介孔材料固定化酶的研究进展及其应用前景_刘佳

2014 年第43 卷第4 期・357・石油化工PETROCHEMICAL TECHNOLOGY［收稿日期］ 2013 - 09 - 10；［修改稿日期］ 2013 - 12 - 26。

［作者简介］ 刘佳（1986—），女，河南省新乡市人，博士，电话 0411 - 84379219，电邮 jialiu@ 。

联系人：杨启华，电话 0411 - 84379552，电邮 yangqh@ 。

［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（21273226）。

特约述评酶是生物体细胞内产生的具有催化功能的特殊蛋白，在常温常压下可高效率、高专一性地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。

模仿自然界，用以酶为催化剂的生物催化技术取代传统的化学品生产方式，是实现资源利用生态化和可持续发展的重要趋势。

研究者们普遍认为，生物催化将是继医药和农业革命之后，生物技术革命的第三个浪潮，以生物催化为核心的工业生物技术在支撑社会进步和经济发展的技术体系中的地位已经被提到了空前的战略高度［1］。

尽管酶的工业开发和利用是当代生物技术革命的重要课题，但目前可大规模生产和应用的商品酶只有数十种。

天然酶在工业应用上受到限制的主要原因有：大多数酶脱离其生理环境后极不稳定，生产应用过程中的条件会使酶失活；酶的分离纯化工艺复杂，会对反应体系造成污染且无法实现连续化生产；酶制剂的成本较高［2］。

为解决上述问题，酶的固定化技术应运而生。

所谓酶的固定化是指将自由的酶分子束缚或限域在一定空间内，但仍保留其催化特性并可回收使用的一类技术［3］。

固定化酶在技术上的显著优势使得该领域的研究受到广泛关注，氧化硅基介孔材料的出现为酶的固定化开辟了新的发展空间。

氧化硅基介孔材料具有在2～50 nm 内连续可调的孔径、较大的比表面积和孔体积、易调变的孔道化学组成、良好的生物兼容性及稳定性等优点，是固定化酶的理想介孔材料固定化酶的研究进展及其应用前景刘 佳1，2，杨启华1（1. 中国科学院 大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023；2. 中国科学院大学 化学与化工学院，北京 100029）［摘要］ 评述了介孔材料固定化酶的研究新进展，重点分析了酶分子被固载到介孔材料的纳米孔中后，载体孔径尺寸和纳米孔微环境对固定化酶催化活性及其稳定性可能产生的影响。

同时，以水解酶和氧化还原酶为例，对介孔材料固定化酶在生物柴油制备、生物质转化、手性药物及精细化学品合成、生物燃料电池及生物传感器制备等领域的应用前景进行了展望。

［关键词］ 生物催化；硅基介孔材料；酶固定化［文章编号］ 1000 - 8144（2014）04 - 0357 - 07 ［中图分类号］ TQ 426.97 ［文献标志码］ AResearch Progress and Application Prospect of Enzyme Immobilization onMesoporous Silica -Based MaterialsLiu Jia 1，2，Yang Qihua 1（1. Dalian Institute of Chemical Physics ，Chinese Academy of Sciences ，Dalian Liaoning 116023，China ；2. School of Chemistryand Chemical Engineering ，University of Chinese Academy of Sciences ，Beijing 100029，China ）［Abstract ］ This paper reviewed the current status of the development of enzyme immobilization on mesoporous silica-based materials ，in particular with focus on the main factors(pore diameter and nanopore microenvironment) influencing the catalytic properties of enzymes immobilized in nanopores of mesoporous supports. The application prospect of the immobilized enzymes in biodiesel production ，biomass conversion ，synthesis of fi ne chemicals and chiral pharmaceuticals ，fabrication of biofuel cells and biosensors was also discussed using hydrolase and oxidoreductase as model enzymes. ［Keywords ］ biocatalysis ；mesoporous silica-based materials ；enzyme immobilization・358・石油化工PETROCHEMICAL载体［4-6］。

1996年，Diaz等［7］研究组首次报道了几种球形蛋白（细胞色素C、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）在孔径为4 nm的有序介孔材料MCM-41上的物理吸附。

十几年来，随着新型介孔材料的不断涌现、新的固定化酶反应体系的不断拓展以及对影响固定化酶性能的相关因素的逐渐深入探索，介孔材料固定化酶的研究领域取得了一系列进展。

本文通过概述影响固定化酶催化活性及其稳定性的关键因素，介绍了氧化硅基介孔材料固定化酶的研究进展，并对其在工业生物催化中的应用前景进行了展望。

1 介孔材料固定化酶的影响因素1.1 孔径大量研究表明，介孔材料纳米孔的孔径大小会对固定化酶的吸附量、活力保留及稳定性产生直接影响［8-9］。

当载体的孔径远小于酶分子的直径时，酶分子不易被固载到载体的纳米孔中，而主要分布于载体的外表面，因此无法利用孔壁对酶分子起到保护作用。

但当载体的孔径远大于酶分子的直径时，对于通过物理吸附作用（疏水作用、静电作用、氢键及范德华力）固载到纳米孔中的酶，酶与载体之间的弱相互作用难以有效地将酶分子稳定在纳米孔中，酶的流失较严重。

因此，一般认为当介孔材料纳米孔的直径略大于酶的分子尺寸时，所得的固定化酶更容易表现出较高的稳定性［10］。

Takahashi等［11］分别以具有不同孔径的FSM-16，MCM-41，SBA-15介孔材料为载体，详细考察了介孔材料的孔径大小对其固载辣根过氧化物酶（HRP，分子直径约4.6 nm）的影响。

研究结果表明，当以孔径较小的FSM-16介孔材料（孔径为2.7 nm）为载体时，酶的吸附量较低。

他们认为这是由于酶分子无法进入载体的孔道内部，而仅吸附在介孔材料的外表面所致。

Lykourinou等［12］研究发现，当载体的孔径（1.3 nm）略小于细胞色素C酶蛋白（2.6 nm×3.2 nm×3.3 nm）的分子尺寸时，细胞色素C酶蛋白可在发生一定的构型变化后进入到载体的纳米孔中。

经荧光光谱表征，他们进一步发现存在于纳米孔中的细胞色素C酶蛋白的构型介于其天然构型与完全失活的构型之间。

Liu等［13］研究发现，分子尺寸为3 nm×4 nm×5 nm的洋葱假单细胞菌脂肪酶（PCL）可通过简单的物理吸附作用进入孔口尺寸（小于4 nm）略小于PCL直径的FDU-12材料中，且所得的固定化酶可在外消旋苯乙醇的手性拆分反应中循环使用多次。

由此可以推测，当载体的孔径远小于酶分子尺寸时，酶通过解折叠等构型变化的方式进入纳米孔中会变得较困难，因此可以通过先吸附酶、后缩小孔口尺寸的方法来实现介孔材料对酶分子的封装。

具体地说，首先选取孔径略大于酶分子直径的介孔材料作为载体，在将酶分子吸附到纳米孔中后，通过硅烷化处理大幅缩小载体的孔口直径，使其远小于酶分子的尺寸（同时大于底物及产物分子的尺寸），从而将酶分子物理限域在纳米孔内，防止其在反应过程中从纳米孔内流失到反应溶液中。

Ma等［14-15］采用具有二维六方相直形孔道的MCM-41介孔材料作为载体，首先将猪胰腺脂肪酶（PPL）吸附到MCM-41介孔材料的纳米孔中，然后以乙烯基三甲氧基硅烷为硅烷化试剂，与MCM-41介孔材料孔口处的表面硅羟基进行反应，可有效地将载体的孔口尺寸从4.5 nm缩小到1.4 nm，从而将PPL封装在MCM-41介孔材料的纳米孔道中。

循环实验证明，采用该方法得到的固定化酶具有更高的循环稳定性。

但由于在封口过程中会产生甲醇等对酶的活性有毒害作用的试剂，经过封口处理的固定化酶活力仅为自由酶活力的40%。

最近，Liu等［13］以具有三维联通笼形孔道结构的FDU-12材料（纳米笼直径为17 nm，孔口尺寸小于4 nm）为载体，以六甲基二硅氮烷（HMDS）为硅烷化试剂，在30℃的温和条件下对吸附有PCL的FDU-12载体进行封口（见图1）。

图1 酶分子在FDU-12材料的纳米笼内的封装及其在两相生物催化反应中的应用［13］Fig.1 Schematic diagram of encapsulating enzymes into the nanocageof FDU-12 for performing biphasic biocatalytic reactions［13］.HMDS：hexamethyldisilazane.OilBiocatalysisWaterHMDSUV-Vis表征结果显示，采用该方法可成功地将PCL封装在FDU-12的纳米笼内，有效抑制其在・359・第4 期催化反应中的流失。

同时由于FDU-12材料特殊的笼形孔道结构及封口过程中避免了甲醇等有害试剂的产生，该封装方法可有效地保持PCL的催化活性。

活性测试结果表明，封口后PCL的活力为自由酶活力的1.7倍。

此外，HMDS修饰不仅能将PCL封装在FDU-12材料的纳米笼中，同时还可将FDU-12材料的外表面由亲水性转变为双亲性，所得的固体催化剂颗粒可有效地稳定在水/油两相界面，为制备固体乳液（Pickering emulsion）及进行两相生物催化提供了一种新的途径（见图1）。

1.2 纳米孔微环境酶分子对其周围环境条件非常敏感，酶所催化的生物化学反应都是在特定的微环境内发生的。

在细胞中，酶分子周围的细胞液中除分散着各种各样的细胞器外，还充斥着大量的蛋白、核酸、多糖等，同时酶分子周围的微环境都具有特定的亲疏水性、氧化还原性、离子强度、pH等，这些特定的微环境是保证细胞内的酶具有高催化活性、高选择性及高稳定性的关键因素［16-18］。