龟源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及药敏特性分析

乌龟（Chinemys reevesii）别称金龟、草龟、泥龟和山龟等，在动物分类学上隶属于爬行纲、龟鳖目、龟科，是最常见的龟鳖目动物之一。

由于乌龟药用和食用价值逐年升高，其在我国的养殖得到迅猛发展。

但近年来，由于养殖条件不当，龟鳖的各种疾病频发。

松鼠葡萄球菌广泛分布于自然界，属于革兰氏阳性菌。

研究发现该菌可感染多种动物并引起发病，目前也有学者发现该菌可感染水产养殖经济动物如黄颡鱼、黄喉拟水龟、黄鳝鱼等，严重者可致其死亡。

本试验室接诊了多例海南某龟鳖养殖场送检的发病乌龟，从患病龟体内分离出一株优势菌株，通过形态学观察、生化分析、分子生物学鉴定及动物回归试验鉴定为松鼠葡萄球菌感染，通过药敏试验筛选出敏感性药物，以期为乌龟的健康养殖提供理论依据和实践指导。

1材料与方法1.1.1试验动物海南省某龟鳖养殖场送检的发病乌龟，腹甲背甲腐烂，剖检可见肝脏淤血严重。

人工感染用乌龟购自海口东山鸿旺龟鳖养殖场。

1.1.2主要仪器及试剂血平板购自南京变诊生物科技有限公司；琼脂糖购自Amrescogon公司；生化微量鉴定管购自广东环凯微生物科技有限公司；基因组DNA提取试剂盒、PCR试剂购自Promega公司；DNA Ladder2000、LoadingBuffer均购自上海欣百诺生物科技公司；革兰氏染色液购自杭州微生物试剂有限公司；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.2.1病原菌的分离培养及形态学观察无菌条件下，取患病的乌龟肝脏、肾脏等进行低温研磨，稀释后接种于普通营养琼脂培养基，纯化至单个菌落。

将纯化的菌液接种在血琼脂平板，观察其菌落形态。

挑取单个纯培养的菌落进行涂片，经革兰氏染色后镜检。

1.2.2生化鉴定对分离纯化的菌株进行生化分析，按丁利等方法将纯化的菌株接种于各微量生化测定管中，37℃培养24～48h，观察并记录结果。

1.2.316S rRNA的PCR扩增及序列分析提取分离菌DNA，并以此为模板，选用16S rRNA通用引物（上游引物：5＇-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3＇，下游引物：5＇-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3＇）进行PCR扩增。

扩增产物经回收纯化后测序。

分离菌16S rRNA基因序列通过NCBI BLAST检索系统进行序列同源性分析，并利用Mega7.0软件中Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.4人工感染试验取12只健康乌龟（平均体重为80g），随机分为2组，每组6只。

将分离菌液调整浓度为4.2×108CFU/mL，试验组每只腹腔注射0.1mL菌液，对照组每只腹腔注射0.1mL无菌生理盐水，连续一周观察乌龟病死情况，龟源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及药敏特性分析方振华1，魏来2，丁利2★，洪美玲2★（1.海南职业技术学院热带农业技术学院，海南海口570216；2.热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南师范大学生命科学学院，海南海口571158）摘要：为明确一起致乌龟发病死亡的病原，本研究通过细菌的分离培养从患病龟体内分离出一株优势菌，并通过革兰氏染色观察、生化鉴定、16S rRNA序列比对分析、动物回归试验进行鉴定。

结果显示，分离菌在血琼脂平板上形成表面粘稠、大而凸起、白色的菌落；革兰氏染色结果显示分离菌为革兰氏阳性，球型，成葡萄串状排列；生化试验结果显示分离菌对葡萄糖、触酶、氧化酶等呈阳性反应，而密二糖、鸟氨酸脱羧酶、V-P反应等阴性；16S rRNA基因序列进化树分析显示该分离菌株与GenBank登录的松鼠葡萄球菌聚为一簇，且同源性达99%以上；动物回归试验显示该菌对乌龟有较强的致病性；药敏特性分析显示，该菌对多数抗生素较为敏感，但对大环内酯类及部分头孢类抗菌药物耐药。

研究结果为乌龟松鼠葡萄球菌感染的防治提供参考依据。

关键词：乌龟；松鼠葡萄球菌；分离鉴定；药敏特性分析DOI:10.3969/J.ISSN.1671-6027.2019.07.019基金项目：海南省自然科学基金项目（2019CXTD404、318MS046、20153086、314076）；国家自然科学基金项目（31502036）作者简介：方振华（1980~），男，副教授，研究方向：畜牧与兽医，E-mail：okay1688@。

★通信作者：丁利（1982~），女，副教授，研究方向：动物疾病诊断与防治。

洪美玲（1976~）,女，教授，研究方向：龟鳖动物生理生态。

图2分离菌16S rRNA PCR 结果表1分离菌株主要生化特性检测结果注：＋，阳性；-，阴性同时对其病原菌进行分离并鉴定。

1.2.5药物敏感性试验无菌条件下，将纯化菌液均匀涂布于LB 培养基，采用世界卫生组织推荐的纸片琼脂扩散法即Kirby-Barere 法贴上药敏纸片，于37℃培养24h 后，测量各抑菌环直径。

依据说明书上的判断标准判别分离菌株对所用药物的敏感程度。

2结果从患病乌龟体内分离的细菌，经纯化后，在普通营养琼脂平板培养基上普通营养琼脂平板上形成直径1～2mm 、不透明有光泽、表面湿润、边缘整齐、圆形凸起的菌落（如图1A ）。

在血琼脂平板上培养可形成表面粘稠，大而凸起，白色的菌落（如图1B ）；革兰氏染色结果可知，为革兰氏阳性菌，分离菌为球型，有的成葡萄串状排列，有的四个一起排列，有的单个散落，直径0.5～1μm 左右，（如图1C ）。

对分离菌进行生化试验，结果见表1。

由表1可知，该分离菌对葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、麦芽糖、果糖、触酶、氧化酶、硝酸盐还原反应呈阳性；对精氨酸双水解酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶、蜜二糖、棉子糖、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、尿素、V-P 试验呈阴性。

根据以上形态学观察和生化鉴定结果，初步鉴定该菌为松鼠葡萄球菌。

分离菌DNA 经16S rRNA 通用引物PCR 扩增后，获得约为1500bp 大小目的基因片段，与预期一致（图2）。

对其进行序列测定，结果经拼接后通过GenBank BLAST 分析，发现分离菌与GenBank 数据库中的松鼠葡萄球菌16S rRNA 基因序列同源性超过99%。

应用Mega 7.0软件对分离菌的16S rRNA 基因序列制作系统进化树，结果发现，本分离株与松鼠葡萄球菌聚为一支（图3），故鉴定此分离菌为松鼠葡萄球菌。

攻毒的第1～3d ，乌龟精神极差，不愿浮出水面；攻毒的第4～7d ，有5只死亡；对照组的6只乌龟无明显临床症状。

病死乌龟解剖后发现与自然发病龟的剖检变化相似，从其体内分离到的菌株经鉴定为松鼠葡萄球菌，说明分离菌对乌龟有较强的致病性。

分离菌对抗生素敏感性试验结果见表2。

由表2可知，该菌株对氨苄西林、头孢拉定、头孢噻吩、克林霉素、阿奇霉素、克拉霉素和罗红霉素等耐药；对头孢克罗中度敏感；对妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、链霉素、氧氟沙星、环丙沙星、四环素等均敏感。

3讨论目前可知，葡萄球菌属广泛分布自然环境中，在世界范围内均有其存在。

其中该属中有多种葡萄球菌对动物和人都有致病性，特别是对水产动物的危害巨大，常给水产养殖业造成严重的经济损失。

以往的研究多是集中在金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及猪葡萄球菌的感染和防治方面，但近几年来发现松鼠葡萄球菌也可使多种水生经济动物感染发病。

龟鳖养殖作为一个新兴的特色经济产业，近年来也有松鼠葡萄球菌感染的病例报道，例如其可感染并引起黄喉拟水龟发病。

本研究从患病乌龟中分离出的1株优势菌，通过16S rRNA 序列比对分析，发现该分离菌与松鼠葡萄球菌聚为一簇。

该分离菌株在普通营养琼脂平板上形成不透明有光泽、表面湿润、边缘整齐、圆形凸起的菌落，这与黎小正等在黄喉拟水龟体内分离出的松鼠葡萄球菌的培养特性基本一致。

同A ，分离菌在普通营养琼脂平板培养基上的生长形态；B ，分离菌在血平板培养基上的生长形态；C ，分离菌革兰氏染色形态(1000×)图1分离菌培养特性及形态观察2000bp 1000bp 500bp时该菌生化鉴定的结果也和其他动物的分离株相近，说明不同来源的松鼠葡萄球菌，其培养特性无明显差异。

研究发现松鼠葡萄球菌感染乌龟后，引起的临床表现和病理剖检变化和其他水生动物呈现相似的病症，如松鼠葡萄球菌感染的黄鳝鱼主要症状为伤口化脓、肛门红肿，解剖可见肝淤血、出血，肾出血及肠充血；黄喉拟水龟感染松鼠葡萄球菌后以背甲溃疡、肛门处红肿为主要症状，解剖可见肝淤血、出血等。

黄颡鱼感染后可见头部、肛门红肿，尾鳍溃烂，剖检可见肝脏肿胀、出血，肠充血，心脏淤血、出血等。

本研究发现感染松鼠葡萄球菌的乌龟精神沉郁，不食，基本不活动，背腹甲有溃疡灶。

剖检病理变化主要表现在肝脏肿大、淤血、出血，个别龟消化道有出血，病死率较高。

由此可见，松鼠葡萄球菌对水产动物具有较强的致病性，如果防治不当，也势必会给水产养殖业造成严重的经济损失。

本研究从乌龟体内分离的松鼠葡萄球菌的药敏特性分析显示，分离菌对多数头孢类和大环内酯类抗生素耐药，对妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、链霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、四环素等较为敏感，这与黎小正等从黄喉拟水龟分离出的松鼠葡萄球菌对于氧氟沙星、诺氟沙星、四环素、阿米沙星、庆大霉素、卡那霉素等抗生素耐药，而对于头孢拉定抗生素敏感有着较大的不同，这说明松鼠葡萄球菌在不同动物、不同环境以及不同条件下，分离出来的菌株对抗生素的敏感程度差异较大。

对这种差异还需进行更进一步、更细致的研究。

4结论本研究从患病乌龟体内分离出一株松鼠葡萄球菌，该菌对乌龟有较强的致病性，但该分离菌对多数抗生素较为敏感，对部分头孢类和大环内酯类抗生素等耐药。

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