临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法ppt课件
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《pcr质量管理》ppt课件
测定前的标本采集
❖采集时间 ❖标本采集过早或过晚都能够会给出假阴
性结果。当病原体感染机体后，特定的 临床标本中，病原体含量能到达PCR检 出程度的点，并不能覆盖整个感染过程， 能够只是在感染或疾病发生开展过程中 的某一个时间段。
❖如：呼吸道冠状病毒，感染发病后3-4d，
测定前的标本采集
❖标本采集部位、类型和采集量 ❖1、在临床静脉血液标本的采集上，普
❖ 简单反复：把低值的标本再做一次 ❖ 缘由讨论性反复：加大样本量重做一次
如何判别乙肝患者抗病毒治疗疗效？
❖当一个HBV-DNAPCR定量检验结果为 7.2E+08IU/ml的乙肝患者，在抗病毒药物如 拉米夫啶或干扰素治疗，两周后，再检测， 如结果为5.2E+08IU/ml，再两周后，结果为 9.0E+08IU/ml，抗病毒治疗有效吗？
测定前的标本采集
❖标本采集中的防污染 ❖1、最好采用一次性无菌及无核酸酶的资料，
不用途置便可直接运用，采集中要特别留意 防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等。 ❖2、如运用玻璃器皿，必需经0.1%DEPC水处 置后高压。以使能够存在的RNase失活。
❖总而言之，标本的搜集及适当的预处置，对
测定前的标本采集
❖ 扩增效率E：指的是一个循环后的产物添加量与这 个循环的模板量的比值，其值位于0-1。在PCR的 前20或30个循环中，E值比较恒定，为指数扩增期， 随后E值逐渐降低，直至0，此时PCR到达平台期， 不再扩增。
质控物运用的功能
❖弱阳性质控样本最常见的失控缘由： ❖1、核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的
❖三、标本运送与保管： ❖标本一经采集，那么应尽能够快的送至检测
实验室。 ❖⑴、DNA的标本，如是在无菌条件下采集，
新冠核酸检测标本采集培训课件pptx
采集部位
将拭子插入肛门约3-4cm，轻 轻旋转并停留数秒。
采集技巧
确保拭子头部充分接触直肠黏 膜，避免触及肛门周围皮肤。
注意事项
操作过程中应注意患者隐私和 舒适度，避免过度刺激直肠。
血液标本采集方法
采集前准备
让患者保持空腹状态，避免剧烈运动和情绪 波动。
采集技巧
确保针头斜面完全刺入静脉内，避免反复穿 刺造成血肿。
新冠核酸检测标本采集培训 课件pptx
目录
• 标本采集前准备 • 标本采集方法与技巧 • 标本保存与运输要求 • 实验室接收与处理流程 • 质量控制与结果解读 • 安全防护与废弃物处理
01 标本采集前准备
了解新冠核酸检测原理
01
02
03
核酸检测原理
通过特异性引物对新冠病 毒核酸进行扩增，检测其 存在与否。
采集部位
选择肘部静脉作为穿刺点，消毒皮肤后穿刺 采血。
注意事项
操作过程中应注意无菌操作原则，避免污染 血液标本。
03 标本保存与运输 要求
标本保存条件及时间限制
标本保存条件
新冠核酸检测标本需在2-8℃条件下 保存，确保病毒RNA的稳定性。
时间限制
标本采集后应尽快进行检测，若无法 及时检测，可在2-8℃条件下保存不超 过72小时。长时间保存可能导致病毒 RNA降解，影响检测结果。
标本运输包装要求
标本包装
使用专用的生物安全运输箱或符 合规定的标本运输容器进行包装 ，确保密封性良好，防止泄漏。
标识清晰
在运输容器上贴有醒目的生物危 害标识和新冠核酸检测标本标识 ，以便识别和区分。
运输过程中温度控制
温度监测
在运输过程中，使用温度监测设备对标本进行实时温度监测，确保温度在28℃范围内。
将拭子插入肛门约3-4cm，轻 轻旋转并停留数秒。
采集技巧
确保拭子头部充分接触直肠黏 膜，避免触及肛门周围皮肤。
注意事项
操作过程中应注意患者隐私和 舒适度，避免过度刺激直肠。
血液标本采集方法
采集前准备
让患者保持空腹状态，避免剧烈运动和情绪 波动。
采集技巧
确保针头斜面完全刺入静脉内，避免反复穿 刺造成血肿。
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目录
• 标本采集前准备 • 标本采集方法与技巧 • 标本保存与运输要求 • 实验室接收与处理流程 • 质量控制与结果解读 • 安全防护与废弃物处理
01 标本采集前准备
了解新冠核酸检测原理
01
02
03
核酸检测原理
通过特异性引物对新冠病 毒核酸进行扩增，检测其 存在与否。
采集部位
选择肘部静脉作为穿刺点，消毒皮肤后穿刺 采血。
注意事项
操作过程中应注意无菌操作原则，避免污染 血液标本。
03 标本保存与运输 要求
标本保存条件及时间限制
标本保存条件
新冠核酸检测标本需在2-8℃条件下 保存，确保病毒RNA的稳定性。
时间限制
标本采集后应尽快进行检测，若无法 及时检测，可在2-8℃条件下保存不超 过72小时。长时间保存可能导致病毒 RNA降解，影响检测结果。
标本运输包装要求
标本包装
使用专用的生物安全运输箱或符 合规定的标本运输容器进行包装 ，确保密封性良好，防止泄漏。
标识清晰
在运输容器上贴有醒目的生物危 害标识和新冠核酸检测标本标识 ，以便识别和区分。
运输过程中温度控制
温度监测
在运输过程中，使用温度监测设备对标本进行实时温度监测，确保温度在28℃范围内。
临床PCR检验标本采集、处理、保存及核酸提取方法PPT66页
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
临床PCR检验标本采集、处理、保存及 核酸提取方法
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
▪
谢谢！
66
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法
如肝素抗凝剂纤维素和硝酸纤维素过度uv照射后的矿物油手套滑石粉标本容器或采样器材上含有的抑制物肝素对mlv逆转录酶和taqdna聚合酶均很强的抑制作用如果临床标本为肝素抗凝则在核酸纯化过程中标本中的肝素可结合于dna和rna上尽管肝素和核酸本身都带正电荷
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
血红蛋白
1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+ 浓度无关。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的 PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链 DNA结合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth 聚合酶在含8%（V/V）血液情况下，仍可扩增。 因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现从 临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。 不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑 制物的敏感性不一样 。
核酸纯化
核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代， 在七十年代和八十年代中传统的核酸沉淀溶解 分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。
传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白 酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。
一般核酸提取试剂促使靶核酸从细 胞内释出的原理
靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆 内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微 生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌 细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在 于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用 一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的 蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。
肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑 制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过 程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，尽管 肝素和核酸本身都带正电荷。 对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、 反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。 每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶 活性。 在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 ℃2小时) 可去除 肝素的抑制作用。
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
血红蛋白
1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+ 浓度无关。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的 PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链 DNA结合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth 聚合酶在含8%（V/V）血液情况下，仍可扩增。 因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现从 临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。 不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑 制物的敏感性不一样 。
核酸纯化
核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代， 在七十年代和八十年代中传统的核酸沉淀溶解 分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。
传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白 酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。
一般核酸提取试剂促使靶核酸从细 胞内释出的原理
靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆 内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微 生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌 细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在 于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用 一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的 蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。
肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑 制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过 程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，尽管 肝素和核酸本身都带正电荷。 对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、 反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。 每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶 活性。 在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 ℃2小时) 可去除 肝素的抑制作用。
临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法共59页
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
Hale Waihona Puke 56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
Hale Waihona Puke 56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
样本采集及保存-PPT文档资料
取5ul用于PCR检测
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使 用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使 用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
临床样本的采集运输和保存及核酸提取课件
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后
使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
4. 核酸的鉴定
浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
浓度鉴定
DNA：
1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度
酚 抽 提 法 提 取 步 骤：
DNA酚抽提法示意图
主要试剂的作用：
EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜的稳定性
SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发 出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）
EB与DNA的结合
纯度鉴定
紫外分光光度法：
在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA A260与A280之比 应在1.80 (1.60~1.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高 于此值表明有RNA的残留量
研究背景
样本的采集、处理 样本的保存 样本的运输 DNA的提取 RNA的提取
研究背景
一、样本的采集、处 理、保存及运输
临床标本的正确采集、运送、保存 的重要性
临床检验的质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一
（一）、样本的采集
地贫检测样品采集： 外周血: ≥5mL 脐带血: 0.5~1mL 羊 水：20～30mL 绒 毛：≥15mg 唾 液 组 织
临床检验标本采集运送及保存-课件-PPT
标本检查的意义
标本采集检查的意义 协助明确疾病诊断 制定治疗措施 推测病程进展 观察病情
标本采集原则
遵照医嘱 充分准备 严格查对 正确采集 及时送检
标本采集原则
遵照医嘱 根据医嘱采集标本
标本采集原则
采集前做好充分准备 医护人员准备 病人准备 物品准备 明确检查项目、检验目的、选择采集方
由于体位的因素，在确立参考值时，应 考虑门诊和住院病人可能存在的结果差 异，故采集标本时要注意保持正确的体 位和保持体位的一致性。
病人准备
5．时间 时间对人的影响可大致分为线性和周期
性两种 线性时间影响：最主要的是年龄 周期性时间影响：最主要的是季节循环、
月经周期和昼夜变化。
病人准备
病人准备还应考虑病人的生物钟规律， 特别是激素水平分析，如女性生殖激素 与月经周期密切相关；胆固醇则在经前 期最高，排卵时最低；纤维蛋白原在经 前期最高，血浆蛋白则在排卵时减少。 生长激素于入睡后会出现短时高峰。胆 红素、血清铁以清晨最高；血浆蛋白在 夜间降低；血Ca往往在中午出现最低值。 故采血时间应在相同时间进行。
病人准备
喝带咖啡的饮料，可引起淀粉酶(AMY)、 AST谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶 (ALP)、血糖（GLU）、儿茶酚氨等升高。
但空腹时间过长，会使血糖（GLU）和 蛋白质降低，而使胆红素升高。
病人准备
(2) 高脂餐后2～4h采血，多数人ALP含量增高， 主要来自肠源性同工酶，且与血型有密切关系， O型或B型兼为Le+分泌型者增高更为明显。
前言
古人云：“差若毫厘，谬以千里”，高 质量的标本是高质量检验的第一步，没 有高质量的标本，再先进、精密的仪器 也得不出准确的结果，相反，医护人员 往往出于对先进仪器的信赖而忽视标本 质量引起的结果偏差，盲目相信检验结 果，影响诊断、治疗及疗效判断。
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊
液,尿液等,可按水样标本的方式离 心取沉淀后 , 提取核酸。沉淀样本 的保存同上。
乳汁
乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏 菌等的PCR检测。
乳汁中分枝杆菌DNA的提取
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 , 充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。
基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法课件
9
• 全血标本
• 通常用来提取外周血单个核细胞核酸： 如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA 等。
• 抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼 酸纳，不使用肝素。
10
• 前处理：
• 1）加适量的红细胞裂解液（破膜液）， 裂解全血中的红细胞。
• 2）再加适量的细胞核裂液（破核液）， 裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释 放出来。
51
• 200µl血清（浆） • 加入200µl 20%PEG6000 • 4oC，3小时，12000rpm，4oC离
心15分钟 • 弃上清，加500µl裂解液（含异硫氰
酸胍、-β巯基乙醇等），混匀
52
• 加50µl NaAc，500µl饱和酚：氯仿： 异戊醇（50：49：1），充分混匀， 冰浴10分钟
21
7．组织
• 组织有新鲜组织和石蜡切片。 • 新鲜组织的处理步骤： • 先用生理盐水洗二次，然后将其
捣碎或剪碎（用眼科剪），加蛋 白酶K消化后提取核酸
22
• 石蜡切片用于核酸提取，需先用 二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化 后进行DNA提取。
23
标本的保存
24
• 血清（浆）
• HBV：分离出的血清（浆）如不立 即提取核酸，保存于-20oC待检。
• 用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分 泌物（由医护人员采集），置无 菌试管或EP管内
• 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml， 打匀，12000rpm，离心5分钟
17
• 同上，重复洗涤一次 • 弃上清，沉淀即可用于DNA提取
18
• 5．体液
• 体液标本，包括胸水、腹水、脑 脊液、尿液等，可直接离心，取 沉淀物提取核酸。
13
具体方法：
• 全血标本
• 通常用来提取外周血单个核细胞核酸： 如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA 等。
• 抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼 酸纳，不使用肝素。
10
• 前处理：
• 1）加适量的红细胞裂解液（破膜液）， 裂解全血中的红细胞。
• 2）再加适量的细胞核裂液（破核液）， 裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释 放出来。
51
• 200µl血清（浆） • 加入200µl 20%PEG6000 • 4oC，3小时，12000rpm，4oC离
心15分钟 • 弃上清，加500µl裂解液（含异硫氰
酸胍、-β巯基乙醇等），混匀
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• 加50µl NaAc，500µl饱和酚：氯仿： 异戊醇（50：49：1），充分混匀， 冰浴10分钟
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7．组织
• 组织有新鲜组织和石蜡切片。 • 新鲜组织的处理步骤： • 先用生理盐水洗二次，然后将其
捣碎或剪碎（用眼科剪），加蛋 白酶K消化后提取核酸
22
• 石蜡切片用于核酸提取，需先用 二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化 后进行DNA提取。
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标本的保存
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• 血清（浆）
• HBV：分离出的血清（浆）如不立 即提取核酸，保存于-20oC待检。
• 用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分 泌物（由医护人员采集），置无 菌试管或EP管内
• 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml， 打匀，12000rpm，离心5分钟
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• 同上，重复洗涤一次 • 弃上清，沉淀即可用于DNA提取
18
• 5．体液
• 体液标本，包括胸水、腹水、脑 脊液、尿液等，可直接离心，取 沉淀物提取核酸。
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具体方法：
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外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存 于-70℃下.
10
痰
痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定 标本。
痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变 性剂液化。
如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。
8
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
9
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。
（2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3%
Tween 20)
13
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬 20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
14
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰
6000g离心10分钟，弃上清
加入裂解液50ul，60℃温育30min
90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物
5
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。
样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。
实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
6
临床标本的处理和保存
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘 稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上 清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按 上述直接离心取沉淀即可。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
18
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊 液,尿液等,可按水样标本的方式离 心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本 的保存同上。
7
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
19
乳汁
乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏 菌等的PCR检测。
2
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
3
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分 核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确
与否 临床PCR检验操作中最易出问题的环节
4
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
16
棉拭子
在使用PCR方法检测性病病原体时,临 床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。
如不立即用于核酸提取,则需保存于70℃,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。
液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃ 下。
11
痰标本处理的基本模式
通用模式 简单模式
12
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
取5ul用于PCR检测
15
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
1
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。
2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
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痰
痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定 标本。
痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变 性剂液化。
如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。
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全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
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外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。
（2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3%
Tween 20)
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一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬 20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
14
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰
6000g离心10分钟，弃上清
加入裂解液50ul，60℃温育30min
90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物
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标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。
样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。
实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
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临床标本的处理和保存
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘 稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上 清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按 上述直接离心取沉淀即可。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
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体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊 液,尿液等,可按水样标本的方式离 心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本 的保存同上。
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血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
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乳汁
乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏 菌等的PCR检测。
2
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
3
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分 核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确
与否 临床PCR检验操作中最易出问题的环节
4
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
16
棉拭子
在使用PCR方法检测性病病原体时,临 床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。
如不立即用于核酸提取,则需保存于70℃,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。
液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃ 下。
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痰标本处理的基本模式
通用模式 简单模式
12
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
取5ul用于PCR检测
15
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
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检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。
2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%