结核分枝杆菌复活促进因子B的原核表达、鉴定和纯化

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结核分枝杆菌Rv3425蛋白的原核表达纯化及其血清学诊断价值

生技术通讯ｖ・ＬＥＩＴＥＲＳＩБайду номын сангаасＮＢＩＯＴＥＣＨＮ０ＬＣＧＹｌＶｏｌ・２４Ｎ。斗ｏ．・５３Ｓｅｐ．， … ２０ｌ３ｊＴＴｌ
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６５９
研究报告
结核分枝杆菌Ｒｖ３４２５蛋白的原核表达纯化及其血清学诊
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｃ３６ｃｎ＠１６３．ｃｏｎ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｏｂｔａｉｎｐｒｏｔｅｉｎＲｖ３４２５ｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｎｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｖａｌｕｅ
ｆｏｒｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｒｖ３４２５ｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲｆｒｏｍｇｅｎｏｍｅｏｆＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７ＲｖａｎｄｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ一２８ａｖｅｃｔｏｒ．ＡｆｔｅｒｐｌａｓｍｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．ＴｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｐｕｉｆｒｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎｄＥＬＩＳＡ．Ｒｅ－ｓｕｉｔｓ：ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＲｖ３４２５ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｆｏｒｍｏｆｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ９５％ａｆｔｅｒｒｅ —

3种结核分枝杆菌复活促进因子基因的克隆、原核表达与纯化鉴定

ＡＳＲＣ：ｏｅｐｅｓｎｕｉｈｅｅｎｏｉｅｕｃａｉｎｐｏｔｇｆｃｏ（ｐＢ）Ｄ（ｐＤ）ＥｒｆＢＴＡＴＴｘｒｓｄｐｒｙｔｅｇｎｓｃｄｎｒｓｓｉｔ－ｒｍｏｉａｔｒＢｒｆ，ｒｆ，（ｐＥ）ｏａｆｅｇｔｏｎｆ
ｉｔＥＴ３ａ＋）ｖｃｏ，ｈｎｔａｓｏｍｅｎｏＥｏｉＴｏ１．ｔｒｉｅｔｆｉｇｂｅｔｉｔｎｄｇｓｉｎａｄＤＮＡｅｕｎｉｇ。ｎｏｐ２（ｅｔｒｔｅｒｎｆｒｄｉｔｃｌｐ０Ａｆｅｄｎｉｙｎｙｒｓｒｃｉｉｅｔｎｏｏｓｑｅｃｎ
Ｍｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｏｉ，ｈｓｅｅｒｍｐｉｅｙＰＣＲｆｏｔｅｇｎｍｅｏ．ｕｅｃｌｓｓＨ３ＲｖｓｒｉａｄｃｏｅｃｂｃｅｉｍｅｃｌｓｓｔｅｅｇｎｓｗｅｅａｌｉｄｂｕｆｒｍｈｅｏｆＭｔｂｒｕｏｉｔａｎ，ｎｌｎｄ７
ｒｆｖ并获得了３种高纯度的重组蛋白，以后的深入研究奠定了基础。ｐＥ，为
关键词：核分枝杆菌；ｐ；隆；达；化结ｒ，克表纯中图分类号：３８９文献标识码：Ｒ７．１Ａ
Ｃｌｎｉｇａｒｋａｙｔｃｅｐｒｓｉｎｏｅｓｅｏｎｅｕｃｔｔｏ－ｏｎｎｄｐｏｒｏｉｘｅｓｏｆｇｎｅｎｃｄｉｇｒｓｓｉａｉｎｐｏｏｉｇｆｃｏｓｆｏｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｌｓｓａｔｕｉｉａｉｎｒｍｔｎａｔｒｒｍＭｃｂｃｅｉｍｕｅｃｏｉｎｄｉｓｐｒｆｃｔｏ

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

ｓｏｐｏｅｎｉｃｌｉｎｒｔｉｎＥ．ｏｉＢＩ２１，ｔ０８ｃｇｎｅｗａｍｐｌｉｄｂｈｅＲｖ６７ｅｓａｉｅｙＰＣＲｒｆｆｏｍｎｇｅｏｍｉＮＡｆＭＴＢ３ｃＤｏＨ７Ｒｖｓｒｉｔａｎ，ａｄｃｏｄｉｎｌｎｅｎｔｈｅｖｃｏｒｐＤ１一．Ｔｈｅ０８ｃｗａｕｂｃｏｄｉｏｔｘｐｒｓｉｎｖｅｔＩ３（）ａｔｒｉｎｔｆｉｇｂｙｒｓｒｃｅｎ— ｏｔｅｔＭ８ＴｎＲｖ６７ｓｓｌｎｅｎｔｈｅｅｅｓｏｃｏｒｐＥ＇２ａ＋、ｆｅｄｅｉｙｎｅｔｉｔｄｅｚｍｅｉｅｔｏｎａｙｓｄｇｓｉｎｄＤＮＡｅｅｉｇ．ＴｈｅｃｎｓｒｃｅｅｏｂｉａｌｓｉａｒｎｓｏｒｅｎｏＥｆｌＢＩ２，ａｄｅｐｅｓｄｓｑｕｎｃｎｏｔｕｔｄｒｃｍｎｎｔｐａｍｄｗｓｔａｆｍｄｉｔｏｉ１ｎｘｒｓｅ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ｏｓｒｃｈｆｅｐｅｓｏｌｓｄｏｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｏｉ，ａｄｔｘｒｓｎｕｉｙｔｅｆ — ＴｏｃｎｔｕｔｔｅＲｐＡｘｒｓｉｎｐａｍｉｆＭｃｂｃｅｉｍｕｅｃｌｓｓｎｏｅｐｅｓａｄｐｒｈｕｆ
赵善民，江鹰，赵勇，毛峰峰，张彩勤，晓雅，冰，长宏郭白师
摘要：目的构建结核分枝杆菌（ｃｂｃｒｕｕｅｃｌｓ，ＢｐＡ的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达、ＭｙｏａｔｉｍｔｂｒｕｏｉＭＴ）Ｒｆｅｓ并纯

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化崔克乐;李静;孙安源【摘要】目的构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.%Objective To construct the prokaryotic expression vector carrying Mycobacterium tuberculosis gene mmpL6 (rv1557), overexpress and purify the recombinant MmpL6 (Rv1557) protein in Escherichia coli (E. coli).Methods The DNA fragment of MmpL6 was amplified by polymerase chain reaction using the genomic DNA of Mycobacterium tuberculosisH37Rv strain as a template. The target gene was cloned into pET21b vector to construct the pET21b-MmpL6 expression plasmid, and then transformed into E. coli for protein expression. Recombinant protein expression was induced by isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and detected by SDS-PAGE combined with Western blot. The overexpressed MmpL6 protein was purified by Ni-affinity chromatography and gel filtration chromatography. Results The recombinant pET21b-MmpL6 plasmid was successfully constructed and the highest expressionlevel was obtained at 25 ℃ in Rosetta strain induced by IPTG. Conclusion The successful expression and purification of MmpL6 in E. coli lays the foundation for the further structure and function studies of the protein, and also provides clues to the design of anti-tuberculosis drugs targeting efflux pump proteins.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2018(053)001【总页数】6页(P40-45)【关键词】结核分枝杆菌;外排泵蛋白;原核表达;纯化;亲和层析【作者】崔克乐;李静;孙安源【作者单位】安徽医科大学附属省立医院检验科,合肥 230001;安徽医科大学生命科学学院牛物学教研室,合肥 230032;安徽医科大学附属省立医院检验科,合肥230001【正文语种】中文【中图分类】R378.91在转运蛋白的RND超家族中，MmpL家族蛋白已经成为研究棒状细菌细胞包膜相关功能的重要切入点[3-4]。

结核分枝杆菌RpfA蛋白的原核表达、鉴定和纯化

【摘
要】目的：构建结核分枝杆菌（ｙｏａｅｕｂｒｌｉＭＢ复活促进因子ＡＲｓｓｔｏ— ｒｏｎｃｒＡｐ）Ｍｃｂｃｒｍｔｅｕｓ，Ｔ）ｔｉｕｃｏｓ（ｅｃａｎｐｍｔｇｆｔ，Ｒｆ的ｕｉｔｉｏｉａｏＡ
原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达和纯化。方法：采用聚合酶链反应（Ｃ方法从结核分枝杆菌Ｈ７ｖ基因组ＤＡ中扩增ＰＲ）３ＲＮ出Ｒｆ基因（２ｂ）然后用双内切酶消化后，ｐＡ１２４ｐ，与同样酶消化的ｐＴ２ｄ（）载体连接，Ｅ３ａ＋转入大肠杆菌ＴｐＯ阳性克隆用ｏｌ；酶切和ＤＡ测序鉴定。测序正确后，Ｎ将重组质粒转化到的大肠杆菌Ｂ２Ｌ１中，ＩＴ经ＰＧ诱导，Ｔ由７启动子调控表达了ＲｆｐＡ蛋白；利用ＨｓｔｎｇｌＳｉ对表达蛋白进行鉴定，ｉａｉ～ｅｔｎ —ｇａ最后对目的蛋白进行纯化。结果：双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符，测序结果与文献报道一致。ＳＳＰＧ经Ｄ — ＡＥ分析和ＨｓｔｎｇｌＳｉ鉴定均发现６ｋｉａｉ— ｅｔｎ —ｇａ６ｕ处有特异性蛋白条带。结论：成功克隆并构建了ＲｆｐＡ基因的重组表达质粒ｐＴ２＋一ｐＡ，Ｅ３ｄ（）Ｒｆ并获得了高纯度的重组蛋白，为以后的深入研究奠定了基础。
维普资讯
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５０一６

重庆医科大学学报２００８年第３３卷第５期（ｏｒａｆｏｇｉｇＭｅｉａＵｎｅｓｔＯ８Ｖ１３Ｎｏ５Ｊｕｎｌｎｑｎｄｃｌｉｒｉ２０．ｏ．．）ｏＣｈｖｙ３

结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建

工程公司）；Ｎｉ－ＮＴＡ树脂（德国ＱＩＡＧＥＮ公司）；ＧＳＴ亲和层析系统（德国ＭＥＲＣＫ公司）；ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒（美国Ｐｉｅｒｃｅ公司）；淋巴细胞分离液、
９６孔ＥＬＩＳＰＯＴ试剂盒（北京达科为公司）；Ｔ — ＳＰＯＴ
ＴＢ结核试剂盒（英国ＯｘｆｏｒｄＩｍｍｕｎｏｔｅｃ公司）；
ห้องสมุดไป่ตู้
ＲＰＭＩ．１６４０培养基、ＡＩＭＶ培养基（美国ＧＩＢＣＯ公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；高速冷冻离心机（美国Ｓｉｇｍａ公司）。１．３重组表达质粒的构建及鉴定以结核分枝杆
・
查找抗酸杆菌、影像学检查、临床表现等，阳性率普遍偏低。ＥＬＩＳＰＯＴ是一种通过抗体捕获培养中的细
胞分泌的细胞因子从而定量检测细胞因子生成细胞的方法Ｊ。Ｔ — ＳＰＯＴ・ＴＢ是美国ＦＤＡ批准的２种干扰素释放试验（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇａｍｍａｒｅｌｅａｓｅａｓｓａｙｓ，
王晓玮，程筱雯，张焰，徐东芳，王东萍，韦薇，王庆，徐元宏
摘要以结核分枝杆菌ＣＦＰ１０、ＥＳＡＴ６蛋白原核表达、纯化体系为基础，建立稳定的ＥＬＩＳＰＯＴ方法；检测１６４份疑似结核患者标本的外周血ＥＬＩＳＰＯＴ，与临床诊断及Ｔ — ＳＰＯＴ・ＴＢ结果对比。表达所得重组蛋白浓度和纯度如下：ＣＦＰ１０为０．５ｍＳ／ｍｌ，８４％；ＥＳＡＴ６为４ｍＳ／ｍｌ，９８％。ＥＬＩＳＰＯＴ方法最佳实验条件为每孔细胞密度２Ｘ１０／孔，ＣＦＰ１０、ＥＳＡＴ６蛋白抗原浓度分别为１０ｇ／孔，细胞孵育时间２０ｈ。ＥＬＩＳＰＯＴ的灵敏度与特异度分别为８８．５０％、８２．３５％，检测结果与Ｔ —

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定杨巍;师长宏;赵佐庆;赵勇;江鹰【摘要】目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定.方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠.将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序.将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α.经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化.结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致.SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应.该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白.结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2010(026)010【总页数】4页(P953-956)【关键词】Ag85B;Hsp16.3;融合蛋白;原核表达;纯化【作者】杨巍;师长宏;赵佐庆;赵勇;江鹰【作者单位】第四军医大学实验动物中心,西安,710032;第四军医大学唐都医院实验外科;第四军医大学实验动物中心,西安,710032;第四军医大学唐都医院实验外科;第四军医大学实验动物中心,西安,710032;第四军医大学实验动物中心,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】R卡介苗(BCG)是目前唯一用于结核病(TB)预防的疫苗,但其保护效果不稳定。

结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64小鼠单克隆抗体制备、纯化及鉴定

结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64小鼠单克隆抗体制备、纯化及鉴定马荣;陈振;黑龙;赵志军;徐广贤;戈朝晖【摘要】目的应用细胞融合技术制备和鉴定抗MPB64单克隆抗体.方法采用重组目的蛋白pET32a-MPB64(680bp)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合.间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞,采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆,杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体,通过间接ELISA、Western Blot鉴定该单克隆抗体.结果通过杂交瘤技术获得10株可稳定分泌抗MPB64单克隆抗体的细胞株.以命名的“1A3”单抗细胞株进行腹水制备,经鉴定腹水效价＞1∶720000,经纯化抗体效价约为1∶720000,抗体浓度2.15mg·mL-1.结论成功制备和获得了抗MPB64单克隆抗体的细胞株,为MPB64单克隆抗体制备和鉴定奠定了基础.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2015(037)009【总页数】4页(P1013-1016)【关键词】结核分枝杆菌;MPB64;单克隆抗体;杂交瘤技术【作者】马荣;陈振;黑龙;赵志军;徐广贤;戈朝晖【作者单位】宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川750004;宁夏医科大学总医院检验科,银川750004;宁夏医科大学检验学院,银川750004;宁夏医科大学总医院骨科,银川750004【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1E-mail:**************MPB64蛋白是结核杆菌合成的一种分泌性抗原，其相对分子量为24kDa，是结核分枝杆菌复合群的一种标志蛋白。

我们前期研究中成功构建的MPB64 基因核苷酸序列测序结果与标准菌株H37RV 核苷酸(GenBank: AY208674．1)序列同源性为98.36%[1]。

结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化

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通５ Βιβλιοθήκη ５研究报告ｄｉ０９９．ｎ０９００．１．．ｏ１．６ｊｓ．０一０２０２４ｌ：３／ｓ１－２００１ｉ
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１ａｉｄｃｌＣｏｌｇ，ＧｕｎｘｄｃｌＵｎｖｒｉ，Ｎａｎｎ３０；２ｔｔｙＬｂｒｔｒｆＰｔｏｅｎ — ．ＢｓｃＭｅｉａｌｅｅａｇｉＭｅｉａｉｅｓｔｙｎｉｇ５０２１．ＳａｅＫｅａｏａｏｙｏａｈｇｎａｄＢｉ
［中图分类号］Ｑ８７
［献标识码］Ａ文
［章编号］１０ — ０２２１）４０１一４文０９００（０２０ — ５５－０
ＰｒｋａｙｔｃｏｒｏｉＥｘｅｓｏａＰｕｒｆｃｔｏｏ１－ｋＤａ￣ｐｒｓｉｎｎｄｉａｎｆ６ｉｉｃ－ＣｒｔｌｎｏｙｓａｌｉｆＭｙｏａｃｅｉｍｔｅｃｏｉｃｂｔｒｕｕｂｒｕｌｓｓ

结核分枝杆菌fbpB基因植物表达载体的构建及鉴定

结核分枝杆菌fbpB基因植物表达载体的构建及鉴定蔡群芳;邬强;刘珊;高新征;崔开媚;范志刚;熊燏【期刊名称】《海南医学院学报》【年(卷),期】2012(018)003【摘要】目的:构建结核分枝杆菌fbpB基因的植物表达载体,为在植物中表达该基因奠定基础.方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增fbpB编码基因,然后将其克隆到植物表达载体pBI121上,并进行鉴定.结果:重组载体经菌液PCR鉴定为阳性克隆后再经双酶切鉴定可见约13 kb和1 kb的2条特异性条带,与预期大小相一致,测序结果表明克隆的fbpB基因序列与Genbank上公布的相一致.结论:成功构建了fbpB基因的植物表达载体,为研制和开发新型的结核疫苗打下坚实的基础.【总页数】4页(P289-291,296)【作者】蔡群芳;邬强;刘珊;高新征;崔开媚;范志刚;熊燏【作者单位】海南医学院热带医学与检验医学院,海南海口 571199;海南医学院热带医学与检验医学院,海南海口 571199;海南医学院热带医学与检验医学院,海南海口 571199;海南医学院理学院,海南海口 571199;海南医学院热带医学与检验医学院,海南海口 571199;海南医学院热带医学与检验医学院,海南海口 571199;海南医学院热带医学与检验医学院,海南海口 571199【正文语种】中文【中图分类】Q784【相关文献】1.携带乙肝大包膜蛋白L基因与结核Esat6融合基因植物表达载体的构建及鉴定[J], 李君武;宫君原;刘鑫;叶秋萍;黄清华2.结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达载体的构建与鉴定 [J], 柏银兰;薛莹;王瑞;高辉;王丽梅;樊爱琳;徐志凯3.结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定 [J], 曹元应;房功思;孟德娣;汪学龙4.结核分枝杆菌突变gyrase A基因原核表达载体的构建与鉴定 [J], 赵明才;鲍朗5.结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定 [J], 曾林子;陈建平;刘成君;李红霞;姚卫;杨志荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

结核分枝杆菌的分子生物学鉴定

结核分枝杆菌的分子生物学鉴定结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起人类结核病的主要病原体，具有很高的传染性和致死率。

目前，结核病仍然是全球公共卫生问题，尽管已经有了许多有效的治疗方案，但是由于结核分枝杆菌的进化和抗药性的出现，人类与结核病之间的斗争仍然在进行。

结核分枝杆菌的种类很多，据估计约有150种，但其中只有少数能够感染人类。

因此，在进行结核病诊断和治疗时，需要对病原体进行准确鉴定。

传统鉴定方法主要基于形态学、生理化学和生物学特征等方面，但是这些方法往往需要很长时间，且存在误判的风险。

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，结核分枝杆菌的分子生物学鉴定技术逐渐成为一种快速、准确、可靠的鉴定方法。

分子生物学鉴定技术主要包括PCR、脱氧核糖核酸（DNA）序列分析和病原菌基因芯片技术等。

其中，PCR技术是最常用的方法之一。

PCR技术利用特异引物扩增病原体基因（一般选择16S rRNA和IS6110基因），然后通过凝胶电泳分离和检测，可实现对结核分枝杆菌的快速鉴定。

另外，PCR技术也可用于检测结核分枝杆菌的耐药性基因以及特定毒力因子等。

DNA序列分析是一种更加准确的结核分枝杆菌鉴定方法。

它利用PCR技术扩增目标基因，然后将扩增产物纯化、测序，并与基因序列数据库比对，确定结核分枝杆菌的种类和亚型等。

由于M. tuberculosis的基因组序列已经被测定，DNA序列分析对于对结核分枝杆菌的鉴定更为准确和可靠。

病原菌基因芯片技术是一种较新的结核分枝杆菌鉴定方法，它利用在晶片上固定的检测探针，可同时检测数以千计的病原菌基因（包括结核分枝杆菌和其他病原体），并通过计算机软件分析得出结果。

这种技术不仅可用于结核病诊断，还可以用于监测传染病病原体在不同地区的分布、病原体进化、抗药性的形成等方面的研究。

总之，分子生物学鉴定技术为结核病的诊断和治疗提供了更加快速、准确、可靠的解决方案。

结核分枝杆菌的微生物学诊断方法

结核分枝杆菌的微生物学诊断方法1.痰培养痰培养是最常用的结核分枝杆菌的诊断方法之一、患者的痰样本收集后，通过培养方法将痰中的结核分枝杆菌进行寻找和增殖。

常用的培养基有Löwenstein-Jensen（LJ）培养基和Middlebrook 7H10/7H11培养基等。

这些培养基具有选择性和富营养的特点，能够促进结核分枝杆菌的生长。

2.结核菌分离结核菌分离方法是从痰培养中分离出结核分枝杆菌的过程。

分离的目的是为了获得单纯的结核分枝杆菌株，以便进一步的实验室诊断和药敏试验。

结核菌分离主要采用传统的液体培养和固体培养方法。

液体培养常用的方法有BACTEC（双箱培养仪）等。

固体培养则是在含有大量鸡蛋黄LJ培养基上进行，结核菌形成典型的小、平、光滑、圆形的菌落。

3.结核菌鉴定结核菌鉴定是确认分离的菌株是否为结核分枝杆菌的过程。

传统的结核分枝杆菌鉴定方法包括形态学鉴定、生理生化试验和生物学特性等。

形态学鉴定主要通过显微镜观察菌落、细胞形态以及胞内结构等特征来进行鉴定。

生理生化试验可以通过菌株的生长特性、酶活性以及对物质的利用能力等进行鉴定。

最常用的生物学特性鉴定方法是结核菌分枝杆菌凯鲁氏吸收试验。

4.快速诊断试验随着生物技术的发展，出现了多种快速诊断试验，能够更加快速、准确地鉴定结核分枝杆菌。

其中最重要的是核酸放大技术，包括聚合酶链反应（PCR），逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），核酸杂交等。

这些技术通过放大结核菌DNA或RNA的特异性片段，可以快速、敏感地检测结核分枝杆菌，并对其进行分离和鉴定。

此外，结核分枝杆菌耐药性的快速检测也是常用的试验，如基于核酸放大的耐药基因检测和分子生物学方法。

总结起来，结核分枝杆菌的微生物学诊断方法主要包括痰培养、结核菌分离及鉴定，以及快速诊断试验。

这些方法在结核病的诊断和治疗中起着重要的作用，可以准确、快速地检测出结核分枝杆菌，并对其药敏性进行评估，以便合理选择治疗方案。

结核分枝杆菌MPB64抗原的制备与纯化

结核分枝杆菌MPB64抗原的制备与纯化作者：陈超来源：《医学信息》2014年第07期摘要：根据GenBank结核分枝杆菌基因序列设计引物扩增出MPB64基因，连接至原核表达载体pET32a（+），转化至大肠杆菌BL21（DE3），经过IPTG诱导后，进行SDS-PAGE 和Western-blot分析。

结果表明，克隆的MPB64基因同源率为98.36%，重组蛋白以可溶形式在细胞周质中表达，大小为24KDa。

采用切胶回收水平电泳洗脱纯化出的MPB64具有反应原性。

为进一步研究结核快速诊断试剂奠定了基础。

关键词：牛分枝杆菌；MPB64；原核表达；切胶纯化结核病（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis TB）引起的一种严重危害人民健康的慢性传染病，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）2012年的数据显示，世界总共有880万的结核病患者，相当于每10万人中就有138个结核病患者，我国2010年结核病死亡人数54000，新发现结核患者869092，复发人数54216，新患者中出现MDR-TB人数为49000，再次感染的患者出现MDR-TB人数为14000，结核患者中得HIV的人数为145919，HIV患者中出现结核的人数为65412，相对于2006年后呈现逐渐增加的趋势，每年用于结核的治疗费用也从2006年开始递增，2011年已经花费285百万美元，预计2012年将花费350百万美元。

结核菌素试验作为最古老的免疫学试验方法之一，仍然在使用，对于牛分枝杆菌的特异性抗原的筛选，仍然是诊断中的重点。

MPB64抗原是牛分枝杆菌的分泌性抗原，表现为较强的迟发型超敏反应，并可诱导产生和释放γ干扰素，且MPB64抗原对活动的牛结核的特异性为100%，敏感性为98.1%[1]，并且发现部分卡介苗菌株缺MPB64基因[2]，若此用其做皮试，可区分已患病、隐性感染未发病和己接种卡介苗的个体，故MPB64可能是最具有潜在应用价值的诊断试剂。

原核表达实验报告

原核表达实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过原核表达系统将目标蛋白在大肠杆菌中进行表达，并对其进行纯化和鉴定。

二、实验材料
1. 目标蛋白基因克隆质粒；
2. 大肠杆菌感受态细胞；
3. 抗生素（如氨苄青霉素）；
4. IPTG诱导剂；
5. SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒；
6. 蛋白质纯化试剂盒。

三、实验步骤
1. 大肠杆菌转化：将目标蛋白基因克隆质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，加入抗生素（如氨苄青霉素）筛选阳性克隆。

2. 诱导表达：将阳性克隆的大肠杆菌接种到含有IPTG诱导剂的培养基中，使其表达目标蛋白。

3. 收集菌体：培养一定时间后，收集大肠杆菌菌体。

4. 裂解菌体：将收集到的大肠杆菌菌体进行裂解，释放目标蛋白。

5. 纯化目标蛋白：使用蛋白质纯化试剂盒对目标蛋白进行纯化。

6. 鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析目标蛋白的表达情况和纯度。

四、实验结果与分析
1. 大肠杆菌转化结果：通过抗生素筛选，获得阳性克隆。

2. 诱导表达结果：在含有IPTG诱导剂的培养基中，目标蛋白得到了有效表达。

3. 菌体收集结果：成功收集到大肠杆菌菌体。

4. 裂解菌体结果：菌体裂解后，释放出目标蛋白。

5. 纯化目标蛋白结果：通过蛋白质纯化试剂盒，成功纯化了目标蛋白。

6. 鉴定目标蛋白结果：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，目标蛋白得到了高纯度的表达。

五、实验结论
本实验通过原核表达系统成功表达了目标蛋白，并通过纯化和鉴定获得了高纯度的目标蛋白。

这为进一步研究该蛋白的功能和应用提供了基础。

结核分枝杆菌Rv3621c原核表达及免疫功能研究

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安徽省高校自然科学研究重点项目(
No．KJ
２０１５A０９３,
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２０１６A２１１)
通讯作者:许礼发,
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结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定

结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定江鹰;尚淑琴;赵勇;毛峰峰;赵善民;张彩勤;师长宏【摘要】克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达.表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白.成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确.通过GST纯化系统获得36 kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应.成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据.%In order to clone the gene of Mycobacterium Tuberculosis fosters filtrate protein CFPlO.then express the culture filter protein of CFP10 in Escherichia. Coli BL21(E. Coli) and purify the expressed protein, the CFP10 gene was amplified from the genome of M. Tuberculosis H37RV by PCR and cloned into plasmid pMD18-T. The fragment sequenced correctly was subcloned into the expression vector pGEX-4T-l and expressed in E. Coli BL21. The expressed protein was identified by SDS-PAGE analysis and Western blot method, and subsequently purified it by GST-tag purification system. The gene of CFP10 was successfully cloned and expressed in E. Coli, and the expressed protein was identified correctly by SDS-PAGE analysis and Western blot analysis. The expressed protein had both the binding site of anti-CFPIO mAb and TB patient' serum. TheCFP10 was successfully expressed and purified, which provided material foundation for its pathogenic mechanism study.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2012(012)005【总页数】4页(P1017-1019,1029)【关键词】结核分枝杆菌;CFP10;表达;纯化【作者】江鹰;尚淑琴;赵勇;毛峰峰;赵善民;张彩勤;师长宏【作者单位】第四军医大学实验动物中心,西安710032;西安市疾病预防与控制中心,西安710032;第四军医大学实验动物中心,西安710032;第四军医大学实验动物中心,西安710032;第四军医大学实验动物中心,西安710032;第四军医大学实验动物中心,西安710032;第四军医大学实验动物中心,西安710032【正文语种】中文【中图分类】R378.911结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所致以呼吸道系统感染为主的慢性传染病，在我国结核感染人群或感染高危人群的流动性增加，以及人们对于结核杆菌感染认识的不足，致使结核杆菌感染有日益上升的趋势［1］。

结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用

结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用王晓玮;程筱雯;张焰;徐东芳;王东萍;韦薇;王庆;徐元宏【摘要】Building a stable method of ELISPOT by the expression and purification of the protein CFP10 and ESAT6 from mycobacterium tuberculosis. 164 suspected tuberculosis cases were checked by ELISPOT and T-SPOT ·TB with peripheral blood samples,compared with the clinical diagnosis. It was found that the concentration and purity of the recombinant ESAT6 were 0. 5 mg/ml,84%;the concentration and purity of recombinant of the CFP10 were 4 mg/ml, 98%. The most appropriate conditions of ELISPOT were 2 × 105/well as cell concentration, 10μg/well ESAT6/CFP10 recombinant protein as stimulus and 20 hours of incubation period. There was no statistically significant difference between ELISPOT and T-SPOT·TB(χ2 =0. 57).%以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比. 表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10 为0. 5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%. ELISPOT方法最佳实验条件为每孔细胞密度2 × 105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10 μg/孔,细胞孵育时间20 h. ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88. 50%、82. 35%,检测结果与 T-SPOT·TB 方法结果一致(χ2 =0. 57).【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2015(050)009【总页数】5页(P1347-1351)【关键词】结核病诊断;γ-干扰素;ELISPOT;CFP10;ESAT6【作者】王晓玮;程筱雯;张焰;徐东芳;王东萍;韦薇;王庆;徐元宏【作者单位】安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥 230022;安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥 230022;安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥 230022;安徽省胸科医院检验科,合肥 230022;安徽省胸科医院检验科,合肥 230022;安徽省胸科医院检验科,合肥 230022;安徽省胸科医院检验科,合肥 230022;安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥 230022【正文语种】中文【中图分类】R446-61结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用王晓玮1，程筱雯1，张焰1，徐东芳2，王东萍2，韦薇2，王庆2，徐元宏1作者单位：1安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥 2300222安徽省胸科医院检验科，合肥 230022作者介绍：王晓玮，女，硕士研究生；徐元宏，男，教授，硕士生导师，责任作者，E mail：xy hong1964＠163．com摘要以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础，建立稳定的ELISPOT方法；检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT，与临床诊断及T SPOT·TB结果对比。

重组结核杆菌热休克蛋白Acr2的原核表达、纯化及鉴定的研究

重组结核杆菌热休克蛋白Acr2的原核表达、纯化及鉴定的研究陈勇;陈竹;张奇声;左益亮;张灿;李子昂;陈乔;夏惠【摘要】Objective To prokaryotically express and purify the protein Acr2 of Mycobacterium tuberculosis and identify its immunoreactivity.Methods The Acr2 gene was amplified by PCR,and the recombinant plasmidsPET22b-Acr2 was constructed and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells.Expression of the recombinant plasmid was induced with IPTG.Then the expressed products were purified with Ni-NTA affinity chromatography column,and Western blotting was performed to determine the immunoreactivity of the recombinant protein Acr2.Results PCR,double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant plasmid PET22b-Acr2 was successfully constructed,and the target protein was primarily expressed in inclusion body inE.coli.Recombinant protein Acr2 was obtained by the renatured inclusion body that was purified by Ni-NTA affinity chromatography,with molecular weight of about 18.3 ku,which was consistent with the theoretical molecular weight of M.tb Acr2 protein.Western blotting verification indicated that the recombinant protein was able to be recognized by specific serum antibodies from pulmonary tuberculosis patients.Conclusion Successful prokaryotic expression and construction of PET22b-Acr2 plasmid as well as expression and purification of the recombinant Acr2 protein may lay a basis for further study on the biological function of Acr2protein.%目的原核表达、纯化结核杆菌热休克蛋白Acr2分子,并分析其免疫反应性.方法采用PCR法扩增结核杆菌Acr2基因,并构建重组表达质粒PET22b-Acr2,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,并用IPTG诱导Acr2蛋白表达.以及使用镍离子亲和层析柱纯化该表达产物,并通过Western blot检测其免疫反应性.结果 PCR、双酶切和测序结果均表明PET22b-Acr2重组质粒构建成功,其在大肠埃希菌中主要以包涵体蛋白形式进行表达.复性后的包涵体蛋白经镍离子亲和层析柱纯化后,可获得纯化的Acr2重组蛋白,该重组蛋白分子质量约为18.3ku,与结核分枝杆菌Acr2蛋白的理论预测值相符.经Western blot检测显示该重组蛋白能被结核病人血清特异性识别.结论原核表达质粒PET22b-Acr2被成功构建,以及Acr2重组蛋白被有效进行表达和纯化,从而为进一步研究其生物学功能奠定了基础.【期刊名称】《热带病与寄生虫学》【年(卷),期】2017(015)003【总页数】5页(P131-135)【关键词】结核分枝杆菌;热休克蛋白;Acr2;原核表达;纯化【作者】陈勇;陈竹;张奇声;左益亮;张灿;李子昂;陈乔;夏惠【作者单位】233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院病原生物学教研室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院感染与免疫安徽省重点实验室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院病原生物学教研室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院病原生物学教研室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院病原生物学教研室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院病原生物学教研室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院病原生物学教研室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院病原生物学教研室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院病原生物学教研室;233030安徽蚌埠市,蚌埠医学院感染与免疫安徽省重点实验室【正文语种】中文结核病(Tuberculosis,TB)目前仍是我国重要的传染病之一。