ELISA实验步骤
ELISA试验方法
ELISA试验方法ELISA试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），也称酶联免疫吸附试验，是一种常用于检测抗原或抗体的敏感且特异性的实验方法。
ELISA试验既可以用于研究基础科学，也可以应用于诊断医学、生物制药、科研开发等领域。
第一步：固相吸附首先，将特异性抗原或抗体加入固相载体，如微孔板或磁珠，通过吸附作用将其固定在载体上，形成固相。
然后，将未被吸附的地方进行阻断，例如使用牛血清蛋白（BSA）或胸腺素等阻断剂来封闭非特异性结合位点，减少非特异性结合。
第二步：样品加入将待检样品加入固相，并充分与特异性抗原或抗体反应。
如果待检物是抗原，则待检样品中存在的特异性抗体会与固相上的抗原结合。
如果待检物是抗体，则待检样品中存在的抗原会与固相上的抗体结合。
第三步：洗涤通过反复洗涤固相，去除非特异性结合的物质，确保只有特异性结合物留在固相上。
典型的洗涤液包括缓冲盐水或洗涤缓冲液。
第四步：二抗加入将经过酶标记的二抗加入固相，使其与特异性结合的抗原或抗体结合。
酶标记的二抗可以与特异性结合物形成二抗-抗原或二抗-抗体复合物。
第五步：洗涤再次进行洗涤步骤，去除非特异性结合的酶标记的二抗，确保只有特异性结合的复合物留在固相上。
第六步：底物加入将含有底物的反应物加入固相，使其与酶标记的二抗发生反应。
底物与酶标记的二抗之间的反应产生颜色变化，即可定性或定量检测待检物质的存在和浓度。
第七步：反应停止通过加入反应停止剂，停止酶反应，阻止进一步的底物转化为产物。
产物的生成量与待检物质的浓度成正比。
最后，通过光度计或酶标仪等检测设备，测量产生的颜色变化的光密度，可以定性或定量计算待检物质的存在和浓度。
ELISA试验具有高度的敏感性和特异性，能够检测低浓度的抗原或抗体。
它的操作简单、重复性好，广泛应用于生物医学研究、临床检测、植物检测、食品检测等领域。
不过需要注意的是，ELISA试验的结果受到很多因素的影响，如抗体的质量和纯度、试剂的质量和保存条件等，因此在进行ELISA试验时需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可重复性。
ELISA实验步骤
操作步骤1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。
同时作稀释液对照。
37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
ELISA
ELISA实验指导1．实验操作步骤：（1）包被：用包被缓冲液稀释PC，使其终浓度为20μg/mL，每孔100μL于96孔板（ELISA用），4℃孵育过夜。
（2）清洗：取出96孔板，倒置，甩掉孔中液体，并在纸上使劲拍掉黏附的剩余液体。
每孔加大约250μL的清洗液，37℃摇床中速孵育5min*3次，每次都要用力甩掉孔中液体。
（3）封闭：每孔加入100μL 封闭液，37℃摇床中速孵育1h。
（4）清洗：重复（2）（5）上样：LB稀释两倍上样，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h（6）清洗：重复（2）（7）一抗：将anti-strep按1：1000稀释比例稀释到1% BSA-TBS-Ca中，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h。
（8）清洗：重复（2）（9）二抗：按照1:6000将anti-mouse稀释到1% BSA-TBS-Ca中，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h。
（10）清洗：重复（2）（洗第三次的时候加入H2O2）（11）显色：稀释后的TMB显色，每孔100uL，室温避光孵育20min 左右。
（12）终止：每孔加100μL 1M 硫酸，显色终止。
（13）吸光值：终止后立即放入酶标仪检测吸光值（450nm，570nm）。
（14）数据处理：去除对照背景，计算实验结果。
2．实验试剂：（1）包被缓冲液：100mM Na2CO3，100mM NaHCO3，将两者分别配好，再将两者相互调配至pH9.6（2）清洗液：0.02% NP-40+TBS-Ca（10mM Tris，140mM NaCl，2mM CaCl2，pH 7.4）（3）封闭液：1%BSA，需用TBS-Ca 配置。
（4）样品处理：①非Ca螯合：50μL样品+10μL 10%BSA+40μL TBS-Ca②Ca螯合：50μL样品+10μL 10%BSA+10μL 100mMEDTA+30μL TBS-Ca（5）TMB：100μM，1mL DMSO，使用前需要稀释（1:100），稀释液为0.2M CH3COONa-柠檬酸，调至pH4.0，第三次洗的时候，按1：4229加入H2O2 （终浓度约为3mM）。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析特定抗原或者抗体的存在。
本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA实验步骤，以确保实验的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 酶标仪3. 微量移液器和相应的可调移液器架4. 基质溶液（PBS等）5. 抗原或者抗体样品6. 酶标记的二抗7. 洗涤缓冲液8. 底物溶液9. 住手液三、实验步骤1. 准备工作a. 将96孔ELISA板放置在可调移液器架上。
b. 准备基质溶液，并将其加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，以避免溶液的蒸发。
2. 样品处理a. 将待测样品加入ELISA板的相应孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使样品均匀分布。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
3. 一抗孵育a. 将酶标记的一抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使一抗均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
4. 洗涤步骤a. 将洗涤缓冲液加入ELISA板的每一个孔中，每孔200μL。
b. 轻轻拍打ELISA板，使洗涤液充分覆盖孔底。
c. 倒掉洗涤液，重复以上步骤3次。
5. 二抗孵育a. 将酶标记的二抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使二抗均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
6. 洗涤步骤a. 重复步骤4中的洗涤步骤，以去除未结合的二抗。
7. 底物反应a. 将底物溶液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使底物均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
8. 反应住手a. 在适当的反应时间后，将住手液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在和浓度。
本文将介绍ELISA的操作规程，包括试剂准备、样品处理、板上反应、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，选择适当的缓冲液配方。
常用的缓冲液有PBS、TBST等。
按照配方将所需试剂溶解于适当的体积的去离子水中，并进行调节和混合。
确保所有试剂的pH值和浓度符合实验要求。
2. 标准曲线的制备：准备一系列已知浓度的标准样品，按照实验设计的需求进行稀释。
标准样品的浓度应该覆盖实验样品的范围，并且至少包含一个空白对照。
3. 酶标板的涂覆：根据实验需要，选择合适的酶标板（如96孔板），将需要检测的抗原或者抗体溶解在适当的缓冲液中，按照要求的浓度将其加入到酶标板的孔中。
尽量避免气泡的产生，并确保涂覆均匀。
三、样品处理1. 样品采集：根据实验目的，选择合适的样品类型（如血清、尿液、细胞上清等），并进行采集。
确保样品的采集过程符合规范，避免污染和损坏。
2. 样品稀释：根据实验要求，将样品进行适当的稀释。
通常，样品的初始浓度较高，需要进行多次稀释以使其浓度在标准曲线范围内。
3. 预处理：根据实验需求，对样品进行预处理，如去除杂质、离心沉淀等。
确保样品的处理过程不会影响到所需的分析结果。
四、板上反应1. 标准样品的加入：将标准样品按照实验设计的要求加入到酶标板的孔中。
每一个标准样品应该有至少两个孔进行重复测量，以提高结果的可靠性。
2. 样品的加入：将稀释后的样品加入到酶标板的孔中。
同样，每一个样品应该有至少两个孔进行重复测量。
3. 阳性和阴性对照的加入：为验证实验的准确性，加入阳性和阴性对照。
阳性对照顾该包含所需的抗原或者抗体，而阴性对照则不含。
4. 孔板的封闭：将酶标板封闭，避免样品的蒸发和污染。
可以使用密封膜或者盖板进行封闭。
五、洗涤1. 洗涤缓冲液的配制：根据实验要求，配制适当的洗涤缓冲液。
ELISA实验步骤
1.包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体.(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)2.封闭酶标反应孔:5%小牛血清置37℃封闭40min.封闭时将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中的气泡,封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.洗涤方法:吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔,放置2min略作摇动,吸干孔内液,倾去液体后在吸水纸上拍干洗涤次数3次3.加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl.将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.4.加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行. 37℃,30-60min之间.短于30min往往结果不稳定.每孔加100μl.洗涤同前。
5.加入底物液(现用现配):首选TMB-过氧化氢尿素溶液,OPD-过氧化氢底物液系统次之.底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分钟,加入终止液显色.6.终止反应:每孔加入终止液50μl终止反应,于20min内测定实验结果.7.结果判断:OPD显色后采用492nm波长,TMB反应产物检测需要450nm波长.检测时一定要首先进行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价.(数值的大小依具体检测要求而定.)。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和测量生物样品中特定抗原或抗体的存在。
本操作规程旨在提供详细的操作步骤，确保ELISA 实验的准确性和可重复性。
二、实验材料和设备1. 96孔ELISA板2. 微量移液器和相应的移液器头3. 洗板缓冲液4. 样品（抗原或抗体）5. 标准曲线样品6. 酶标记的二抗7. 底物液8. 停止液9. ELISA板洗涤器10. 阅读器三、实验步骤1. 准备ELISA板a. 将96孔ELISA板放置在工作台上。
b. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL洗板缓冲液。
c. 轻轻振动ELISA板，使洗板缓冲液均匀分布，并将其静置5分钟。
d. 倒出洗板缓冲液，然后用纸巾轻轻拍干ELISA板。
2. 加入样品和标准曲线样品a. 将待测样品和标准曲线样品分别加入不同的孔中，每个孔加入100μL。
b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间（根据实验需要）。
3. 洗涤ELISA板a. 将ELISA板放入ELISA板洗涤器中。
b. 加入足够的洗板缓冲液，启动洗涤器进行洗涤。
重复此步骤3次。
c. 倒出洗板缓冲液，用纸巾轻轻拍干ELISA板。
4. 加入酶标记的二抗a. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL酶标记的二抗。
b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间。
5. 洗涤ELISA板a. 重复步骤3中的洗涤步骤。
6. 加入底物液a. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL底物液。
b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间。
7. 加入停止液a. 使用微量移液器向每个孔中加入50μL停止液。
8. 测量吸光度a. 将ELISA板放入阅读器中，设置波长和吸光度测量模式。
b. 测量每个孔的吸光度值，并记录下来。
四、数据处理和分析1. 绘制标准曲线a. 使用标准曲线样品的吸光度值绘制标准曲线图。
b. 利用标准曲线计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
ELISA实验步骤及所需试剂耗材
ELISA实验步骤及所需试剂耗材第一步：涂布抗原1.96孔酶联免疫板（ELISA板）2.定性或定量的抗原或抗体溶液将所需的抗原溶液均匀涂布在ELISA板的孔中，通常使用100μL的抗原溶液加入每个孔，并在4℃下孵育过夜。
第二步：阻断1.阻断缓冲液（例如，3%牛血清蛋白）使用200μL的阻断缓冲液加入到每个孔中，并在室温下孵育2小时，以阻止非特异性结合。
第三步：添加抗体1.目标抗原特异性抗体2.酶标记的二抗（例如，HRP-抗鼠抗体，HRP-抗人抗体）分别添加100μL的抗体溶液和酶标记的二抗溶液到每个孔中，并在室温下孵育2小时，使抗体与抗原结合。
第四步：洗涤1.洗涤缓冲液（例如，PBS-T）使用洗涤缓冲液洗涤ELISA板的孔，将洗涤缓冲液加入孔中，静置2分钟，然后丢弃液体。
重复此步骤3次，以确保除去非特异性结合的物质。
第五步：酶底物添加1.酶底物（例如，TMB底物）添加100μL的酶底物到每个孔中，使其与酶标记的二抗反应，产生可检测的颜色反应。
第六步：反应终止1.停止溶液（例如，2M的硫酸）加入50μL的停止溶液到每个孔中，终止酶活性，使产生的颜色反应停止。
第七步：测定1.ELISA板读取仪使用ELISA板读取仪测量每个孔的吸光度，通常在450nm波长下测量，以确定抗原或抗体的浓度。
除了上述试剂和耗材外，还有一些其他重要的试剂和耗材也是需要的，例如：1.样品或标准物质：用于建立浓度标准曲线和样品浓度测量。
2.缓冲液：用于制备反应液和洗涤缓冲液。
3.小型离心机：用于混合和离心试管或孔板。
4.显微镜和玻片：用于观察ELISA结果和图像记录。
5.吸管和移液器：用于取样和溶液转移。
6.温度控制设备：用于控制实验过程中的温度。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或抗体在样本中的存在量。
本操作规程旨在提供详细的ELISA实验步骤，确保实验的准确性和可重复性。
二、材料和试剂准备1. 微孔板：96孔或其他规格的微孔板。
2. 抗原或抗体：根据实验需求选择适当的抗原或抗体。
3. 样本：待测样本，如血清、尿液等。
4. 酶标记抗体：选择与待测抗原或抗体特异性结合的酶标记抗体。
5. 酶标记底物：选择适当的酶标记底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。
6. 停止液：选择适当的停止液，如硫酸。
三、实验步骤1. 预处理a. 将微孔板的孔洗净，并将待测样本、阳性对照和阴性对照分别加入孔中。
b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使抗原或抗体与样本中的特定成分结合。
c. 弃去孔中液体，将孔洗净。
2. 添加酶标记抗体a. 将酶标记抗体加入每个孔中，使其与已结合在孔中的抗原或抗体结合。
b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使酶标记抗体与抗原或抗体结合。
3. 洗涤a. 弃去孔中液体，将孔洗净，重复2-3次，以去除未结合的酶标记抗体。
4. 添加酶标记底物a. 将酶标记底物加入每个孔中，使其与酶标记抗体结合。
b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使底物与酶反应产生显色。
5. 反应停止a. 加入适量的停止液，停止底物与酶的反应，防止进一步显色。
b. 使用酶标仪测量吸光度，记录各孔的光密度值。
6. 数据分析a. 根据实验设计和标准曲线，计算待测样本中特定抗原或抗体的浓度。
b. 统计数据并进行统计学分析，如平均值、标准差、t检验等。
四、实验注意事项1. 所有操作都应在洁净的实验室环境中进行，避免污染。
2. 严格按照实验步骤和操作规程进行，确保实验的准确性和可重复性。
3. 注意使用适当的阴性对照和阳性对照，以验证实验结果的准确性。
4. 注意控制实验条件，如温度、时间等，以保证实验结果的可比性。
ELISA实验步骤
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实验步骤
1.试剂准备：阳性对照品，酶标抗体，底物，
2.样品提取：所需工具（研钵）
3.设计酶标板布局；设两个阳性对照，两个空白对照(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)，样品孔。
4.加样品到反应孔；每个孔100ul
5孵育（室温下2小时）一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板
底应贴着水面，使温度迅速平衡。
为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。
若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。
湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。
无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。
室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。
室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。
应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
6酶标抗体的制备
7洗板；孵育结束后，将反应孔中试剂倒出，加入250ul的1倍PBST 缓冲液，之后快速倒出，重复2次。
8加酶标抗体；每孔100ul
9孵育；室温2小时
10PNP底物的制备
11洗板
12加底物
13孵育；30到60分钟
14终止反应；50ul 3摩尔的氢氧化钠（选作）。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定抗原或者抗体。
本操作规程旨在提供详细的步骤和指导，确保ELISA实验的准确性和可重复性。
二、实验材料准备1. 缓冲液：根据实验需求选择合适的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或者TBS（三氯甲烷缓冲液）。
2. 抗原或者抗体：根据实验目的选择合适的抗原或者抗体，并进行适当的稀释。
3. 酶标记的二抗：根据实验需求选择合适的酶标记的二抗，如HRP（辣根过氧化物酶）或者AP（碱性磷酸酶）。
4. 底物：选择合适的底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）或者ABTS（2,2'-联氨基二乙基三乙酸）。
5. 住手液：根据实验需求选择合适的住手液，如2M硫酸或者2M盐酸。
三、ELISA实验步骤1. 板涂覆a. 取ELISA板，将每一个孔加入适量的抗原或者抗体，通常为100-200ng/mL。
b. 将板封闭剂（如BSA或者牛血清白蛋白）加入每一个孔中，封闭非特异性结合位点。
c. 在4℃下孵育过夜，或者在室温下孵育2小时。
2. 样本处理a. 采集待测样本，如血清或者细胞上清。
b. 根据实验需求对样本进行适当的稀释。
c. 加入样本到孔中，每一个孔加入适量的样本，通常为50-100 μL。
d. 在室温下孵育1小时。
3. 二抗结合a. 弃去孔中的样本，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，每次洗涤时间为1-2分钟。
b. 加入酶标记的二抗到每一个孔中，每一个孔加入适量的二抗，通常为100-200 ng/mL。
c. 在室温下孵育1小时。
4. 底物反应a. 弃去孔中的二抗，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
b. 加入适量的底物到每一个孔中，通常为100-200 μL。
c. 在室温下孵育适当的时间，观察颜色的发展。
5. 反应终止a. 加入适量的住手液到每一个孔中，通常为50-100 μL。
b. 轻轻摇晃板，确保住手液均匀混合。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
elisa检测流程
elisa检测流程Elisa检测流程Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验室检测方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。
它具有高灵敏度和特异性，被广泛应用于医学、生物学、生物技术等领域。
本文将介绍Elisa检测流程的详细步骤和注意事项。
一、实验前准备在进行Elisa实验之前，需要准备试剂、标准样品和实验器材等。
试剂包括抗体、抗原、辅助试剂（如酶标底物、底物缓冲液等）等。
标准样品是已知浓度的抗体或抗原，用于建立标准曲线。
实验器材包括酶标板、离心管、试管、移液器等。
二、酶标板上样1. 将酶标板中的每个孔分别加入待检测样品、标准样品和阴性对照，每个样品重复3次，以确保结果的准确性。
2. 将加入样品的酶标板在室温下孵育一段时间，使样品中的抗体或抗原与酶标板中的特异性抗体或抗原结合。
三、洗涤1. 轻轻倾斜酶标板，将孔内的液体倒出。
2. 用洗涤缓冲液洗涤酶标板中的每个孔，洗涤次数根据实验要求而定，一般为3-5次。
3. 每次洗涤后，用吸球吸干酶标板中的液体，避免孔内残留的液体影响后续步骤的准确性。
四、添加检测抗体1. 加入特异性检测抗体，使其与已经固定在酶标板上的抗体或抗原结合。
2. 孵育一段时间，使检测抗体与酶标板上的复合物形成。
五、洗涤重复第三步骤，将酶标板中的非特异性结合物洗去，保留特异性结合物。
六、添加底物1. 加入底物缓冲液和酶标底物，使其与酶标板上的复合物发生反应。
2. 孵育一段时间，使底物转化为可检测的产物。
七、终止反应加入终止液，停止底物的反应。
终止液的选择根据酶标底物的性质而定。
八、测量结果使用酶标仪或光度计测量酶标板中每个孔的吸光度值。
根据吸光度值可以计算出样品中抗体或抗原的浓度。
九、结果分析根据标准曲线和吸光度值，可以确定样品中抗体或抗原的浓度。
同时，还可以根据阳性对照和阴性对照的结果，判断样品是否阳性或阴性。
十、实验注意事项1. 严格按照实验操作规范进行操作，避免污染和误差。
2. 注意试剂的保存条件和有效期，避免使用过期或变质的试剂。
ELISA试验方法
ELISA试验方法ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在与浓度。
其原理是将待测物与特异性抗体结合，并通过酶标记的二抗或底物使其发生可量化的颜色反应。
ELISA方法广泛应用于医学、生物学、食品安全等领域。
1.预处理样品：样品可以是血清、细胞上清、组织液等，一般需要对样品进行预处理以提取待测物。
例如，对于血清样品，可以通过离心涂片或凝胶层析提取。
2.涂覆抗原：将已知浓度的待测物或抗原溶液加入用于固相ELISA实验的微孔板中，并在恒温条件下孵育一段时间，使抗原与微孔板表面结合。
3.阻断非特异性结合：在加入待测样品之前，需加入阻断剂（如牛血清蛋白、干奶粉等）以阻止非特异性结合，降低背景信号。
4.加入待测样品/抗体：将经预处理的样品加入包含抗原的微孔板中，待孵育一段时间使待测物与固相抗原结合。
若检测抗体，则需加入已知浓度的酶标记二抗，二者进行特异性结合。
若检测抗原，则需加入酶标记特异性抗体。
5.洗涤：通过多次洗涤步骤去除未结合的物质，以降低背景信号。
6.酶标记反应：加入含有特定底物的反应液，待底物与酶标记物发生反应，产生可量化的颜色反应。
7.反应停止：在底物反应一定时间后，加入反应停止液停止底物的反应过程。
8.测量光密度：利用酶标仪或光度计等设备测量每个孔的光密度，光密度与待测物的浓度成正比。
虽然ELISA方法相对容易操作，但需要注意以下几点以确保实验结果的准确性：1.选择合适的抗原或抗体：重要的是选择和研究目的相匹配的抗原或抗体，以保证特异性。
2.控制实验条件：包括温度、孵育时间、洗涤步骤等，保证实验的可重复性。
3.注意阻断非特异性结合：非特异性结合会导致背景信号增加，影响结果的解读。
选择适当的阻断剂，并优化其浓度。
4.减少污染和交叉反应：采用严格的操作规范，注意个人防护，避免污染样品。
通过以上步骤，ELISA方法可以准确、快速地检测特定抗原和抗体的存在与浓度，对于科研和临床诊断具有重要意义。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在。
本操作规程旨在提供一个详细的步骤指南，以确保ELISA实验的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 微孔板：96孔的高吸附微孔板。
2. 缓冲液：含有适当浓度的PBS（磷酸缓冲盐溶液）和BSA（牛血清白蛋白）的缓冲液。
3. 标准品：包含已知浓度的抗原或者抗体的标准品。
4. 样品：待测的抗原或者抗体样品。
5. 探针：与待测物相对应的酶标记抗体。
6. 底物：适当的酶底物。
7. 住手液：住手底物反应的液体。
三、实验步骤1. 准备工作a. 将微孔板标记好，以便识别每一个孔。
b. 准备所需的缓冲液，并将其加热至适当的温度。
c. 将标准品和样品稀释至适当的浓度。
2. 涂覆抗原或者抗体a. 向微孔板中加入适量的抗原或者抗体溶液。
b. 将微孔板密封，并在4℃下孵育一夜。
c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。
3. 阻断非特异性结合位点a. 向微孔板中加入适量的缓冲液。
b. 将微孔板密封，并在室温下孵育1小时。
c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。
4. 加入探针a. 向微孔板中加入适量的探针溶液。
b. 将微孔板密封，并在室温下孵育1小时。
c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。
5. 应用底物a. 向微孔板中加入适量的底物溶液。
b. 将微孔板密封，并在室温下孵育适当的时间。
c. 加入适量的住手液住手反应。
6. 测量吸光度a. 使用ELISA阅读器测量每一个孔的吸光度值。
b. 记录吸光度值，并进行数据分析。
四、数据分析1. 标准曲线绘制a. 使用已知浓度的标准品制作一系列稀释液。
b. 测量每一个稀释液的吸光度值。
c. 将吸光度值绘制成标准曲线。
2. 计算样品浓度a. 使用标准曲线确定样品的浓度。
b. 根据实验需求，可以使用线性回归或者其他适当的计算方法。
五、实验注意事项1. 所有操作应在洁净的实验室环境下进行，以避免污染。
ELISA操作规程
ELISA操作规程标题：ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前准备、试剂配制、板涂覆、标准曲线绘制、样品检测等五个部分。
一、实验前准备：1.1 清洗实验用具：使用去离子水和洗涤剂彻底清洗酶标仪、试剂瓶、试管、多孔板等实验用具，确保无任何污染物残留。
1.2 检查试剂有效期：查看试剂瓶上的标签，确保试剂的有效期未过期，避免实验结果的误差。
1.3 准备实验台：清洁实验台面，并准备好所需的实验用品，如移液器、离心机、显微镜等。
二、试剂配制：2.1 样品稀释液的配制：根据实验需要，选择适当的稀释液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或BSA（牛血清白蛋白）溶液，并按照比例将其与样品混合。
2.2 酶标板涂层液的配制：将涂层抗体或抗原稀释至适当浓度，并将其均匀涂布在酶标板上，以便捕获待测物。
2.3 酶标记液的配制：将酶标记的抗体与酶底物反应，形成酶标记复合物，用于检测酶标板上的待测物。
三、板涂覆：3.1 预处理酶标板：将酶标板孔位用PBS或BSA溶液预处理，以避免非特异性吸附。
3.2 加入涂层液：将配制好的涂层液加入到酶标板孔位中，保持孔位内液体的均匀分布，避免气泡的产生。
3.3 孵育酶标板：将涂层的酶标板在适当的温度和时间下进行孵育，以促使待测物与涂层抗体或抗原发生特异性结合。
四、标准曲线绘制：4.1 准备标准品：选择适当的标准品，按照不同浓度进行稀释，以建立标准曲线。
4.2 加入标准品：将不同浓度的标准品加入到酶标板孔位中，每个浓度设置多个重复孔位，以获得可靠的结果。
4.3 检测与测定：使用酶标仪测定各个孔位的吸光度值，并根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，以后续样品的检测提供参考。
五、样品检测：5.1 样品处理：将待测样品与稀释液混合，并按照操作规程将混合液加入到酶标板孔位中。
elisa实验操作步骤
elisa实验操作步骤
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
操作步骤:
1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。
3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。
用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。
6．提前20分钟准备酶结合物工作液。
避光室温(22-25 ) ℃放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。
用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。
9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
10．洗板5次。
11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。
12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。
在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。
elsa检测步骤
"ELISA"（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
以下是ELISA的一般步骤：
1. 血清或样品制备：从实验对象中收集血清或样品，并进行适当的处理和稀释，以便在ELISA 中使用。
2. 涂覆抗原或抗体：将待检测的抗原或抗体溶液添加到微孔板（也称为ELISA板）的孔中，并将其静置一段时间，使其与孔壁结合。
3. 孔洗涤：将洗涤缓冲液加入孔中，倒掉孔内余液，重复此步骤数次，以去除非特异性结合物。
4. 加入抗体或样品：将需要检测的样品（如血清）或已知浓度的标准抗体添加到孔中，使其与已固定在孔壁上的抗原或抗体相互结合。
5. 孔洗涤：重复步骤3，以去除未结合的抗体或样品。
6. 添加检测抗体：将与酶标记物结合的二抗或探针抗体添加到孔中，使其与已结合的抗原或抗体相互结合。
7. 孔洗涤：重复步骤3，以去除未结合的检测抗体。
8. 加入底物：将酶底物加入孔中，使其与结合的检测抗体反应。
酶底物的反应产物会显示出可观察的颜色变化。
9. 反应停止：将反应停止液加入孔中，以停止底物的反应。
10. 测量：使用酶标仪或光度计测量每个孔中产生的颜色变化，检测并量化被测物的浓度。
ELISA方法可根据特定需要进行多种形式的变体和优化。
具体的步骤和试剂使用可能会因实验目的、检测对象和实验设计而有所不同，因此在进行ELISA实验时，应根据具体实验方案和相关说明书进行操作。
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实验步骤（以处理小鼠血清样品为例）：通用版
血清处理：将收集的小鼠血液样品室温静置40min~1h 后（不要超过1h），放在冰上待处理（不要超过4h），或者及时离心处理。
静置待血液析出血清后，3000rpm （1000g），4℃，10min 离心，离心后应呈现上层为无色或淡黄色透明血清，下层为凝集的红色血团。
若上层血清呈现淡粉色或红色，则表示该血液样本溶血，血清颜色越深则表示溶血程度越高。
吸取血清时若不小心吸到下层红色部分，则沿壁缓慢打回原EP 管，过度机械损伤会造成溶血。
用 1.5mlEP 管，可按吸出的血清量加入等体积的0.1M 的盐酸，即样品中HCl 的终浓度为0.05M。
若血清量很大，则最好按实验需要分装成小管，避免血清反复冻融，然后冻存于-80℃备用。
若做Elisa 实验，则取出所需要量的血清，待融化后再1:1 加入等体积的0.05M 的HCl，既将血清稀释了 4 倍，HCl 的终浓度仍然为0.05M，混匀后低速离心备用。
1. 取出整盒ELISA kit（保存于4℃冰箱）放在37℃培养箱预热0.5h 至常温，将摇床温度调至31℃，转速为150 转/min。
2. 用已灭菌的MQ H2O，稀释10XHRP wash buffer 至1X。
3. 取出所需数量的wells，放在96 孔底板上，板上可用数字标记好行列，避免出错，准备纸巾，铺8 层左右，比底板略大即可。
1X HRP wash buffer 300ul/well，沿着孔壁缓慢加入，以免破坏杯底的抗体。
加完后用手轻微震荡5s，迅速翻转，将液体甩入水池，再在纸巾上拍打，不能太轻，也不能太用力，杯底朝上，尽量将杯内所有液体倒干净，如上重复洗 3 遍，保证每孔湿润。
此后每次加入液体均沿着杯壁缓慢加入，移液枪枪头不可接触杯内液体。
加入不同样品时要及时更换移液枪枪头，加入相同液体时，可从不同方向沿杯壁加入，避免污染原管液体。
4. 在空白和标准品的wells 里，加入20ul Matrix solution。
空白对照设置1 孔即可，标准品为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625ng/ml 六个wells。
5. 在标准品的wells 里加入10ul Assay Buffer,在空白和样品的wells 中，加入30ul Assay Buffer。
6. 在标准品的wells 里加入20ul 标准品，在样品的wells 中，加入20ul 处理好的样品。
7. 加入Detection Antibody 50ul/well，若孔内有气泡，可用注射器的针头轻轻
戳破，但注意不要碰到杯内液体，避免不同孔内污染。
盖上贴纸，用手轻轻震荡5s，略混匀，注意不要将液体弹到贴纸上。
放入平板摇床，31℃( 温度过低会降低反应速率)150转/min，反应2h
8. 轻轻揭掉贴纸，防止杯内液体弹出粘在贴纸上，甩掉wells 内的液体，并在纸巾上拍打，用1X wash buffer 洗3 次，300ul 每次。
最后一次要倒净杯内液体（否则背景很高）。
9. Enzyme solution 100ul/well, 轻轻震荡混匀。
盖上贴纸，放在平板摇床上，31℃150转/min，反应30min。
10. 轻轻移除贴纸，甩掉wells 内的液体，用1X wash buffer 洗6 次，300ul 每次，洗完后用酒精喷湿的纸巾将wells 的底部擦干净透明，不要留纸屑和水渍，以免影响后来酶标仪的读值。
加入第 6 遍的wash butter 后，先不倒掉，保证孔内湿润的情况下，到公共实验室开启酶标仪，确保其可用。
再回实验室倒掉孔内液体，并拍打干净。
11. 加入Substrate solution 100ul/well，轻轻震荡混匀，盖上贴纸，平放入不透明袋子中，注意平稳不让液体黏在贴纸上，放入在平板摇床上，31℃150 转/min，反应15min（孔内液体会变蓝，标准品蓝色随浓度升高而逐渐升高）。
（如果颜色过淡，可适当延长时间）。
12. 加入Stop solution 100ul/well ，明显可见到孔内液体由蓝色变为黄色。
加完后轻轻震荡混匀，使其充分反应。
在5min 内用酶标仪分别在450nm 及590nm 波长下读吸光度（程序为事先设定好的）。
13. 空白值为空白well 的450 读数减去590 读数。
其余wells 的值为450 读值减去590读值，再减去空白值。
做出标准曲线后，再用所得公式计算样品中ghrelin 的含量。