产纤维素酶低温菌株的分离鉴定
纤维素分解细菌的分离和鉴定
纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。
3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。
4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。
二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。
三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。
：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。
无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。
把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。
NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。
一株高产低温纤维素酶南极细菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究
５［ （Ｆ２０２ ｓｕｏｌｒｍ ｎｓ ｉｅ ８ － Ａ ５９６） ｅｄａｅ ｏａ ｔａ ＂ Ｐ ｔｏ ｃｒ
统 发 育 分 析 采 用 Ｍｅ ａ． ｇ ３ １软 件 的邻 接 法 （ ｉｈ ｏ— Ｎｅｇ ｂ ｒ
ｊｉｉｇｍｅｈ ｄ 进 行 。 ｏｎｎ ｔ ｏ ） １ ５ 菌 株 产 酶 条 件 的 研 究 ．
１ ４ 菌 株 的 鉴 定 ．
将南 极 嗜冷菌 Ｎ ６ Ｊ ４的 １ Ｓｒ ＮＡ 的 Ｐ Ｒ克 隆子 ６ Ｄ Ｃ 进行 测序 ， 获得 长度 为 １ ９ ｐ的 １ Ｓ ｒ ＮＡ 序列 ， ３ ０ｂ ６ Ｄ 将
Ｄ ＮＡ 模板 的制 备［ ： ５ Ｌ菌体 培养液 加入 到 ３将 Ｏ ］ １ ０肚 ０ Ｌ预冷 的蒸 馏水 中 ， 冰 上放 置 １ｈ以上 或 者 ３ 在
酶 液 ， 别 在 ０ ｏ 、０ｏ ２ ３ 分 １ Ｃ Ｃ、 ０ｏ ０℃ 、 ０℃ 、０ ℃ 及 Ｃ、 ４ ５
： ：＝ ： ：＝ 二二 ＝
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（Ｂ ｏ３ ９ 翻出 ｆ Ａ ０ ０ ８） 删
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图 １ Ｎ６ Ｊ ４系 统 发 育 树
Ｆ ｇ １ Ｐ ｙｏ ｅ ｅｉ ｒ ｅ ｏ ｔ ａｎ Ｎ ６ ｉ． ｈ ｌ ｇ ｎ ｔｃｔ ｅ ｆｓｒ ｉ Ｊ ４
温 纤 维 素 酶 菌 株 Ｎ ６ ， 过 １ Ｓ ｒ ＮＡ 序 列 进 行 鉴 Ｊ４ 通 ６ Ｄ
定， 并对 其 产酶 条件 及酶 学性 质进 行初 步研 究 ， 以期 为
南 极低 温纤 维 素酶 的开 发利用 奠 定基 础 。
基 金 项 目 ： 家 自然 科 学基 金 资助 项 目（０ ７ １ ７ 国 ４８６０）
胨 ５ｇ 酵母 粉 １ｇ 用 过 滤陈海 水定 容至 １ ０ 、 ； ０ ０ｍＬ， Ｈ ｐ
产纤维素酶细菌的分离和生物学性质研究(实验内容)
产纤维素酶细菌的分离和生物学性质研究XXX1， XXX2， XXX3（XX大学XX学院XX专业：XXX）摘要：从土壤中分离到2株菌株，通过刚果红染色法和羧甲基纤维素酶活力法筛选，得到1株产纤维素酶能力强的菌株，经测定，其最佳酶活力pH为7.关键词：纤维素酶; 细菌;Bacterial Cellulose Enzyme in the Separation and Biological Properties Research(By LIU Junbin, MO Yanhong, PENG Qiuxia)ABSTRACT:From the soil to two strains isolated, separated by Congo red stain and carboxymethyl cellulose enzyme screening method, a strain of cellulase ability by the strains, best enzyme pH of 7.KEYWORDS:Cellulose; Bacteria纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的碳源物质，对人类而言，它又是自然界中数量最大的、永不枯竭的可再生资源．纤维素可被纤维素酶降解生成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应用是植物资源再利用的主要途径．微生物是纤维素酶的主要来源，其中主要有细菌、放线菌和真菌，目前研究的最清楚的是霉菌中的里氏木霉T．reesei．细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素无降解活性，且所产生的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，因此对细菌纤维素酶的研究较少．但由细菌产生的纤维素酶的等电点一般为中性或碱性，近十年来随着中性和碱性纤维素酶在清洗、纺织等方面应用前景广阔，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用性能和巨大的经济价值.1 材料与方法1.1 材料1）土壤来源土样采自XXX大学校生命XXX有腐烂枯树叶堆积的底层。
产纤维素酶真菌的分离和鉴定
产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定一、采样地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化二、培养基：（1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。
（2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。
20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。
（均需要加入抗生素100μg/ml）产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。
1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。
0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。
0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。
0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。
刚果红染液：2% 刚果红溶液。
NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。
三、实验方法3.1 真菌菌株的分离取土样方法如前所述。
取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。
产纤维素酶菌株的分离、鉴定及其酶学性质研究
围 内较 稳 定 ， 反 应 的 最 适 温 度 为 ４ 酶 ０℃ ，Ｏ ℃ 以 下 酶 的 热 稳 定 性 较 好 。 Ｋ Ｃ “ 对 Ｃ ａｅ有 激 活 作 用 ， ３ 、 ａ ＭＣ ｓ
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Ｍｇ 对 滤 纸 酶 活 （ Ｐｓ ） 激 活 作 用 。 “ Ｆ ａｅ 有
ｇ ｄ ｃ ｌｒｃ ｎｇｎ ｉ ｅｈ ｄ． Ｔｈ ｏ ｇ ｎａｙ ｉ ｔ ｙ ｉｌｇ ｃ ｌａ ｄ ｂｉｃ ｅ ｃ ｌｐ ｏ ｒｉ ｎ ｏｍｏｏ ｙｏ ６Ｓ ｏ Ｒｅ ｏｏ — ｈａ ｉｇ ｒｎｇｍ ｔ ｏ ｒ ｕ ｈ ａ ｌｓｓｉｓｐｈ ｓｏｏ ｉ ａ ｎ ｏ ｈ ｍｉ ａ ｒ ｐｅ ｔ ａ ｄ ｈ ｅｓ ｌｇ ｆ１
Ｉ ｓ Ｅｎｚ ｍ ｏ ｏ ｙ Ｐｒ ｐ ｒ ｉ ｓ ｔ ｙ ｌ ｇ ｏ ｅ ｔｅ
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Ｋｅ ｙｗｏｒ ｃ ｌ ａ ｅ； ｉｏａ ｉｎ；ｉ ｎ ｉｉａｉ ｎ；１ ＤＮＡ ； ｅ ｚ ｍ ｏｏ ｙ ｃ ａ ａ ｔｒｓｉ ｓ ｄｓ ｅｌ ｓ ｕｌ ｓ ｌ ｔｏ ｄｅ ｔｆｃ ｔｏ ６Ｓ ｒ ｎ ｙ ｌ ｇ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔｃ
纤 维 素作 为 一 种 巨 大 潜 力 的 可 再 生 资 源 ， 依 赖 于人 们 对 纤 维 素 酶 的发 现 和 认 识 。纤 维 素 酶 （ ｅ ｕａｅ 是 降解纤 维 素 生成 还 原 糖 的 一 组 酶 的 Ｃ ｌ ｌｓ） ｌ 总称 。 目前 在 医药 、 日用 化 工 、 品发 酵 、 水 处 食 废 理、 中草药 提 取 等领 域 都 有 一 定 程 度 的 应 用 Ｈ 。 近 年来 ， 生物纤 维 素酶 的研 究 十分 活跃 ， 人 们 微 但
产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定
产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定摘要产酶纤维素微生物在纤维素资源的再生转化，提高牲畜饲料利用率，堆肥的使用以及环境污染等方面具有很高的应用价值。
而分离高效纤维素降解菌是这一内容的前提与基础。
本研究利用选择培养基CMC培养基，从学校周围的土壤中分离得到6株降解纤维素的真菌。
它们都具有较强的纤维素降解能力，尤其以编号为纸绿和江白活性最高。
随后对这6种菌株进行酶活测定，从中得到一株高酶活的菌株,其在CMC培养条件下酶活达到40 U。
关键词：纤维素降解菌；筛选；纤维素酶活；鉴定Separation, screening and enzymatic activity of cellulase producedby fungiAbstractMicrobial fermentation of cellulose micro-organisms, especially fungi in the conversion of cellulose into renewable resources and improve utilization of livestock feed, compost use and environmental pollution has a high application value. And efficient cellulose degradation bacteria can provide useful help in this regard. In this study, selective medium CMC medium, Shaoyang University straw isolated six soil fungi degrade cellulose. They have a strong ability of cellulose degradation, particularly in the number of paper green and White River the highest activity. And the 6 strains with a high activity were morphological, physiological and biochemical identification. Key Words: Cellulose degrading bacteria; Filter; Cellulase activity; Identification.目录摘要 (I)ABSTRACT (II)1前言 (1)1.1纤维素概述 (2)1.2纤维素酶 (2)1.3 纤维素分解菌类 (4)1.4本文研究的目的与意义 (6)2 实验部分 (7)2.1材料 (7)2.2主要试剂与仪器 (7)2.3培养基 (8)2.4菌种的分离与筛选 (9)2.5纤维素酶活性测定 (10)2.6形态特征观察 (12)2.7生理生化特性鉴定 (13)2.8菌种保藏 (14)3 结果与讨论 (14)3.1初筛选得到的各菌株的菌落形态特征描述 (14)3.2复筛获得的菌株图片 (14)3.3葡萄糖标准曲线的绘制 (16)3.4各菌的酶活力测定结果 (17)4 结论 (18)参考文献 (19)致谢 (20)1前言纤维素是自然界中存量最大的一类可再生资源。
一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究
中山大学学报 （ 自然 科 学 版 ）
ＡＣ ＴＡ Ｓ ＥＮＴＩ ＣＩ ＡＲＵＭ ＮＡＴＵＲＡＬＩ ＵＭ ＵＮＩ ＶＥＲＳ ＴＡＴＩ Ｉ Ｓ Ｓ ＵＮＹＡＴＳ ＥＮＩ
Ｖｏ． Ｎｏ ５ １５１ ．
Ｓ ｐ． ２０１ ｅ ２
一
株 产 纤 维 素 酶细 菌 的分 离 鉴 定 及其 酶 学 特 性研 究
ｔ ０ ｏ ，ｗｈ ｌ ｈ ｒｗｔ ｏ ５ Ｃ ｉｅ ｔ ｅ ｇ ｏ ｈ ｐＨ ａ ｇ ｓｆｏ ５． ｏ １ ． ｒ ｎ ｅ ｍ ０ ｔ １ ０．Ｔｈ ｕ ｔ ｒ ｏ ｉ ｏ ｓａ Ｈ ． ｒ ｅ ｃ ｌｕ ｅ ｃ ｎｄｔ ｎ ｔｐ ６ ０～９． ｉ ０，３ ～ ４ ４ Ｃ ｎ ． ０ ｏ ａ ｄ １ ５％ ～３． ％ Ｎａ ｒ ｈ ｓ ｕ ｔｂ ｅ ｆ ｒｅ ｚ ｍｅ ｐ ｏ ｕ ｔ ｎ．Ｔ ｅ ｏ ｔｍａ ｅ ５ Ｃ１ａ ｅ ｔ ｅ ｍｏ ｔｓ ｉａ ｌ ｏ ｎ ｙ ｒ ｄ ｃ ｉ ｏ ｈ ｐ ｉ ｌｔｍｐｅ ａｕ ｅ ｆ ｒ ｒ ｔ ｒ ｏ
行 了产 纤维素 酶研 究 ，认 为 Ｂ ｕ ｉ ｓ ．ｐ ｍ ｌ 是一 种抗 分 ｕ
Ｐ Ｒ引物 由上 海 生 工合 成 。Ｔａ ｇｎ细 菌 基 『 组 总 Ｃ ｉ ｅ ｎ 大 ］
Ｄ Ａ提 取试剂 盒 购 白天根 生 化 科 技 （ 京 ） 有 限 Ｎ 北
公司。 １２ 方法 ．
１２ １ 样 品预 处理 取 采 集 到 的 土壤 样 品 ５ ｇ于 ． ．
纤 维 素是地球 上 光合作 用产 量最 高 的多糖 ，它 是 由葡萄糖 以 Ｂ一１ ４糖 苷键 连接 而成 的线状 大 分 ， 子物 质 。据 报道 ，纤 维 素全 球 年产 量 为 １５× 卜 ． １ 万 ｔ ０ 。高效纤 维 素 酶 的研 究 开 发是 可 再 生 性 资
产纤维素酶菌种的分离筛选和酶学性质的研究
１ａｅｏ ３ ｈｗ ｄａｈｇ ｔ ｉｔ ａ ｐ ｏ７０—８ ０ １ ｏｃ ｓｏ Ｔ ｅｇｏｔ ｄｅｚｍ ｔ ｈｒ ｔｉｔｓ ｆｌ ｅ ｒｌ ｉａｉ ｏｆｍ ｄ ｗ ｉ ｌ ｕ ｆ１ ｓｏ ｅ ｉ ｓ ｂｌｙ ｔ Ｈ ｆ ． ｓ ５ ｈ ａ ｉ ． ．Ｃ ｎｌ ｉ Ｊ ｈ ｒｗｈａ ｎｙ ａｉｅａａ ｅ ｓｃ ｔ ｗ ｒ ｐｅｉ ｎｒｙｅｎ ｒ ｅ ， ｈｃ ｕ ｎ ｎ ｃ ｅｒ ｉ ｏ ５ ｅ ｍ ｌ ｉ ｈ
摘要 ［ 目的 ］ 寻找产 纤维素酶的 高产 菌。［ 方法］ 通过 固体培 养初 筛和摇 瓶发 酵复 筛获得 产 纤维素酶 的菌株 ， 过考 察培 养基 、 通 生长温 度、Ｈ值 、 ｐ 产酶时 间等主要 的影响 因子及酶 学特性对产纤 维素酶酶活较 高的菌株进 行 了初步的研 究。 ［ 果］ 结 筛选得 到 了产纤维 素酶活 较高 、 稳定性较好 的茵株 Ｂ。通过对 Ｂ 茵的研究 ， ５ ５ 发现其 最适生长培养基 为查氏培养基 ， 最适 生长温度 为 ３ ℃ ， ５ 最适生长 ｐ Ｈ值为 ７５ ．， 产酶的最佳 时间为 ７ ； ２ 通过对其酶 学特性的研 究， ｈ 发现该 酶反应的 最适 温度为 ５ ０℃， 酶反应 的最适 ｐ 值 为 ７５酶在 ｐ Ｈ ．， Ｈ值 为 ７０ ８０ ．～ ． 范 围内稳定性较 高。［ 结论］ 初步确定 了 Ｂ 菌的生 长特性 和酶学特性 ， 下一 步的研 究提供 了科 学的依据。 ５ 为 关键词 纤维素酶 ； 筛选 ； 酶学性质 中图分类号 Ｓ ８ 文献标识码 Ａ １ ２ 文章编号 ｏ １ — ６１２０ ）３ ０ ８ — ２ ５ ６ １（０９ １ — ５４ ０ ７ ６
关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述巽风
关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述巽风产纤维素酶菌是一类能够分解植物细胞壁中的纤维素的微生物。
近年来，随着生物技术的发展，越来越多的产纤维素酶菌被分离和鉴定。
这些菌株可以应用于生物质资源的利用、饲料添加剂、环境治理等众多领域。
产纤维素酶菌的分离一般采用筛选法和环境法。
筛选法是根据菌株自然产生纤维素酶的特性，通过对土壤、水体、植物、动物肠道等环境中的微生物进行筛选，选出能够产生纤维素酶的菌株。
环境法则是以含有纤维素的废弃物、农作物秸秆等为菌落的生长基质，通过培养和筛选，筛选出产纤维素酶菌的菌株。
运用产纤维素酶菌可以实现对植物细胞壁的降解，将生物质转化为可直接使用的糖类物质，从而使生物质资源得到更加高效的利用。
此外，产纤维素酶菌还可以作为饲料添加剂，提高畜禽的饲料利用率，减少环境污染。
在环境治理方面，产纤维素酶菌还可以用于处理含有大量纤维素的废弃物和污水，减少环境负荷，推动循环经济发展。
总之，产纤维素酶菌的分离和运用有着广阔的应用前景，对于推进生物质资源的高效利用和环境保护具有重要意义。
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低温纤维素降解菌分离鉴定及产酶条件优化
２ ０ １ ５ 年１ Ｏ 月
东
北
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报
４ ６ （ １ ０ １ ： ７ ４ － ８ １
Ｏｃ ｔ ｏ ｂ ｅ ｒ ２ ０１ ５
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ａ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ［ Ｊ ］ ． Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎ ｏ ￣ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， ２ ０ １ ５ ， ４ ６ （ １ ０ ） ： ７ ４ — ８ １ ． （ ｉ ｎ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ
中图分类号 ：￥ ７ ８ ９ ；￥ １ ８ ２ 文献标 志码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ５ — ９ ３ ６ ９ （ ２ ０ １ ５ ） １ ０ — ０ ０ ７ ４ — ０ ８
李春艳， 于琦， 冯露 ． 等． 低温纤维素降解菌分离鉴定及产 酶条件优化［ Ｊ 】 ． 东北农业大学学报． ２ ０ １ ５ ， ４ ６ （ １ ０ ） ： ７ ４ － ８ １ ．
Ｆ Ｌ Ｘ 一 １ 产羧 甲基纤维素（ Ｃ ａ ｒ ｂ ｏ ｘ ｙ ｍ ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ｃ ｅ Ｕ ｕ ｌ ｏ ｓ ｅ ，Ｃ ＭＣ ） 酶活特性影响情 况。结果表明，菌株 Ｆ Ｌ Ｘ 一 １ 最佳产酶条件 为培
养时间７ ４ ． １ ｈ ，温度 １ ０ ． ５ ℃，ｐ Ｈ７ ． １ ，接种量 ２ ． １ ％。在最佳条件 下，菌株 Ｆ Ｌ Ｘ 一 １ 产Ｃ Ｍ Ｃ酶活值为 １ ４ ． １ ２Ｕ ・ ｍ Ｌ 『 。 关键词 ：纤维素 ；低 温降解 茵；Ａ ｒ ｔ ｈ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｓ ｐ ． ；Ｃ Ｍ Ｃ酶 ；响应面分析 法
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽【摘要】通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料.采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定.结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).%In order to provide bacteria for development of cellulase preparations and cellulase engineering,the high-yield cellulase bacteria strains were screened.Separate cellulase producing strains isolated from cow or sheep dung and putrid maize straws or wood chips with Congo red plate to screen cellulase producing strains through the determination of enzyme activity with DNS assay,and observe its shape,dyeing and cultural characteristics.16S rDNA universal primers were applied to amplify genomic DNA of the strain,and to identify the species of rescreening strains.The result indicated that the isolated 16 bacterial strains with higher cellulase production were gram positive,short rod and central spores.In which,10 strains were Bacillus subtilis,6 strain were Bacillus amyloliquefaciens.【期刊名称】《草原与草坪》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】6页(P7-11,19)【关键词】纤维素酶;16SrDNA;分离;鉴定;枯草芽孢杆菌;解淀粉芽孢杆菌【作者】吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽【作者单位】甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q939.99随着世界经济的快速发展，能源需求量急剧上升，为了实现可持续发展，世界各国均在寻求新的替代能源，如风能、核能、太阳能、生物质能等等。
(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.
目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定
本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。
我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。
但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。
目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。
随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。
采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。
因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。
关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
纤维素酶产生菌的鉴定与筛选
纤维素是高等植物细胞壁的主要成分, 也是地 球上最丰富的资源。纤维素酶是一组分解植物纤维 素的酶 , 主要有 1, 4 葡聚糖水解酶( Cx ) 酶和 1, 4 葡聚糖纤维二糖水解酶 ( C 1) 酶。 它们能将植物纤 维分解为葡萄糖, 能破坏植物细胞壁, 使其释放蛋白 体、 淀粉等营养成分, 能消除饲料中非淀粉多糖的抗 营养作用, 提高饲料利用率和畜禽生产性能。饲用纤 维素酶主要由霉菌产生, 因此, 筛选出高活性纤维素 酶的菌株是开发利用纤维素资源和提高饲料营养价 值的前提和关键。故进行了本试验, 以期为生产高活 性饲用纤维素酶奠定基础 , 现报告如下。 1 材料与方法 1 1 待检样品的采集和处理 从自然界中采集朽木、 土壤、 粪堆土、 草底土、 发霉秸秆和霉变玉米等样品, 分别放入三角瓶中, 加入适量的生理盐水 , 室温浸泡 6h( 每 2h 振荡一 次 ) , 作为待检样品。 1 2 1 3 培养基 PDA 和 CCM , 按常规方法配制。 霉菌的分离培养与鉴定 用接种环将待检样品分别划线接种于 PDA 和 CCM 平坂上, 另外将数个 PDA 和 CCM 平板敞口 于试验室内 2h, 进行空气接种 ; 将接种的平板置 28 恒温箱中培养 3~ 7 天。然后 , 采用挑取典型单 个菌落法或稀释后涂抹平板法进行纯培养。分纯后 的菌株接种于试管斜面保存菌种, 接种于平板观察 培养性状及孢子和菌丝形态特征。 1 4 纤维素粗酶液的制备 称取稻草粉 3g, 麦麸 2g , 于 250m L 三角瓶中, 加入 1% 硫酸铵溶液 ( 以自来水为溶剂配制) 10mL , 混匀后 121 3 灭菌 30min, 接种斜面霉菌孢子一 环 , 充分摇匀后于 28 培养 72h 成曲 ( 脂 ( P DA) 板和察氏培养基 ( CCM ) , 从自然界和饲料中分 离出 6 种 8 株霉菌 , 分别是产黄青霉 1 株 ( 9908) , 米根霉 1 株 ( 9917) , 米曲霉 1 株 ( 9935) , 高大毛霉 1 株 ( 9939) , 黑曲霉 2 株 ( 9930、 9934) , 绿色木霉 2 株( 9916、 9942) 。 经 滤纸崩溃法、 CMC 糖化力、 棉花糖化力测定, 证明 8 株菌能产生纤维素酶。 其中产 Cx 酶 高的菌株是 9930、 9934, 产 C1 高的菌株是 9930、 9934、 9942。 关键词 霉菌 ; 纤维素酶 ; 鉴定; 筛选 一次 ) , 加蒸馏水 100m L , 40 恒温水浴 培养 1h( 每 15m in 摇动一次 ) , 用脱脂 棉过滤, 滤液为粗酶液, 另设一瓶不接 种的培养基滤液, 为对照溶液。 1 5 纤维素酶活力的测定 1 5 1 滤纸崩溃法( C 1 酶 ) 在 200mL 三 角瓶中 加 8m L 粗酶 液, 2mL 0 2m ol/ L 、pH 4 6 醋酸缓冲 液, 2 张 1 1cm 大小的新化滤纸 , 45 保温 , 反复振荡 ( 100 次 / 分) , 观察滤纸 刘 崩溃程度 , 记录滤纸完全消失所需要的 时间。 用对照溶液代替粗酶液作为对照 颖 组, 其余同试验。 1 5 2 羧甲基纤维素钠盐 ( CM C) 糖 化力 ( Cx 酶) 取 0 5mL 适当稀释的粗酶液 , 加 入 2mL 1% CM C 溶液 , 50 水浴中反 邵 红
产纤维素酶细菌菌株的分离鉴定及产酶条件优化
产纤维素酶细菌菌株的分离鉴定及产酶条件优化毛丽春;修立辉;胡刚【摘要】该实验分离鉴定了高产纤维素酶细菌菌株并探究其产酶条件.采用3种培养基进行分离筛选.经菌落形态观察、16S rRNA基因序列分析菌株在系统分类地位.通过单因素试验确定最适产酶条件.结果表明,从西岭山原始森林保护区土壤中筛选到1株高产纤维素酶细菌菌株,鉴定为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia).其最适产酶条件:碳源为麦麸,最佳氮源为酵母粉,接种量为2％(V/V),初始pH值为7,产酶时间为48 h.在此条件下,酶活最高可达2.76 U/mL.酶学特性研究显示,在pH5.0、温度60 ℃条件下CMCase酶活力最高.%In order to isolate and identify the high-yield cellulase-producing bacteria and explore their enzyme-producing conditions, the strains were separated and screened by 3 kinds of culture media. The system classification status of strain was analyzed by the colony morphology observation and 16S rRNA gene sequence. The optimum enzyme-producing conditions were determined by single factor experiments. The results showed that the bacteria with high-yield cellulase was screened from the soil of the original forest reserve in Xiling mountain and identified as Burkholderia cepacia.The optimum enzyme-producing conditions of the strain were wheat bran as carbon source, yeast extract powder as nitrogen source, inoculum 2％(V/V), initial pH 7 and enzyme-producing time 48 h. Under the conditions, the maximum cellulase activity was 2.76 U/ml. The research of enzymatic characteristics showed CMCase activity was the highest under the conditions of pH 5.0 and temper ature 60 ℃.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】5页(P83-87)【关键词】纤维素;纤维素酶;分离;菌株;鉴定【作者】毛丽春;修立辉;胡刚【作者单位】广西师范学院环境与生命科学学院,广西南宁 530001;广西师范学院环境与生命科学学院,广西南宁 530001;广西师范学院环境与生命科学学院,广西南宁 530001【正文语种】中文【中图分类】Q93-331人类对于能源的需求不断增加,化石能源作为人类最主要的消耗能源具有一次性、有限性等特点,其的燃烧对环境造成严重污染。
耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化
1 材料与方法
1.1 样品采集 试验样品：土壤采自大庆扎龙湿地和腐殖质
丰富森林地区。 1.2 试验材料
① 富集培养基：蛋白胨 5 g，滤纸 5 g，NaCl
0.5 g，酵母粉 2 g，CaCO3 2 g，蒸馏水 1 000 mL， 121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。
② 基础产酶培养基：羧甲基纤维素钠 15 g， MgSO4 2 g，KH2PO4 2 g，NH4NO3 1 g，NaCl 0.3 g， MnSO4 2.2 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，酵母粉 1 g，蒸馏 水 1 000 mL，121 ℃，101 kPa 条件下灭菌 25 min。
耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化
郑国香 1, 2, 3，艾 爽 1, 2，尹 婷 1, 3，李 健 1, 3
（ 1. 东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030；2. 农业部生猪养殖设施工程重点实验室，哈尔滨 150030； 3. 黑龙江省农业再生资源利用技术装备重点实验室，哈尔滨 150030 ）
低温降解纤维素的细菌的筛选及鉴定
Ｂ１ 、Ｂ ０、Ｂ １ ２ ９ ２ ２ 、Ｂ ２表示 。
１ ， 方法 ２
Ｂ ７ ２ 种 虽 然生 长 缓慢 但 还 可 以 在低 温 下 生 １ 、Ｂ ０菌
长 ，Ｂ１ ２ ３ １ 、Ｂ ２ 、Ｂ 、Ｂ 、Ｂ １ １ 、Ｂ１ 、Ｂ１ 、Ｂ ８。 ４ ５ １菌
收 稿 日期 ：２ ０ — ３ ５ ０ ７ ０ —１
将 分离 出 能 产 生 纤 维 素 酶 的 ｌ 细菌 菌 株 ， ３株 点 种到 纤维 素分 解 菌鉴 别培 养 基 ，培 养 ２ｄ后测 量
各 菌 株透 明圈 的直 径 大 小 。结 果显 示 Ｂ 、Ｂ 、 ４ ５
Ｂ 、Ｂ 、Ｂ 、Ｂｌ ６ ７ ８ ０、Ｂ ７菌 种在 初 筛培 养 基 中无透 ｌ
降解作 用的两株细 菌菌株 Ｂ ９和 Ｂ １ ２ ，并对其进行鉴 定 ，Ｂ ９菌株 为噬胞 菌属 （ 又名 纤维粘 菌属 ，Ｃ ｔ ｈｇ ） ｙ ｐ ａｅ 细菌， ｏ Ｂ １菌株为纤维单胞 菌属（ ｅｌｌ ｏ ａ ） ２ Ｃ ｌ ｏ ｎｓ 细菌 。 ｕｍ 关键词 ：低温 ；纤维素；细菌；筛选
ｌ ｗ ｅｍ ｐ ａｔ ｅ ｏ ｔ ｅｒ ｕｒ
菌株
Ｂａ ｔ ｒａ ｃ ｅ ｉ
图 １ 不同菌株酶 活力
Ｆ ｇ １ Ｅｎ ｙ ｃ ｉ ｉ ｆｄ ｆｅ ｅ ｔｂ ｃｅ ｉ ｉ． ｚ ｍｅ ａ ｔ ｔ ｏ ｉ ｒ ｎ ａ ｔ ｒａ ｖ ｙ
生 长 。 而 Ｂ 、 Ｂ 、 Ｂ 、 Ｂ 、 Ｂ 、 Ｂ１ Ｂ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ０、 １ 、
１ 材料 与方法
１１ 菌种来 源 ．
在低 温 环 境 中 提 取 低 温 细 菌 ２ ２株 ，分 别 用
实验一 产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定
实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要： 1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC 酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。
产纤维素酶细菌的分离鉴定及产酶特性研究
第28卷 第4期2009年8月兰州交通大学学报J ou rnal of Lanzh ou Jiaotong UniversityV ol.28N o.4A ug.2009 文章编号:1001-4373(2009)04-0159-04产纤维素酶细菌的分离鉴定及产酶特性研究孔 凯, 孟 宁, 冯 琳, 李师翁(兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州 730070)摘 要:从青藏高原采集的牦牛粪中,经过CM C平板分离得到潜在产胞外纤维素酶菌株6株,运用透明圈法和滤纸崩解法得到产纤维素酶能力较强的一株细菌T ibet-YD5000-3,革兰氏染色和16S r DN A序列比对分析表明,T i-bet-Y D5000-3菌株为革兰氏阴性菌,属黄杆菌属(F lavo bacterium sp.)细菌,T ibet-YD5000-3最适生长温度为20℃,最适生长pH值为8.0,最适产酶温度25℃,最适产酶pH值为8.0.该菌株所产的纤维素酶都具有较好的热稳定性和宽泛的pH适应性.关键词:青藏高原;纤维素酶;黄杆菌属中图分类号:Q93-3 文献标识码:A 纤维素是地球上分布最广,含量最丰富的碳源物质,对人类而言,它又是自然界中数量最大的、永不枯竭的可再生资源.纤维素可被纤维素酶降解生成葡萄糖,因此纤维素酶研究开发和应用是植物资源再利用的主要途径.微生物是纤维素酶的主要来源,其中主要有细菌、放线菌和真菌,目前研究的最清楚的是霉菌中的里氏木霉T.reesei.细菌产纤维素酶的产量较少,主要是葡聚糖内切酶,大多数对结晶纤维素无降解活性,且所产生的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上,不分泌到培养液中,增加了提取纯化的难度[1],因此对细菌纤维素酶的研究较少.但由细菌产生的纤维素酶的等电点一般为中性或碱性,近十年来随着中性和碱性纤维素酶在清洗、纺织等方面应用前景广阔,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用性能和巨大的经济价值[2].从青藏高原牦牛粪中分离到一株革兰氏阴性菌Tibet-YD5000-3,经16S rDN A序列比对分析, Tibet-YD5000-3为黄杆菌属菌株.黄杆菌通常分解的碳水化合物是果糖、甘油、麦芽糖和海藻糖,大多数菌株产生胞外DN ase,产生过氧化氢酶、氧化酶和磷酸酶,不利用柠檬酸盐,不消化琼脂,常产生少量吲哚[3].我们首次分离到可产胞外纤维素酶的黄杆菌属菌株Tibet-YD5000-3,能分解CM C和滤纸.本文论述初步研究结果.1 材料和方法1.1 材料来源从唐古拉山南坡(32°32.572N,91°49.529E)海拔5000m取牦牛粪样品.1.2 培养基分离平板培养基,复筛培养基,滤纸崩解实验培养基,液体摇瓶培养基[4].1.3 初筛取样品1g置于装有100m L无菌水的三角瓶中,摇匀,从三角瓶中取1mL转移到另一盛有100m L无菌水的三角瓶,在25℃和150r/min下振荡培养2 h,取0.1mL振荡培养液涂布筛选到以CMC为唯一碳源的培养基平板,倒置恒温25℃培养3～4d,注意观察菌的生长情况,挑取单菌落用斜面保存.1.4 刚果红染色鉴定法用接种针将斜面单菌落转移到复筛产酶培养基,25℃恒温培养3d,向培养皿中加入适量1 m g/m L的刚果红溶液,染色1h后,用1m ol/L的NaCl溶液洗脱.1.5 菌株鉴定采用引物27F5′-AgAgTTTgATCCTggCTCAg -3′,907F5′-AAACTCAAA TgAATTgACg gg-3′, 517F5′-CCAgCAgCCgCCggTAA T-3′,进行菌株16S rRNA基因的扩增,50μL的扩增体系含有:2单位Taq DNA聚合酶(Promeg a,Madison,Wis.,USA),＊收稿日期:2009-06-04作者简介:孔 凯(1986-),男,山东济宁人,硕士生.兰州交通大学学报第28卷1×Taq buffer ,2mmol /L MgCl 2,0.2mmol /L dNTP ,引物各10pmol .PRC 扩增30个循环,扩增产物经纯化后送上海生工生物工程有限公司测序.将菌株序列经CLUSTA LW1.8.1[5]行多序列联配,使用Jukes and Cantor 法[6]算进化距离用邻位相连法分析后通过M EGA3.1构建系统发育树,通过Bootstap 法对树进行评估分析[7].1.6 菌株生长和产酶特性的研究将菌株接种到液体摇瓶产酶培养基中,在不同的培养温度、培养时间、培养基pH 条件下比较其生长和产酶情况.1.7 酶活力的测定以CM C 为底物,参照文献[8]测定纤维素酶活力,3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖,540nm 处测定吸光值,每分钟水解纤维素产生1μg 葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U ),以上所测酶活均为扣除发酵液中还原糖量.2 结果与分析2.1 菌株的分离纯化与筛选从取自青藏高原的一份牦牛粪材料中,经稀释涂布平板分离到能在以CMC 为唯一碳源的培养基中生长的菌株6株,用刚果红染色,产生透明圈直径较大的菌株有一株,给该菌命名为Tibet -YD5000-3.Tibet -YD5000-3菌落为橙黄色,圆形边缘整齐,菌落表面为低凸面.革兰氏染色表明Tibet -YD5000-3为杆状革兰氏阴性菌.2.2 菌株的分子生物学鉴定菌株Tibe t -YD5000-3的16S rDNA 基因序列提交GeneBank 数据库,获得Tibet -YD5000-3登录号为FJ958328(已公布),与GeneBank 数据库中已有的16S rDNA 基因序列进行相似性比较分析,Tibet -YD5000-3与黄杆菌属(Flavo bacterium sp .)细菌相似性均达98%以上.该株细菌的系统发育树如图1.图1 Tibet -YD 5000-3的16S rDNA 序列为基础的系统发育树和序列来源Fig .1 The phylogenetic tree of the Tibet -YD 5000-3based o n 16S rD NA sequences and the isolation source of sequences2.3 菌体生长及产酶特性2.3.1 温度对菌株生长及产酶的影响:将菌株Flav obacte rium sp .的种子液分别以2%的接种量接入液体摇瓶培养基中,分别在10℃、20℃、25℃和30℃下培养,每隔24h 取样测定OD 600,培养72h 后取样按DNS 法测定酶活,并计算不同温度下的相对酶活.结果如图2所示,Flavobacte rium sp .在10～30℃下均能生长,最适生长温度是20℃,该菌在培养72h 左右进入稳定期,Flav obacterium sp .最适产酶温度为25℃.2.3.2 初始pH 对菌株生长及产酶的影响:将Flavobacterium sp .的种子液分别以2%的160第4期孔 凯等:产纤维素酶细菌的分离鉴定及产酶特性研究图2 温度对菌株生长和产酶的影响Fig .2 The effect of temperature on biomass and activity接种量分别接入初始pH 值为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0的培养基中,在25℃下培养72h 测定OD 600以及酶活,并计算不同温度下的相对酶活,结果如图3所示,Flavo bacterium sp .适宜生长的pH 值范围为6.0～9.0,最适生长pH 值为8.0;Flavobacte rium sp .最适产酶pH 值为8.0,与最适生长pH 值一致.图3 初始pH 对菌株生长和菌株产酶的影响Fig .3 The effect of pH on bio mass and activity2.4 酶学性质的初步研究2.4.1 酶反应的最适pH 值:将Flavo bacterium sp .的纤维素酶液分别置于不同的pH 条件下测定CM C 酶活力.由图4可知,Flavo bacterium sp .所产CMC 酶反应最适pH 值为8.0,且在pH 值为9.0左右也有较高的酶活性,该菌株在最适培养条件、酶最适反应条件下测得纤维素酶活为12U /m L .2.4.2 酶反应的pH 稳定性:将Flavo bacterium sp .的纤维素酶液分别置于不同的pH 环境中,于30℃下保温30min ,按常规方法测定酶活力.如图5所示,Flavo bacterium sp .图4 pH 值对菌株纤维素酶活力的影响Fig .4 The effect of pH on cellulase activity所产纤维素酶在pH 值为7.0～9.0范围内,酶活性保持在70%以上,可见该菌产生的纤维素酶在中碱性条件具有较强的稳定性.图5 不同pH 值条件下纤维素酶活的稳定性Fig .5 The stability of cellulase activity at dif ferent pH2.4.3 酶反应的最适温度:将Flavobacterium sp .的纤维素酶液分别置于不同的温度下测定酶活力.由图6可知,Flavobacteriumsp .所产CMC 酶最适反应温度30℃.图6 温度对纤维素酶活力的影响Fig .6 The ef fect of temperature on cellulase activity2.4.4 酶反应的温度稳定性:将Flavobacterium sp .的纤维素酶液分别置于不同温度下30min 后,测定酶活.由图7可知,Flavobacte rium sp .所产生的纤维素酶液在20～30℃范围内,酶活性保持在80%以上.161兰州交通大学学报第28卷图7 不同温度条件下纤维素酶稳定性Fi g.7 The stability of cellulase activity at different tem pratures 3 讨论与结论运用CMC平板、透明圈法和滤纸崩解法从青藏高原牦牛粪中分离到可产生胞外纤维素酶的黄杆菌属.菌株Tibet-YD5000-3.实验表明,Tibet-YD5000-3最适生长温度为20℃,最适生长pH值为8.0.Tibet-YD5000-3菌株最适产酶温度25℃,最适产酶pH值为8.0.Tibet-YD5000-3所产纤维素酶反应最适pH值为8.0,最适反应温度30℃,经测定该菌株在最适培养条件、酶最适反应条件下测得纤维素酶活为12U/m L,具有进一步开发应用的前景.目前对黄杆菌属细菌的研究相对较少,最近的研究发现,该属细菌具有产褐藻酸酶[9]等活性,尚未发现该属细菌具有产纤维素酶活性,我们的研究首次分离到一株产胞外纤维素酶的黄杆菌属菌株Ti-bet-YD5000-3,有必要对该细菌的纤维素酶基因进行分离鉴定和更深入地研究.参考文献:[1] 高伦江,董 全,唐春红.纤维素酶的研究进展及前景展望[J].江苏食品与发酵,2007(4):5-8.[2] 赵新刚.洗涤用碱性纤维素酶及其产生菌的分离方法[J].微生物学通报,1999,26(1):63-65.[3] 赵占春.黄杆菌属的分类和鉴定[J].临床检验杂志,1984(2):45-47.[4] 顿宝庆,吴 薇,王旭静,等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报,2008,10(1):113-117.[5] T hompso n J D,G ibson T J,P lew niak F,et al.Clustal XWindow s interface:flexible strategies for multiple se-quence a lig nment aided by quality analy 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ｓ ｅ ｉｅ ｒ ｓ ｏ ｆ ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｔ ｅ ｓ ｔ ｓ ａ ｎ ｄ １ ６ Ｓ ｒ ＤＮＡ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｅ ｄ ．Ｔ ｈ ｅ Ｌ —ｌ ３
Ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ Ｐｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ Ｃｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｓ ｅ
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（ 辽宁省微生物科学研究院 ， 辽宁 朝阳 １ ２ ２ ０ ０ ０ ）
摘
要： 为促进秸秆还 田， 加快秸秆在北 方设 施土壤 中的降解速 度 ， 以腐烂秸秆 为待筛菌株原料 ， 以玉米
秸秆粉 为培养ห้องสมุดไป่ตู้ ， 在１ ５ ℃低 温条件下 ， 采用刚果红平板法进行初筛 ， 得到 １ ６株 菌株 ， 对 １ ６株菌株进行 酶活测
ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ １ ６ ７９． ６１ Ｕ／ｍ１ ．Ｔｈｅ ｍｙ ｃ ｅ ｌ ｉ ａ ｌ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｌ ｏ ｎ ｙ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｉｓ ｒ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ Ｌ 一１ ３ ｗｅ ｒ ｅ ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ，ａ ｎ ｄ ａ
定复筛 ， 其 中 Ｌ一１ ３酶活最高 ， 达１ ６ ７ ９ ． ６ １ Ｕ ／ ｍｌ 。对 Ｌ一１ ３菌株的菌体 形态 、 菌落特征进行观察 ， 并进行 了一
系列生理生化试验 和 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析 ， 初 步鉴定 Ｌ一１ ３为枯草 芽孢杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ） 。此菌可 以在 １ ５ ％下快速生长繁殖并高产纤维素酶 ， 低温条件 下能快速降解 秸秆 。 关键词 ： 玉米秸秆 ； 低温 ； 纤维素酶
我 国的玉米 秸秆 资源 分 布较 广 ， 是一 种 易得
（ Ｌ ｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｏ ｆＭ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｃ ｈ ａ ｏ ｙ ａ ｎ ｇ １ ２ ２ ０ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｗ ｒ ｅ ｔ ｕ ｒ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ ｓ ｐ ｅ ｅ ｄ ｕ ｐ ｉ ｔ ｓ ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｎ ｏ ｒ ｔ ｈ ｒｅ ｇ ｅ ｎ ｈ ｏ ｕ ｓ ｅ ｓ ｏ ｉ ｌ ， ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｒ ｏ ｔ ｔ ｅ ｎ ｓ ｔ ｒ ａ ｗ ａ ｓ ｒ ａ ｗ ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ ｓ ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｒ ｎ ｓ ｔ ｒ ａ ｗ ｐ ｏ ｗ ｄ ｅ ｒ ａ ｓ ｍｅ ｄ ｉ ｕ ｍ ，１ ６ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ Ｃ ｏ ｎ ｇ ｏ Ｒｅ ｄ ｐ ｌ ａ ｔ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ａ ｔ ｌ ５℃ ．Ｔ ｈ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｉ ｅ ｓ ｏ ｆ １ ６ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ．Ｌ一 １ ３ ｈ ａ ｄ ｔ ｈ ｅ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｓ ｔ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ
中 图分 类号 ： Ｑ ９ ３— ３ ３ １ 文 献标 识 号 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ９ ４ ２ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ３－ ０ ０ ５ ４— ０ ４
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山东 农 业科 学 ２ ０ １ ４， ４ ６ （ ３ ） ： ５ ４—５ ７
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Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ
产纤维素酶 低温菌株 的分离鉴定
刘晓辉 ， 高晓梅 ， 桓 明辉 ， 邓春海 ， 李 杨， 熬 静， 郭玲玲