第8章 荧光免疫技术
绪论思考题
思考题绪论1. 免疫应答主要分为哪几个阶段？2.中枢免疫器官对免疫细胞的发育起什么作用？3.外周免疫器官主要由哪些组织与器官组成？在免疫应答中发挥什么作用？淋巴细胞、B淋巴细胞与NK细胞的主要功能分别是什么？5.补体系统的主要激活途径有何不同6.免疫辅助细胞在特异性免疫应答中发挥什么作用？7.7.临床免疫学主要的研究方向是什么？8.8.免疫学检验可分为几个部分？9.9.临床免疫学及免疫检验在移植免疫、肿瘤免疫中的意义。
10.10.现代免疫学技术包括了哪些方法？第二章抗原抗体反应1．什么是抗原抗体反应？抗原抗体反应的原理是什么？2．抗原抗体的结合力有哪些？3．抗原抗体反应有哪些特点？4．如何理解抗原抗体反应的特异性和交叉反应？5．什么是抗原抗体反应的可逆性？有何应用？6．如何理解抗原抗体反应的亲和力和亲合力？7．抗原抗体反应体系中为何要确定抗原、抗体的最适比例？8．抗原抗体反应有哪些影响因素？9．基于抗原抗体反应的免疫学检测技术有哪些？10．什么是标记免疫技术？标记免疫技术有哪些类型？第三章免疫原和抗血清的制备1．什么是免疫原？2．如何制备可溶性抗原？3．常用的细胞破碎方法有哪些？4．连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方法有哪些？5．纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？6．什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的作用机制有哪些？7．什么是抗血清？什么是多克隆抗体？8．如何制备抗血清？9．动物采血有哪些方法？10．抗血清的鉴定包括哪些内容？第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备1．杂交瘤技术是如何问世的？其基本原理是什么？2．什么是单克隆抗体？其特性和局限性如何？与多克隆抗体有何异同？3．杂交瘤细胞的克隆方法有哪些？4．细胞株冻融的原则是什么？5．大量制备单克隆抗体的方法有哪些，各有哪些优缺点？6．单克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些？7．叙述单克隆抗体的制备流程和应用。
8．叙述基因工程抗体的概念和优点。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第八章 荧光免疫技术
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第八章荧光免疫技术（附答案解析）1、荧光效率的决定因素是（）A、荧光素本身特性B、激发光波长C、激发光强度D、环境因素E、温度2、FITC的吸收波长为（）A、495nmB、520nmC、570nmD、450nmE、360nm3、荧光素发射荧光属于（）A、光照发光B、化学发光C、生物发光D、电化学发光E、偏振光4、纯化荧光素标记抗体时，去除游离荧光素可采用的方法是（）A、盐析法B、离子交换层析C、亲和层析D、透析法E、活性炭吸附5、下列何种方法的灵敏度最高（）A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法6、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法7、为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行对照试验。
下列选项中不必要的（）A、替代对照B、吸收试验C、阴性对照D、阳性对照E、补体对照8、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是（）A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜9、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是（）A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿10、荧光效率是（）=A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠（）A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力12、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对13、荧光免疫技术中，间接法所使用的第二抗体可以是（）A、抗种属特异性IgA荧光抗体B、抗种属特异性IgG荧光抗体C、抗种属特异性IgM荧光抗体D、以上都正确E、以上都不正14、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对15、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法16、实验本身即可避免内源性非特异性荧光干扰的检测方法为（）A、时间分辨荧光免疫测定B、荧光偏振免疫测定C、荧光酶免疫测定D、直接荧光抗体染色法E、间接荧光抗体染色法17、下述间接法描述不确切的是（）A、第一抗体为针对抗原的特异性抗体.B、第二抗体为荧光标记抗体，是针对第一抗体的抗抗体C、可用于检测抗原，也可用于检测抗体D、操作简便，特异性高E、可以用于多种抗体的检测18、下列有关间接荧光法的叙述错误的是（）A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测19、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外（）A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒20、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是（）A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光21、下列不符合荧光素标记免疫技术直接法的描述是（）A、荧光抗体直接加于标本上B、常用于抗核抗体的检测C、每检查一种抗原需制备特异的荧光素标记抗体D、灵敏度偏低E、特异性高，非特异荧光染色因素少22、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法（）A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法答案部分1、【正确答案】 A【答案解析】荧光效率的决定因素是荧光素本身特性。
08第八章 荧光免疫技术
第八章
荧光免疫技术
一、CLSM的工作原理
激光束经照明针孔形成点光源，对标本内焦 平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探 测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管逐点 或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧 光图像。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
二、CLSM的参数
仪器的参数有：①物镜；②激光功率； ③激光扫描程度；④探测针孔；⑤光电倍增
换层析法;
(3)去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固
相抗原吸收。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
5. 荧光素标记抗体的鉴定 荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特
异性、抗体抗体特异性染色滴度。
6. 荧光记抗体的保存
加入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免
反复冻融，-20℃冻存可保存1~2年，真空干燥 后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。
以及生物素、抗生物素蛋白法免疫芯片、细胞免疫
芯片。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
1.液体芯片 一种免疫芯片与流式细胞术相结合的新技术。
将微小的乳胶颗粒（5.6um）用荧光染色的方法
进行编码，每种颜色的微粒代表一种检测标志物， 把针对不同检测物的彩色编码微粒混合后加入微 量病人标本，在悬液中靶分子与微粒进行特异性 地结合，通过激光流式仪判定后由电脑以数据信 息的形式记录下来。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
FITC的衬比染色或双标记FAT， 也可单独采用 可与FITC共用488nm激发光双标 记FAT、流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 DNA染色 双激光管的仪器分析 时间分辨荧光免疫测定
最新初级检验士考试(临床免疫学和免疫检验)练习题第八章荧光免疫技术资料
第八章荧光免疫技术一、A11、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜2、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿3、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒4、下列何种方法的灵敏度最高A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法5、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法6、免疫荧光技术的基本原理是A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对7、下列有关间接荧光法的叙述错误的是A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测8、荧光效率是（）。
A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率9、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光10、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力答案部分一、A11、【正确答案】D【答案解析】组成荧光显微镜的结构中，只有目镜与普通光学显微镜相同。
临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
①能与蛋白质共价结合，结合蛋白质后不易解离，而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除
②荧光效率高 ③荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 ④结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫
离心
抗体溶液
②透析法：蛋白质含量低，样品体积小。
优点：标记均匀，非特异性荧光低。 缺点：时间长，荧光素用量多
TITC 抗体溶液 反应过夜
PBS
FITC标记 的抗体溶液
③ 影响因素
温度和时间： pH：8.8～9.5 蛋白含量：20 ～25mg/mL蛋白为宜 荧光素的纯度：不应低于75%
四、 荧光标记抗体的纯化
常用于双重标记或对比染色；
激发峰和荧光距离较大，易于选择滤光系统。
(4)藻红蛋白（ PE） 最大吸收光谱: 565nm 。 最大发射光谱: 575nm 。 荧光颜色: 橙色。 应用：
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 铕(Eu3+)（应用最广）、 铽(Tb3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
学活性，而且标记方法简单、快速，结合物稳 定，易于保存。 ⑤安全无毒，不具有附加的抗原性。
2、常用的荧光色素： (1)异硫氰酸荧光素(FITC） 最大吸收光谱: 490-495nm 。 最大发射光谱: 520-530nm 。 荧光颜色: 黄绿色。 应用最广：
免疫荧光原理
免疫荧光原理
免疫荧光技术是一种用于检测和定量细胞或组织中特定蛋白质的方法。
它利用免疫学和荧光显微镜技术相结合，通过特异性抗体与特定抗原结合的方式来实现对目标蛋白质的定位和检测。
免疫荧光技术在生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域具有广泛的应用。
免疫荧光原理的核心是抗体的特异性结合。
抗体是免疫系统产生的一种特异性蛋白质，它能够识别和结合到特定的抗原上。
在免疫荧光技术中，首先需要使用一种特异性的初级抗体与待检测的蛋白质结合。
然后，再加入荧光标记的二抗（即与初级抗体相结合的抗体），使其与初级抗体结合。
最后，利用荧光显微镜观察标记了荧光物质的抗体在细胞或组织中的分布情况，从而实现对目标蛋白质的定位和检测。
在免疫荧光技术中，荧光标记的抗体起着至关重要的作用。
荧光标记的抗体能够发出特定波长的荧光，使得目标蛋白质在显微镜下呈现出明亮的荧光信号。
通过观察这些荧光信号的强度、位置和分布情况，可以对目标蛋白质进行定量和定位分析。
免疫荧光技术具有高度的特异性和灵敏度，能够检测到极低浓度的蛋白质，并且能够对蛋白质在细胞或组织中的定位进行精确的分析。
因此，它被广泛应用于细胞生物学、分子生物学、免疫学、肿瘤学等领域。
在临床诊断中，免疫荧光技术也被用于检测患者血清中的特定抗体，以辅助疾病的诊断和监测。
总的来说，免疫荧光技术是一种高度特异性和灵敏度的蛋白质检测方法，具有广泛的应用前景。
随着生物医学技术的不断发展，免疫荧光技术也将在越来越多的领域发挥重要作用，为科学研究和临床诊断提供有力支持。
免疫荧光技术（immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术
免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。
始创于40年代初，1942年coons等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。
主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
一、实验的基本原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。
由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验方法1、直接法这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。
滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。
标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。
此法的优点是简单、特异。
但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。
图一、直接免疫荧光法原理示意图2、间接法根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体(简称标记抗抗体)的方法。
检测过程分为两步：第一次，将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。
第二，滴加标记抗抗体。
如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。
此法的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。
医学免疫学荧光免疫技术资料
荧光(yíngguāng)抗体
• 荧光抗体(kàngtǐ)染色技术中常用的标记荧光物质
异硫氰酸荧光素 （FITC）
最大吸收 (xīshōu)波长
495nm
最大发射波长 525nm，黄绿色
四乙基罗丹明 （RB200）
570nm
595nm，红色
四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC）
550nm
的荧光 • 非特异性荧光 • 背景荧光 • 洗涤不彻底，荧光抗体非特异性吸附
第九页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体染色法
• 技术类型 • 直接法 • 间接(jiàn jiē)法 • 补体结合法 • 双标记法
第十页，共18页。
• 原理(yuánlǐ)
直接(zhíjiē)法
荧光 荧光抗体
待测标本
第三页，共18页。
基质(jī zhì)片
• 将标本固定在玻片上而形成，含有已知或待测抗原 • 根据标本来源不同可分为 • 组织印片、组织切片(qiē piàn)、细胞涂片、细菌涂片 • 制备好的基质片应尽快染色或置－20℃保存
第四页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体
• 用化学的方法将荧光物质共价连接在抗体上而形成 • 荧光的基本知识 • 自然界某些物质能从外界吸收(xīshōu)能量（光能、化学能），
基本概念
• 抗原抗体反应具有高度特异性
• 荧光物质的检测具有灵敏性和直观性
• 荧光免疫技术是将两者有机的结合起来
• 将荧光物质与抗原（抗体）连接(liánjiē)，形成荧光标记物
• 再与相应的抗体（抗原）发生反应，检测反应体系中的荧光 强弱及存在部位用于物质的定性、定量、定位检测
• 按技术原理及用途分为
第八章荧光免疫技术
第八章荧光免疫技术FluoreSCenCe ImmunoaSsay第一部分目的要求和教学内容一、目的要求掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。
二、教学内容1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。
2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。
3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。
第二部分测试题一、选择题(一)单项选择题(A型题)1.如下有关荧光免疫技术正确的提法A．直观性检测抗原和抗体B．直观性检测抗原C．直观性检测抗体D．间接检测抗原或抗体E．间接检测抗原和抗体2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度A．10～15℃B．15～20℃C．20～25℃D．25～30℃E．30～35℃3．荧光抗体保存3～4年，应选择A．小量分装、4℃B．瓶分装、4℃C．瓶分装、-10℃D．瓶分装,-20℃E．小量分装、-20℃4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A．光源B．聚光器C．目镜D．物镜E．滤光片5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型A．直接法B．夹心法C．间接法D．补体法E．双标记法6．荧光抗体染色标本的观察时间A．当天B.第二天C．第三天D．1周内E．5天7．荧光抗体闭接法应标记A．抗原B．抗体C．补体D．抗抗体E．抗体及补体8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是A．直接法B．间接法C．双抗体夹心法D．补体法E．双标记法9．荧光抗体间接法可检测A．抗原B．抗体C.补体D．蛋白质E．抗原和抗体lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是A．抗原荧光染色B．抗体荧光染色C．补体荧光染色D．特异性荧光染色E．非特异性荧光染色11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术A．荧光偏振免疫测定B．荧光免疫显微技术C．时间分辨荧光免疫测定D．底物标记荧光免疫测定E．流式荧光免疫技术12．临床药物浓度检测的首选方法A．时间分辨荧光免疫测定B．荧光偏振免疫测定C．荧光免疫显微技术D．流式荧光免疫技术E．底物标记荧光免疫测定13．最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素(Eu)14．去除过度标记的荧光抗体最好用A.搅拌法B.透析法C.盐析法D.凝胶过滤法E.离子交换层析法15．目前使用最广泛的荧光色素为A.FITCB.RB200C.TRITCD.R-REE.Eu3+16．免疫标记技术中发展最早的技术是A.酶免疫技术B.同位素标记的免疫技术C.化学发光免疫技术D.荧光免疫技术E.免疫金银技术17．作为荧光抗体标记的荧光物质必须具备的条件中，与提高观察效果有关的是A.必须有活性化学基团B.性质稳定C.荧光效率高D.不影响蛋白质的活性E.标记方法简便快速18．决定荧光效率的因素主要是A.物质本身的物理特性B.激发光的波长C.激发光的强度D.溶剂pHE.溶剂极性19．荧光显微镜光路形式为A 衍射光、落射光B.折射光、透射光C. 透射光、落射光D.折射光、衍射光E .散射光、衍射光20．RB200产生的荧光色泽为A.橘红色B.黄绿色C.蓝紫色D.天青色E.褐黑色21．落射式荧光显微镜的吸收滤片应安装在A.激发滤片与分色镜之间B.分色镜与目镜之间C.物镜与分色镜之间D.物镜与载玻片之间E.光源与激发滤片之间22．能用于抗原定位检测的实验为A.直接法荧光抗体染色B.TRFIAC.荧光偏振免疫分析D.ELISAE.免疫比浊分析23．间接法荧光抗体染色与直接法相比,优点为A.非特异性荧光染色少B.操作更简便C.可用于抗原的定位检测D.可用于抗原定性检测E.检测不同的抗原,只需制备一种荧光抗体24．荧光免疫技术中,应用最广泛的金属元素为A.TbB.CeC.EuD.AuE.Zn25．关于直接法荧光抗体染色的特点,错误的是A.简单易行,特异性高B.敏感度偏低C.非特异性荧光染色因素少D.可检测抗原及抗体E.每检测一种抗原需制备一种相应的荧光抗体26．临床常用的荧光猝灭剂不包括A.亚甲蓝B.甲基红C.碱性复红D.伊文思蓝E.碘溶液27．荧光显微镜观察时的注意事项错误的是A.暗室内观察B.染色后标本立即观察C.37℃观察,效果最好D.不宜长时间观察一个视野E.宜用无荧光镜油28．荧光显微镜与普通光学显微镜的不同之处错误的是A.光源B.滤片C.聚光镜D.电源E.镜头29.不宜用于荧光抗体染色的标本是A.血涂片B.肝印片C.肿瘤切除物切片D.细菌涂片E.尿液30.下述物质不是荧光色素的是A.异硫氰酸荧光素B.四乙基罗丹明C.四甲基异硫氰酸罗丹明D.四甲基伞酮-β-D半乳糖苷E.藻红蛋白(二)多项选择题(x型题)1．对荧光标记物影响的因素有A．pH、温度B．溴化物、碘化物等杂质C．荧光素的浓度D．细胞固定剂E．化合物2．常用的荧光素是指A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素(Eu2+)3．有关荧光显微技术中制作组织标本过程要求A．尽量保持抗原完整性B．切片尽量薄C．用丙酮或乙醇固定D．制好的标本尽快染色E．制好的标本无法及时染色，应置-20℃下低温干燥保存4．荧光免疫显微技术在临床可用于A．血清中自身抗体的检测B．各种微生物的快速检查和鉴定C．寄生虫感染的诊断D．白细胞分化抗原的检测E．HLA分型检测5．荧光显微技术在组织学检查中具有如下优点A．抗原或抗体的定位B．抗原或抗体的定性检查C．抗原抗体反应的高度特异性D．荧光标本能持久保存E．能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强6．间接荧光免疫法的优点是A．敏感性高于直接法B．制备一种荧光抗体即可检测多种抗原或抗体C．操作时间较短D．不易出现非特异荧光E．反应参与的因素多二、填空题1．荧光免疫技术的主要类型包括()和()。
第八章 荧光免疫技术荧光免疫技术
双抗原夹心法
固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相 抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行 酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。
荧光酶免疫测定
方法类型
固相抗原竞争法
待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤 除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留 下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原 含量成反比。
均相荧光免疫测定
（homogeneous fluorescence immunoassay）
非均相荧光免疫测定
（heterogeneous fluorescence immunoassay）
荧光免疫测定的方法类型
非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：
荧光偏振免疫测定
去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法
去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收
荧光抗体的制备
荧光抗体的鉴定
荧光素与蛋白结合率：
F/P=
2.87 A495nm A280 nm 0.35 A495nm
抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
第三节 荧光免疫分析的类型
荧光免疫分析的基本原理
将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合， 用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧
光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行
定量测定。
荧光免疫技术的类型
荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光抗体技术 荧光免疫技术 荧光免疫测定
时间分辨荧光免疫测定
关于荧光免疫技术详细介绍
关于荧光免疫技术详细介绍荧光免疫技术是一种基于抗体-抗原反应原理的分析方法，利用荧光染料标记的抗体或抗原与靶标结合后，通过测量荧光信号的强度来检测和定量分析靶标物质。
荧光免疫技术的原理主要包括标记物准备、信号检测和结果分析三个方面。
首先，需要将抗体或抗原与荧光染料标记结合，一般通过共价键合、生物素-链霉亲和素体系或其他化学反应进行标记。
标记物的选择应该满足荧光发射波长范围广、发射光强、稳定性好等要求。
然后，标记物与待检测样品中的靶标物质结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，通过荧光检测仪器，测量荧光信号的强度，并将其转化为定量结果。
荧光免疫技术具有以下优势：首先，荧光信号强度大，可以实现高灵敏度的检测。
其次，荧光染料具有多样化的波长特性，可以实现多通道的同时测量。
此外，荧光免疫技术还具有选择性高、重复性好、灵敏度高、分析速度快、自动化程度高的特点。
荧光免疫技术在医学、生物学和环境监测等领域有广泛的应用。
在医学上，荧光免疫技术可以用于疾病的早期诊断和预防，如肿瘤标记物检测、感染病原体的检测和体液中特定蛋白质的定量等。
在生物学研究中，荧光免疫技术可以用于检测细胞和分子的定位、定量和相互作用等。
在环境监测中，荧光免疫技术可以用于检测污染物、重金属和有害物质等。
衡量荧光免疫技术的指标主要包括检测灵敏度、检测限、特异性、线性范围、准确性和重现性等。
检测灵敏度是指该技术能够检测到的最低浓度，一般以荧光信号的强度来表示。
检测限是指能够可靠地检测到的最低浓度，一般是指信号与噪声之间的差异。
特异性是指该技术与其他分子之间的交叉反应能力。
线性范围是指该技术在一定浓度范围内与浓度之间的线性关系。
准确性是指该技术的结果与真实值之间的接近程度。
重现性是指该技术在相同条件下的重复实验结果的一致度。
在实际应用中，荧光免疫技术还可以与其他技术相结合，如酶标记技术、化学发光技术等，以扩大分析范围和提高灵敏度。
同时，随着荧光探针和检测仪器的不断发展，荧光免疫技术将会不断创新和完善，为医学和生物科学研究提供更多的选择和便利。
免疫荧光技术PPT课件
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
荧光免疫湿法
荧光免疫湿法
原理
荧光免疫湿法的原理基于抗体对特定蛋白质的识别和结合，以及荧光染料对抗体-蛋白质
复合物的检测。
当抗体与特定蛋白质结合时，可以使用一种荧光标记的二抗来与抗体结合。
一旦形成荧光标记的二抗-抗体-蛋白复合物，就可以用荧光显微镜来观察和定位。
应用
荧光免疫湿法在生物医学研究中有广泛的应用。
它可以用来研究细胞信号通路、蛋白质相
互作用、细胞器结构和功能等。
在临床诊断中，它可用于确定患者体内的肿瘤标志物、病
原体和自身抗体等。
优势
与传统的免疫组织化学相比，荧光免疫湿法具有许多优势。
首先，它可以提供更高的灵敏
度和特异性。
其次，它可以用于多标记实验，即同时检测和定位多种蛋白质。
此外，荧光
显微镜可以提供更多的信息，如蛋白质的定位和表达水平。
挑战和解决方案
然而，荧光免疫湿法也存在一些挑战。
例如，荧光信号可能被周围背景干扰所掩盖，导致
定量数据的准确性下降。
这可以通过合适的荧光标记物的选择和优化染色条件来解决。
另
一个挑战是共聚焦成像技术的高成本和技术要求。
但随着技术的不断进步，这些挑战可能
会得到缓解。
总结
荧光免疫湿法是一种强大的生化技术，具有许多优势和应用潜力。
随着生物医学研究的不
断发展，它将继续发挥重要作用，并为疾病的诊断和治疗提供新的途径。
希望本文对读者
理解荧光免疫湿法的原理和应用有所帮助。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。
标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。将装有待标记 蛋白的透析袋放入含荧光素的buffer中。标记比较匀， 非特异染色 较低。
荧光抗体的制备
称为荧光淬灭。
（如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等）
荧光淬灭是由于激发态电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。
荧光的基本知识
荧光偏振
FH－FL P＝────── FH＋FL
P：偏振度 FH：激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度 FL：上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度
复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检
测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。
荧光抗体技术的内容
荧光抗体制备 标本制作 荧光抗体染色 荧光显微镜检查
一、荧光抗体的制备
抗体要求
高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG (抗血清)
荧光抗体的制备
荧光素要求
有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解
第八章
荧光免疫技术
第一节 概述 一、荧光的基本知识 二、荧光物质
第二节 荧光抗体技术 一、荧光抗体的制备 二、标本的制作 三、荧光抗体染色与结果判断 四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 一、时间分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振免疫测定 三、荧光酶免疫测定
第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 一、荧光抗体技术的应用 二、荧光免疫测定的应用
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
此外，还有荧光底物，如4-甲基伞酮磷酸盐、 4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷、对羟基苯乙酸。
第二节 荧光抗体技术
（Fluoresence Antibody Technique,FAT）
荧光抗体技术的基本原理
荧光素标记抗体与切片中组织/细胞抗原反应，
洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体
间接荧光抗体染色法示意图
荧光抗体染色及结果判断
双标记法
两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，与 同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。反应 原理同直接法。 该法用于检测同一标本内的两种抗原。（流式）
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型， 阳性细胞的显色深浅可作为抗原定性、定位和定量的依据。
落射荧光显微镜光路(b)
光源、光路、激发滤光片、聚光镜等适宜组合，才能在黑色背景上获得满意的荧光。
第三节 荧光免疫分析的类型
荧光免疫分析的基本原理
将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合， 用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧
光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行
定量测定。
荧光免疫技术的类型
方法类型
双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法
时间分辨荧光免疫测定
方法类型
双抗体夹心法
固相抗体和Eu3+标记抗体与 待检抗原结合，形成固相抗 体-待检抗原-Eu3+标记抗体 复合物，酸性增强液下， Eu3+解离，340nm激发光下发 射613nm荧光。 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图
荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光抗体技术 荧光免疫技术 荧光免疫测定
均相荧光免疫测定
（homogeneous fluorescence immunoassay）
非均相荧光免疫测定
（heterogeneous fluorescence immunoassay）
时间分辨检测原理示意图
时间分辨荧光免疫测定
基本原 理
stokes位移
stokes位移:激发光谱和发光谱的波长差。
Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。
镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠。
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
发射光谱和激发光谱
荧光抗体的纯化
去除游离荧光素：透析或凝胶过滤（如G50，第1峰为结合峰，第2峰为荧
光素峰）
去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法
（未结合荧光素的抗体 荧光标记合适的抗体 过量结合的抗体（阴离子较多），收集中间段）
去除非特异反应抗体：动物肝粉吸收(最好是与试验标本同种的动物脏器)
荧光抗体的制备
样品发射荧光的强度，即荧光物质的发射光波长谱。
激发光谱：是指固定检测发射波长，用不同波长的激
发光激发样品记录的相应的荧光发射强度，即能激发 荧光物质产生荧光的激发光波长谱。
荧光的基本知识
荧光效率
定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率
计算公式: 荧光效率=
发射荧光的光量子数（ 荧光强度） 吸收光的光量子数（激 发光强度）
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
信号增强
Eu3+标记抗原 抗体复合物
酸性增强液
Eu3+解离
结合β-二酮体
荧光增强
时间分辨荧光免疫测定
常见荧光物质的荧光寿命
标记物
镧系元素
铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+)（te） 钕(Nd3+) 镝(Dy3+)
荧光物质 非特异荧光背景 人血清蛋白 球蛋白 细胞色素C FITC 丹黄酰氯
思考题 小结
第一节 概 述
一、荧光的基本知识
荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时，以波长大于激发 光波长的发射光形式释放出能量，此发射光称为荧 光。
荧光的基本知识
发射光谱和激发光谱
发射光谱：是指固定激发波长，在不同波长下记录的
利用一定波长的激发光对 样品进行激发，产生一定波长 的荧光，对样品结构或其组分 进行定性、定位、定量观察检 测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯
滤光片：隔热、激发和吸收滤光片
光路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器
镜头：消色差镜头 、复色差镜头、氟处理镜头
时间分辨荧光免疫测定
方法类型
固相抗体竞争法
荧光寿命(ns) 荧光物质 1～10 4.1 3.0 3.5 4.5 14 Sm3+ -β-NTA Sm3+-PTA Eu3+-β-NTA Eu3+-PTA Tb3+-PTA Dy3+-PTA
荧光寿命(ns) 65000 60000 714000 925000 96000 1000
罗丹明B
3.0
镧系元素离子在游离状态下，荧光信号很弱，只有与适当螯合剂形成螯合物 后，可使荧光得到增强，而螯合物的荧光寿命与形成螯合物的配位体有关。 NTA:萘甲酰三氟丙酮; PTA：三甲基乙酰三氟丙酮
印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织
涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞
标本的制作
组织切片的类型
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多（抗原修
复）。
标本的制作
标本的固定和保存
固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保
当P=0时，说明完全不偏振；当P在-1至1之间，即为部分偏振
二、荧光物质
荧光物质：是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。
常用的荧光物质
荧光物质 最大吸收光谱 最大发射光谱 应用
异硫氰酸荧光素 (FITC)（应用最广泛）
490～495nm
520～530nm （黄绿 色）
595～600nm（橙红 色） 620nm（橙红色） 578nm（红色） 430nm（蓝色） 613nm
选择激发光波长在最接近于荧光物质的最大吸收峰处，而测定荧光 波长设在接近于最大发射光波峰时，可得到最高的荧光效率。
荧光的基本知识
荧光寿命
定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程
度时所用的时间。
激发光消失，荧光现象随之消失，但各种荧光物质
的荧光寿命不同。
荧光的基本知识
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退
荧光免疫测定的方法类型
非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：
荧光偏振免疫测定
一、时间分辨荧光免疫测定
基本原理
时间分辨
自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系
元素特异荧光（可有效降低本底荧光的干扰）。
抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验（加入过量抗原后，应不与阳性标本反应）、抑制
试验（阳性标本与未标抗体预结合后，应不与荧光抗体结合） 荧光抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
荧光抗体的制备
荧光抗体的保存
-20℃：保存1～2年
真空干燥：长期保存
二、标本的制作
标本的类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片
离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。
荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。
标记方法简单、安全无毒。
与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
荧光抗体的制备
抗体的荧光素标 记
标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液