胰酶继续消化,(在37℃胰酶消化效果最佳)。
5、每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察,当观察到细胞变圆,透亮,细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基3ml加入到培养瓶中终止消化。