四川师范大学分析化学第10章吸光光度法
第10章 吸光光度法
产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。
光电管 光电倍增管 光二极管阵列
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10.2.2 吸收光谱
A~l作图得
吸收曲线 (吸收光谱)
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•
最大吸收波长 lmax= 525nm。 吸收曲线是一种特征曲线
•
•
在最大吸收波长附近，吸光度测量的灵敏度最高
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1 S bc M 10 6 ( g / cm 2 ) 1000
将（1）式代（2）中得：
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S = M/ε
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摩尔吸光系数ε的讨论
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数； （2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长
等条件一定时，ε仅与： 扣除非待测组分的吸收
A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池） A （参比） = A （干扰）+ A （池）
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以显色反应为例进行讨论 若欲测 M-R 的吸收 试液 无吸收 基质吸收 无吸收 基质吸收 显色剂 无吸收 无吸收 吸收 吸收 lmax 溶剂 光 学 透 明
该物质的灵敏度越高。ε>105：超高灵敏；
ε=(6～10）×104 ：高灵敏； ε<2×104
：不灵敏。 （6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶 液在某一波长下的吸光度。
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例：氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在 650nm测定光吸收，A＝0.43,求S. (Nb原子量92.91)。
COOH HO CH3 Cl C Cl SO3H COOH O CH3
大学,分析化学第10章,吸光光度法
b 生色团和助色团 生色团: 含有π→π*跃迁的不饱和基团 助色团: 含非键电子的杂原子基团,如-NH2, -OH, -CH3… 与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强
2 物质颜色和其吸收光关系 互补色
吸收光 物质的颜色 颜色 波长范围( l ,nm)
黄绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰 多组分同时检测 原理： A = Al1-Al2 = （el1- el2）b c 波长对的选择： a.等吸光度点法，b.系数倍率法
例,苯酚与2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中 苯酚(x)的双波长分光光度法测定。
选l1为参比波长, l2为测量波长 得
摩尔吸光系数 e
A = Kbc
c: mol/L c: g/L
A = e bc A = abc a: 吸光系数
e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液
的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)
桑德尔(Sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光 程内所能检测到的吸光物质的最低含量。 单位：mg/cm2 S=M/e
.
AuCl4-
成盐反应
N HS C S C C O CH N (CH3 ) 2 N C C S O CH N (CH3 ) 2
+ Ag+
AgS
C
褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂III络合物测定草酸
吸附显色反应 达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色
3 显色剂
无机显色剂:
过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾 有机显色剂： 偶氮类：偶氮胂III
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计
第十章吸光光度法
特点：能在可见光谱区域内对物质作定性定量分析。采用光栅单色器、具有波长精度高，单色性好等优点。采用3 位LED数字显示，T.A.C直读。波长范围：330－800nm波长精确度：±2nm
752型紫外可见分光光度计
特点：采用全息闪耀光栅单色器，具有波长精度高，单色性好，杂散光低等优点。能自动切换钨卤灯和氘灯。采用3 位LED数字显示，具有T.A.C直读能。技术指标:波长范围：200－800nm稳定性：暗电流漂移0.5％(τ)3min
电磁波
波长范围
跃迁类型
分析措施
X-射线
10-1-10nm
K、L层电子
X射线光谱法
远紫外光
10-200nm
中层电子
真空紫外光度法
近紫外光
200-400nm
价电子
紫外光度法
可见光
400-750nm
比色及可见光度法
近红外光
0.75-2.5m
分子振动
红外光谱法
中红外光
2.5-50m
第一节、吸光光度法概述
原则系列法旳优点是仪器简朴，操作简便，而且可在复合光下进行测定.其缺陷是配制原则色阶比较费时，因为某些有色x
二、光电比色法与分光光度法
(一)、基本原理和特点1、原则曲线法光度法与目视法比较，其优点是:用光电池替代肉眼进行测量，消除了肉眼旳主观误差，提升了分析成果旳精确度.
第二节、吸光光度法旳基本原理
一、互补色光白光：复合光复合光 单色光 单色器单色光1 ＋ 单色光2 白光 互补色光
白 光
二、物质旳颜色和对光旳选择吸收
(1)、光吸收程度最大处旳波长，称为最大吸收波长，常用λmax表达.(2)、光吸收曲线与物质特征有关，这些特征客作为物质定性鉴定旳根据.(3)、构成量度不同旳同种物质旳溶液，在一定波优点吸光度随溶液旳构成量度增长而增大，这个特征可作为物质定量分析旳根据.
10第十章吸光光度法_50586
h E2 E0
S0
E0
物质对光的吸收满足Plank 条件
E
E2
E0
h
hc
分子基态的电子组态
1.用原子轨道线性组合法产生出各个分子轨道； 2.把电子加到每个分子轨道中去，在每个分子轨道中最多 加进两个电子（Pauli原理），由此产生分子的电子组态 ； 3.把电子对加到最低能量轨道中去（建造原理），从而产生 最低能量的电子组态（基态电子组态） 例：甲醛的分子轨道
：光子的波长（cm）
v：光速（2.99791010 cm.s-1）
h：Plank常数（6.625610-34 J·s ，焦耳·秒）
E
h
hc
↘，E ↗； ↗，E ↘
单色光、复合光、光的互补
单色光 复合光
光的互补
单一波长的光。
由不同波长的光组合而成的光。
若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光 为互补色光，这种现象称为光的互补。
非光谱法 （折射法，浊度法，旋光法）
光
（不以光的波长为特征讯号）
学
分 光谱法 析
分子光谱法 UV/Vis,IR,MFS,MPS 原子光谱法 AAS,AES, AFS
法
（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过
检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）
2.电化学分析法： 依据物质的电化学性质及其变化
3.色谱法：气相色谱, 液相色谱 4.质谱法、热分析法、放射化学法等
基于物质光化学性质而建立起来的分析方 法称之为光化学分析法。 分为:光谱分析法 和非光谱分析法。
光谱分析法是指在光（或其它能量）的作 用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光 或散射光的波长和强度来进行分析的方法。
第十章 吸光光度法
制作者：施忠斌 杨敏岚
10-1 吸光光度法 10-2 吸光光度法仪器
教学内容：物质对光的选择性吸收、光吸收定律及
其应用条件、摩尔吸光系数与灵敏度；显色反应及其 影响因素；吸光光度法的特点与应用、吸光光度法仪 器
教学重点：吸收光谱、工作波长的确定、线性范围、
检出限、准确度与精密度、回收率
const
A1,A2…
pKa= pH + lg(A－A B-)/(AHB－A)
即A为pH相对应的溶液的吸光度
▲ 测定中的干扰以及消除方法
1.化学法
测Co2＋ :(掩蔽法)
Co2+, Fe3+ (2)Sn2+ ⑴NaF Co2+ SCN－ Co(SCN)2 (蓝) 3FeF6 SCN－ Co(SCN)2
T%=T×100
∴A= ㏒I0/I=－㏒I/ I0=－㏒T= ㏒1/T= ㏒1/T×100 % =2－㏒T%
正
=kbc
A∝C
负
定量分析
A∝C 相关性还可用曲线表示：
A= a + kc
截 距
LD=3Sb / k(斜率)
试剂空白11次平行测定值的标准偏差 S=
√∑[（X - x）]/（n-1）
2
i
斜率=tgα
-3 -4 -3 -4
线性 负偏离 正偏离
1.入一定的单色光即应选用max处或肩峰处测定. 2. sol 均匀、透明、非散射性即吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件(酸度、浓度、介质等). 3. C=10 -3 ～10 -4（mol/L） 浓度增大，分子之间作用增强.
1.CR：应适宜，否则会引起副反应。CR由A∝CR 曲线确定
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物科学研究中的定量分析方法。
它通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收程度来定量分析物质的浓度。
吸光光度法基于光的著名的“比尔-朗伯定律”，该定律描述了物质溶液对光的吸收与其浓度之间的关系。
通过测量光的吸收度，我们可以推算出浓度。
吸光光度法的基本原理是根据物质溶液对特定波长的光的吸收程度与溶液中物质的浓度之间的线性关系。
具体来说，当光通过物质溶液时，物质分子或离子会吸收光的能量，使光强度降低。
根据比尔-朗伯定律，光的吸光度（A）与物质的浓度（c）之间存在如下关系：A=εlc，其中ε是吸光度的摩尔吸光系数，l是光程长。
通过测量光的吸光度和已知的吸光度摩尔吸光系数，我们可以计算出溶液中物质的浓度。
在实践中，吸光光度法通常使用分光光度计来进行测量。
分光光度计可以发射一束特定波长的光，并测量光通过样品溶液前后的光强度差异。
这种差异可以转化为吸光度，并用于计算物质的浓度。
吸光光度法有许多应用领域。
在化学分析中，吸光光度法可以用于分析金属离子、化学物质的浓度、酸碱度等。
它可以通过配备合适的试剂和仪器来满足不同的分析需求。
在生物科学研究中，吸光光度法被广泛应用于测量DNA、蛋白质和酶的浓度。
通过测量DNA和蛋白质在特定波长下的吸光度，可以确定它们的浓度，进而研究其相互作用、结构和功能。
吸光光度法还可以用于测量酶的活性，通过测量酶和底物之间的反应，可以确定酶的催化能力。
吸光光度法有许多优点。
首先，它是一种快速、简单和经济的分析方法。
与其他方法相比，吸光光度法仪器简单、成本低，且操作方便。
其次，吸光光度法具有较高的选择性和灵敏度。
通过选择合适的波长和试剂，可以实现对特定物质的高度选择性测量。
此外，吸光光度法对微量物质的测量也非常敏感，可以达到微克或纳克级别的浓度测量。
然而，吸光光度法也存在一些限制。
首先，该方法对于有色的物质比较适用。
对于无色物质，需要经历一系列的试剂反应使其形成有色产物，才能进行吸光度测量。
分析化学-吸光光度法
2010.3
分析化学（2010)
CYJ 9
Analytical Chemistry 分析化学
互 补 色 示 意 图
绿
500-580
黄
580-600
青
490-500
橙
600-650
白光
青蓝
480-490
红
650-750
蓝 紫
400-450
分析化学（2010)
450-480
2010.3
CYJ 10
Analytical Chemistry 分析化学
Analytical Chemistry 分析化学
吸光光度法
定义： 具有选择性 定义：是基于被测物质的 分子 对 光 具有选择性 的特性而建立的分析方法。 吸收的特性而建立的分析方法 吸收的特性而建立的分析方法。 包括：比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱 包括：比色法、 法等。本章我们重点讨论可见光区 可见光区的吸光光度 法等。本章我们重点讨论可见光区的吸光光度 法。
2010.3 分析化学（2010) CYJ 2
Analytical Chemistry 分析化学
化学分析与仪器分析方法比较
化学分析：常量组分 化学分析：常量组分(>1%)，Er 0.1%-0.2% ， 依据化学反应， 依据化学反应， 使用玻璃仪器
准确度高
灵敏度高 仪器分析：微量组分 仪器分析：微量组分(<1%)， Er 2%-5% ， 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器 依据物理或物理化学性质
分析化学（2010) CYJ 7
粒子性
2010.3
Analytical Chemistry 分析化学
2、光谱分区 、
吸光光度法
第十章吸光光度法一、物质对光的选择性吸收1、物质对光的选择性吸收2、朗伯-比尔定律适用于任何均匀、非散射的固液气体，作为检测手段时在适用于低浓度的溶液。
bc Kbc T I I A t ε====1lg lg 0A ：吸光度，T ：透射比，K ：吸收系数，b ：溶液厚度，c ：浓度，ε：摩尔吸收系数（单位是11--∙∙cm mol L ）二、分光光度计及吸收光谱1、分光光度计1光源：通常用钨丝灯，连续光谱在360~880nm 2单色器：A 、棱镜（用于可见光范围）B 、光栅（适用波长范围宽，色散不改变波长，具有良好的分辨率）3吸收池：可见光用玻璃吸收池，紫外区用石英吸收池4检测器（光电转换器）：A 、光电管（红敏光电管适用625~1000nm ，紫敏光电管适用200~625nm ）B 、光电倍增管（由光电管改进而来，灵敏度是光电管的200多倍，适用167~700nm ）2、吸收光谱（参比溶液的选择）1显色剂与试液都无色，用蒸馏水作参比2显色剂无色，试液有色（存在其他有色离子），用试液作参比3显色剂有色，4显色剂试液均有色，先掩蔽被测离子（时被测离子不与显色剂反应），再加入显色剂，一起作为参比5改变试剂加入顺序，使被测组分与显色剂反应，并以此作为参比三、显色反应及其影响因素1、显色反应的选择1干扰少（或干扰易排除），灵敏度高（410>ε）2有色化合物组成恒定，有一定的化学式3化学性质稳定4有色化合物与显色剂颜色差别要大（nm 60>∆λ）2、显色剂（有机）1磺基水杨酸：主要用于测定+3Fe ，与+3Fe 反应在pH=1.8~2.5呈红色，pH=4~8呈褐色，pH=8~11.5呈黄色2丁二酮肟：用于测定+2Ni ，在氢氧化钠中，有氧化剂（如过硫酸铵）存在时与+2Ni 反应呈红色。
31，10-邻二氮菲测量+2Fe 较好的试剂，pH=5~6下反应呈橘红色（加入还原防止被氧化，如盐酸羟胺）4二苯硫腙：测定+++++22222,,,,Hg Cd Zn Pb Cu 等重金属离子，可加入掩蔽剂消除重金属离子间的干扰5偶氮胂Ⅲ（铀试剂Ⅲ）：在强酸中与+++444,,U Zr Th生成有色物质。
第十章 吸光光度法S
现在五页，总共五十四页。
表6-2 物质颜色和吸收颜色的关系
物质颜色
吸收光
颜色
波长范围λ/nm
黄绿
紫
400~450
黄
蓝
450~480
橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝
绿蓝 蓝绿
绿 黄绿
黄 橙
480~490 490~500 500~560 560~580 580~600 600~650 650~750
现在二十页，
• 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈 直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时 ，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象( 吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比 尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会 引起较大的误差。
• 偏离朗伯－比尔定律的原 因主要是仪器或溶液的实际 条件与朗伯—比尔定律所要 求的理想条件不一致。
物质含量的方法。优点是仪器简单，操作 简便，适宜于大批试样的分析。灵敏度高 ，因为是在复合光-白光下进行测定，故 某些显色反应不符合朗伯-比尔定律时， 仍可用该法进行测定。主要缺点是准确度 不高，标准系列不能久存，需要在测定时 临时配制。
现在二十八页，总共五十四页。
二、分光光度计及其基本部件 分光光度计按工作波长范围分类，紫外
Infrared Spectrophotometry
→带状光谱 Band spectrum
现在二页，总共五十四页。
现在三页，总共五十四页。
3、可见光区中光的互补原理
• 单色光：具同一波长的光。 • 复合光：由不同波长组成的光。如白光。
• 紫外光：波长200~400 nm。
• 可见光：人眼能感觉到的光，波长在
、可见分光光度计应用于无机物和有机物含 量的测定，红外分光光度计主要用于结构分 析。分光光度计又可分为单光束和双光束两 类。以可见分光光度计为例介绍。
分析化学第10章-吸光光度法
电磁辐射波谱图
• 能 谱：波长很短(小于10nm)、能量大于102eV(如γ射线和X射线) 的电磁波谱，粒子性比较明显，称为能谱。——能谱分析法。 • 波 谱：波长大于1mm、能量小于10-3eV(如微波和无线电波)的电 磁波谱，波动性比较明显，称为波谱。——波谱分析法。 • 光学光谱：波长及能量介于以上两者之间的电磁波谱，通常借助 于光学仪器获得，称为光学光谱。——光谱分析法。 • 复合光：物质发出的光，是包含多种频率成分的光。 • 单色光：光谱分析中，常常采用一定的方法获得只包含一种频率 成分的光(单色光)来作为分析手段。 • 单色性：单色光的单色性通常用光谱线的宽度(或半宽度)表示。
波长范围/nm
400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-700
物质颜色和吸收光颜色的关系
(2) 物质对光的选择性吸收(CuSO4溶液为何只吸收黄色光?)
当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、 原子或离子与光子发生 “碰撞”，光子的能量就转移到分子、 原子上，使这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能态 （激发态）： M + hυ → M* 这个作用叫物质对光的吸收。 分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，仅当照射光
分子光谱——气态或溶液中的分子---电子能级、振动能级和转动 能级跃迁 --- 发射或吸收的是一定频率范围的电磁辐 射组成的带状光谱。 分子光谱有三个层次： 转动光谱－反映分子纯转动能级跃迁引起的转动能量的变化。 分子转动能量小于 0.05 eV ，相当于远红外光的能 量，在远红外波段。 振动光谱－反映分子纯振动能级跃迁引起的转动能量的变化。分 子振动能量为0.05-1.0 eV，位于中红外波段。 电子光谱－反映分子纯电子能级跃迁引起的转动能量的变化。分 子转动能量小于 1.0-20 eV ，位于可见或紫外光波段。 固体光谱——炽热的固体物质及复杂分子受激后---发射出波长范 围相当广阔的连续光谱。
第十章吸光光度法
第⼗章吸光光度法分析化学教案第⼗章吸光光度法要求：1.掌握吸光光度法的基本原理，朗伯⽐⽿定律和偏离⽐⽿定律的原因；2.了解⾦属离⼦与显⾊剂发⽣显⾊反应的原理和影响显⾊反应的因素，掌握选择显⾊反应的⼀般原则；3.了解⼏种常⽤的显⾊剂；4.了解光度测量条件的选择，提⾼分析结果的准确度；5.掌握吸光光度法的应⽤。
进程：§10-1 概述吸光光度法是基于被测物质的分⼦对光具有选择性吸收的特点⽽建⽴起来的分析⽅法，它包括⽐⾊分析法、可见及紫外吸收光度法以及红外光谱法等。
本章着重讨论可见光区的吸光光度法（⼜称分光光度法，简称光度法）。
⼀、分光光度法的特点分光光度法同化学分析法中的滴定分析法、重量分析法相⽐，有以下特点：1. 灵敏度⾼分光光度法测物质的浓度下限（最低浓度）⼀般可达10-5~10-6mol/L，相当于含量低于0.001~0.0001%的微量组分。
如果将被测组分加以富集，灵敏度还可提⾼1~2个数量级。
该⽅法适⽤于微量组分的测定。
举例：略（见课件）2. 准确度较⾼⼀般分光光度法的相对误差为2~5%。
3. 操作简便，测定速度快分光光度法的仪器设备不复杂，操作也简便。
如果采⽤灵敏度⾼，选择性好的显⾊剂，再采⽤掩蔽剂消除⼲扰，可以不经分离直接测定，⽽且速度快。
4. 应⽤⼴泛吸光光度法既可测定绝⼤多数⽆机离⼦，也能测定具有共轭双键的有机化合物。
主要⽤于测定微量组分，也能测定含量⾼的组分（⽤⽰差光度法或光度滴定）。
还可测定络合物的组成、酸（碱）以及络合物的平衡常数。
⼆、物质的颜⾊和光的选择性吸收物质呈现的颜⾊与光有着密切的关系。
光是⼀种电磁波，如果按照波长或频率排列，则可得电磁波谱图（四师P.275表10-1）。
光具有两象性：波动性和粒⼦性。
波动性就是指光按波动形式传播。
例如：光的折射、衍射、偏振和⼲涉现象，就明显地表现其波动性。
λ·ν= c式中：λ—波长（cm）；ν—频率（赫兹）；c—光速（≈3×1010cm/s）光的粒⼦性：如光电效应就明显地表现其粒⼦性。
第十章 吸光光度法(Absorption photometry
10
（二）朗伯－比耳定律
朗伯于1760年，发现：Ab，A K ' b 比耳于1852年，发现：AC，A K ' ' C
吸光质点之间无相互作用
后人对这两个定律进行了总结，发现：
[前提]： .入射光为平行单色光且 1 垂直照射； 2.均匀非散射体系；稀溶液（C 0.01mol / L）； 3. 4.无荧光和光化学现象发 生。 1 A lg KbC 朗伯－比耳定律 T
透射光 It
[定义]： 透射比
It T I0
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
全部吸收
全部透射
T = 0.0 %
T = 100.0 %
T ↗，溶液对光的吸收 ↘； T ↘，溶液对光的吸收 ↗。 物质对光的吸收程度用吸光度A表示。实验 证明：A= f (C、b、[ Io] ) = lg Io/It = lg1/T=-lgT
表面活性剂
a. 胶束增溶 b. 形成三元络合物
－－实验确定，有点运气
6. 干扰及消除
a.干扰 干扰物本身有色或与显色剂显色，+干扰 干扰物与M、N反应，使显色不完全，－干扰
b. 消除 控制酸度，使M显色，干扰不显色 氧化还原，改变干扰离子价态 掩蔽 校正系数 参比液：可消除显色剂和某些离子的干扰 选择测，可避开干扰的吸收 增加显色剂用量，将干扰灌饱 分离
但对A却不确定 A bC (1)
当b为定值，两边微分： bdC (2) dA (2) (1) : dA dC Er (3) A C
我们关心的是浓度测量的相对误差，它就等于吸光度测量 的相对误差，从图10-5可以看出，在刻度标尺上，dA在不同位 置，不是定值，故改成dT来算。
吸光光度法Absorptionphotometry
不同物质具有不同的吸收光谱，每种物质都有其 独特的吸收特征。
光谱分析
通过分析物质的光谱，可以确定其组成和浓度。
光的吸收与吸收光谱
光的吸收
当光通过介质时，某些波长的光会被介质吸收， 其余的光则通过。
吸收光谱
不同物质具有不同的吸收光谱，每种物质都有其 独特的吸收特征。
光谱分析
通过分析物质的光谱，可以确定其组成和浓度。
有机物分析
对于一些有机物，如酚类、胺类、苯 甲酸等，吸光光度法可用于测定其浓 度，通过在特定波长下测量溶液的吸 光度值，可推算出有机物的含量。
在化学分析中的应用
金属离子检测
吸光光度法可用于检测水样、土壤、 食品等样品中的重金属离子，如铜、 铅、锌等，通过测定特定波长下的吸 光度值，可计算出金属离子的浓度。
未来发展方向与展望
提高准确度和精密度
通过改进实验方法和仪器设备，提高吸光光度法的准确度和精密 度。
拓展应用领域
进一步拓展吸光光度法的应用领域，特别是在新兴领域如生物医学、 环境监测和食品安全等方面的应用。
发展新方法和技术
结合其他技术如光谱技术、色谱技术等，发展新的吸光光度法方法 和仪器，提高检测效率和准确性。
01
准备标准溶液和待测样 品，配制适当的缓冲溶 液。
02
将比色皿放入分光光度 计中，调整波长至所需 测量波长。
03
分别将参比溶液和待测 溶液倒入比色皿中，记 录吸光度值。
04
根据标准曲线计算待测 样品的浓度。
实验步骤与操作流程
01
准备标准溶液和待测样 品，配制适当的缓冲溶 液。
02
将比色皿放入分光光度 计中，调整波长至所需 测量波长。
在环境监测中的应用
吸光光度法的基本原理
吸光光度法的基本原理吸光光度法基于比尔－朗伯定律，该定律描述了光的吸收与被溶质浓度的关系。
根据该定律，在特定波长下，溶液中溶质的浓度与溶液对光的吸收程度成正比。
该法通过测量溶液对一定波长的光的吸收来分析溶液中的物质浓度。
基本原理步骤如下：1.选择适当的波长：吸光光度法选择的波长通常是溶液中目标物质最大吸光度的波长。
这是因为溶液对于特定波长的光的吸光度最高，测量结果最准确。
2.准备标准曲线：首先制备一系列已知浓度的标准溶液，然后使用吸光光度计测量每个标准溶液的吸光度。
利用这些测量值，建立起目标物质浓度与吸光度之间的线性关系，形成标准曲线。
3.测量未知溶液的吸光度：使用吸光光度计测量未知溶液的吸光度。
4.通过标准曲线确定浓度：根据标准曲线，找到未知溶液的吸光度所对应的目标物质浓度。
光源发出可见光或紫外光，经过单色滤光片选择特定的波长，然后通过溶液样品室。
样品室内的溶液吸收部分光能，其吸收比例与溶液中目标物质的浓度成正比。
吸收后的光通过光电传感器转化为电信号，然后由记录仪记录下来。
1.波长选择：选择最大吸光度处的波长可以提高测量结果的准确性。
2.光程长度：增加样品室中光线通过的距离可以增加吸收效果，提高灵敏度。
3.标准曲线的制备：制备更多浓度的标准溶液可以得到更准确的标准曲线，提高测量结果的精确度。
4.校正：通过对溶剂的吸光度进行校正可以减少溶剂对测量结果的影响。
总结：吸光光度法是一种有效的分析化学方法，通过测量溶液对特定波长光的吸收来确定目标物质的浓度。
该方法基于比尔－朗伯定律，通过建立标准曲线和测量未知溶液的吸光度来确定浓度。
吸光光度法在科学研究和工业生产中有着广泛的应用。
第十章 吸光光度法PPT
§10-1 物质对光的选择性吸收
A Kbc
吸光系数a：
A abc
摩尔吸光系数：
c－gL-1 b－cm a=A/( b c)， L· g-1· cm-1 c －mol L－1 b－cm =A/(b c)，L· mol-1· cm-1
A bc
关系： ＝ M a
灵敏度的判断 ▪ 通常，在λmax处： ε﹥ 105 超高灵敏的方法 高灵敏的方法 中灵敏的方法 ε＝（6~10）×104 ε＝（2~6）×104
E h h
c
E - - - -光 子 的 能 量 ， J h - - - -Plank 常数， 6.625 10-34 J s
电磁波谱图
波长 /nm 光谱名 称 跃迁类 型
10-1 1
10
102
400
760 103 104 105 106 107 108 可见光 外层电子 比色及可见光 度法
1.朗伯定律
-dI=k1Idb
logI0/I=K1b
2.比耳定律
-dI=k2Idc
logI0/I=K2c
3.朗伯-比耳定律
如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化，都影响物 质对光的吸收，则上述两个定律可合并为朗伯 - 比耳定律， 即得到： logI0/I=Kbc 令：A=logI0/I 则： A=KbC
(2) 摩尔吸收系数κ 当式中浓度c的单位为mol/L，液层厚度的单位为cm时， 则用另一符号κ表示，称为摩尔吸收系数，它表示物质的 浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。其单 位为L/mol· cm。这时朗伯-比耳定律就变为: A＝κbc
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一、光的基本性质
光的电磁波性质
10-2 nm 10 nm
x 射 射 线 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
无 线 电 波
105 cm
可 见
光(400-750nm)
光的波粒二象性
光的折射
波动性
λν
光的衍射
光的偏振 光的干涉
粒子性
E
光电效应
有干扰
2、灵敏度高
2.待测溶液吸光度的选择 控制 A = 0.2 - 0.8 T = 65 % ~ 15% 方法 选择 C 选择 b
3.参比液的选择
原则： 扣除非待测组分的吸收
A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池）
A （参比） = A （干扰）+ A （池） 以显色反应为例进行讨论 若欲测 M-R 的吸收 试液
1.灵敏度高
适用于微量组分1%-10-3%甚至可低至10-4%_10-5%
2.操作简便快速 3.准确度高
相对误差为2%-5%,对微量组分来说绝对误差并不大 例:XT=0.15%,相对误差为2% 绝对误差为0.15%×2%=0.003%
4.应用广泛
几乎所有的无机物和许多有机物都能直接或间接 的进行测定
例题ຫໍສະໝຸດ 利用邻二氮菲光度法测定Fe.已知溶液中亚铁 为140ug/L，液层厚度2cm，在520nm处测 得透射比为0.603，计算吸光系数，摩尔吸光 系数和桑德尔灵敏度。
解:
A=－㏒T= － ㏒0.603=0.220
a=A/bc=o.220/2×140×10-6=7.86×102 L/g.cm
ε=aM= 7.86×102×55.85=4.4×104
S3 h E3 E2 E1
S2
S1
h E2 E0
S0
E0
物质对光的吸收满足条件
E E2 E0 h hc
物质对光的选择吸收
物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构 成了物质对光的选择吸收基础。
例：
A物质
E1 E0 2.5ev
1 ev = 1.6×10-19 J.
E h hc
E：光子的能量（J, 焦耳） ν ：光子的频率（Hz, 赫兹） λ：光子的波长（nm）
c：光速（2.9979X1010cm.s-1） h：plank常数（6.6256X10-34 J.s ）
单色光、复合光、光的互补
单色光 单一波长的光 由不同波长的光组合而成的光 若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光 为互补色光，这种现象称为光的互补。
(光谱半宽度)
吸收池 检测器
玻璃，光学玻璃，石英 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多 道分析器）
计算机
表头、记录仪、屏幕、数字显示
单波长单光束分光光度计
0.575
光源
单色器 吸收池
检测器
显示
单波长双光束分光光度计
光束分裂器
光源 单色器
比值
吸收池
检测器
K：比例常数 物质的性质
A Kcb
入射光波长 温度
b ：吸光液层的厚度，光程， 厘米 c：吸光物质的浓度， g / L, mol/ L
取值与浓度的单位相关
c：摩尔/ L
ε a
摩尔吸光系数， L · –1 · -1 mol cm
A cb
吸光系数， L · –1 · -1 g cm
c：g / L
10.3显色反应及其影响因素
10.3.1显色反应及其条件的选择 （一）显色反应及显色剂的基本要求： 1.选择性好 2.灵敏度高 3.对比度要大，波长相差60nm以上 4.稳定，组成恒定
10.3.2影响显色反应的因素
1.酸度的影响 副反应 M + nR = MRn OHH+ RH = 1 R- + H+ 2
存在型体的变化
生成不同配比的络合物
例，磺基水杨酸 – Fe 3+ pH = 2 ~ 3 pH = 4 ~ 7 FeR FeR2 紫红色 橙色
pH = 8 ~ 10
FeR3
黄色
酸度的选择
理论计算 M + nR = MRn OHH+
[MRn] n [ R]n [M ] [MRn] lg lg n n lg[R] [M ]
第10章 吸光光度法
教学目的
了解可见光吸收光谱的产生及特征； 掌握吸光光度法的基本原理:朗伯-比耳定律;吸光系数 和桑德尔灵敏度的定义和计算; 了解偏离比尔定律的原因。 了解分光光度法仪器的原理、构造: 了解显色反应及影响因素 了解光度法测量误差及测量条件的选择 熟悉适宜吸光度范围的控制;入射光波长和参比溶液的 选择。 熟悉吸光光度法在定量分析中的应用:
A hc E
B 物质
同理，得：
6.62 1034 3 1010 2.5(ev ) 1.6 1019
5
4.774 10 (cm)
477.4nm
E1 E0 2.0ev
B hc
E
620.6nm
定性分析与定量分析的基础
定性分析基础 物质对光的选择 吸收
系数不同。
相互关系: ε = aM 的推导
A bc1 (mol L1 ) A abc 2 (g L1 ) C2 C1 M C2 C1M A abcM A bc aM
桑德尔灵敏度S
1、定义：当光度仪器的检测极限为A＝0.001 时，单位截面积光程内所能测定的吸光物质的 最低质量。ug/cm2
lg n lg M(OH) n lg R(H) n lg[R]
以
M(OH)， R(H) ~ pH
lg
[ MRn] ~ pH 作图， [ M ]
A
可得适宜pH范围
实际工作中，作 A ~ pH 曲线，寻找适宜 pH 范围。
pH
2.显色剂的用量 M + nR = MRn
2、比耳定律
如果液层厚度不变，溶液的吸光度与溶液的浓度 成正比。
有
Io lg K 2b It
3、朗伯-比尔定律
当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸 光度与吸光物质浓度及吸收层厚度成正比。
吸光度与透光率的关系
Io lg KbC It Io A lg KbC It It T Io A lg T
显示
仪器实物
仪器实物1
10.2.2吸收光谱
根据某种溶液对不同波长的光的吸收程度不同， 以波长为横坐标，吸光度作纵坐标作图，得一 曲线，称为吸收曲线。 吸收曲线的特点： 1.都有一个最大吸收峰； 2.同一溶液浓度不同时，最大吸收波长不变； 3.在最大吸收波长处测量吸光度,其灵敏度最高.
绿 蓝绿 黄绿 黄 橙 红
复合光
光的互补
绿蓝 蓝
下一页
紫 紫红
二、 物质对光的选择性吸收
物质的颜色与光的关系
光谱示意 完全吸收
复合光
表观现象示意
完全透过 显示为兰色 吸收黄色光
吸收光与电子跃迁
光作用于物质时，物质吸收 了可见光，而显示出特征的 颜色，这一过程与物质的 性 质及光的性质有关。
物质对光的吸收
A acb
相互关系:
ε = aM
摩尔吸光系数的特性
反映吸光物质对光的吸收能力，也反映了用吸 光光度法测定该吸光物质的灵敏度； 摩尔吸光系数还与
ε=f（t，λ ）
（1）同一吸光物质在不同波长下的ε值是不 同的，有一个最大吸收波长下的最大摩尔吸光 系数
εmax，此时可达到最大灵敏度
（2）对不同吸光物质，最大摩尔吸光
2.介质不均匀引起的偏离
二、化学因素引起的偏离
[ MRn] n [ M ][ R ]n
定量反应
[MRn] lg lg n n lg[R] [M ]
[MRn] 99.9% [M ]
lg n n lg[R] 3
A 实际工作中，作 A ~ CR 曲 线，寻找适宜 CR 范围。
3 lg n lg[R] n
透过率
入射光 I0 透过光 It
透光率定义：
It T I0
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
全部吸收
全部透过
T = 0.0 %
T = 100.0 %
光吸收的基本定律_朗伯-比尔定律
1、朗伯定律 如果浓度一定，则光的吸收程度与液层的厚度 成正比。 有：
Io lg K1b It
S=bCmin
2、S与 的关系
ε
M S
桑德尔灵敏度S
110 L mol cm b 1cm A 0.001
4 1 1
此时不为定值 C 1107 mol L1 min
1104 L mol 1 cm1 b 5cm A 0.001
此时不为定值 Cmin 110 mol L 但他们的乘积 Cb 1107 为定值
8 1
推导
单位换 算 A bc 0.001
M S
0.001 cb 1L 1000cm3 c(mol L1 ) cb b(cm) M ( g mol 1 ) 106 ( g ) c( g cm 3 )b(cm) M 103 3 1000cm 0.001 M 3 S Cb M 10