第三章 生物材料预处理、细胞破碎和液固分离

• 2.目的物的稳定性
– 干燥法、有机溶剂对活性影响大
– 保护性措施
率、低的能
耗和便于后 步提取这三 方面权衡。
• 3.破碎效果和产物释放率
– 动物细胞：渗透压冲击、冻融法 – 微生物细胞：结合酶法
• 高释放率又不能使细胞碎片太小
第三节 液-固分离
• 一、过滤 • 1.过滤方式： -常规过滤：料流与过滤介质垂直
1. 细胞及蛋白质的处理 （1）加入凝聚剂
• 凝聚作用： • 指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散 双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的 分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。 • 某些无机盐可使细胞、细胞碎片和蛋白质等 胶体颗粒发生凝聚作用而被去除。
• 胶体粒子稳定的原因：
– 带同种电荷静电排斥作用 – 表面水化作用，形成水化层
三、化学法 1.化学试剂处 理 2.制成丙酮粉
四、生物法 1.酶解法
2.自溶
• 一、机械法 • 原理：剪切力 1.高压匀浆器 • 原理：进入高 压室的细胞悬 浮液被强迫通 过一个狭窄的 小孔，产生液 相剪切力引起 细胞破碎。
不宜采用高压匀浆法的微生物：
• 易造成堵塞的团状或丝状真菌，
• 较小的革兰氏阳性菌，
（6）加各种沉淀剂沉淀 — 沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀 在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离 予如互氯乙酸 盐、水杨酸盐、钨酸盐、，苦味酸盐、．鞣酸盐 、。过氯酸盐等形成沉淀。在碱 性溶液中，能与 一些阳离子如 Ag+、Cu2+、zn2+、Fe3+和 Pb2+等形成沉淀只如在四环素 发酵液中加入的硫 酸锌，可促进一些蛋白质沉淀。
（2）加入絮凝剂 • 絮凝剂：有机高分子，易溶，链长，活性功能基 团多 • 絮凝作用： – 当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈 吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分 子聚合物的许多链节分别吸附在不同的颗粒的 表面上，形成架桥联接，形成粗大的絮凝团沉 淀出来，有助于过滤。
影响因素：
• 分子量：大，效果好；过大， 溶解度↓ • 用量：低浓度增加用量有助架 桥，浓度过高吸附饱和失去架 桥作用，降低了效果。 • pH：影响功能团电离度，电离 度↑，链伸展， 效果↑
四、生物法 1.酶解法： • 机理：利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊 的化学键
-加入酶：溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等
G
+
-
溶菌酶
溶菌酶、EDTA
常 用 的 溶 酶
G
放线菌
酵母菌
溶菌酶
β-葡聚糖酶
霉菌
植物
几丁质酶、
纤维素酶、半纤维素酶
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
酶解法的优点
• 发生酶解的条件温和 • 能选择性地释放产物 • 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整， 便于后步分离等 • 但酶水解价格高，故小规模应用较广
• 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反 复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白 质变性。
3.渗透压冲击法 • 原理： • 细胞在浓盐中平衡，再投入水中膨胀破裂 。
三、化学法
1.加入化学试剂
• 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。
– 碱：溶解除细胞壁外大部分组分，改变pH，改 变蛋白质的电荷性质 – 有机溶剂：如丁醇、丙醇、三氯甲烷等，他们 能溶解细胞膜上的脂质化合物，使细胞结构破 坏，而将胞内产物抽提出来。但是，这些溶剂 容易生物活性物质 破环，使用时应考虑其稳定 性，操作要在低温下进行，处理后还必须将抽 提液中的有机溶 剂进行分离回收。
• 2. 自溶：
诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶 的活力，以达到细胞自溶的目的。 微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。 – 酵母细胞：45～50℃，12-24h
五、选择破碎方法的依据
• 1.规模及成本
– 大规模：高压匀浆、珠磨 – 实验室规模：超声波振荡
适宜的操作
条件应从高
的产物释放
第三章 生物材料的预处理、细 胞破碎和液-固分离
• 第一节 生物材料的预处理
• 第二节 细胞破碎 • 第三节 液-固分离
第一节 生物材料的预处理
• 一、确定预处理方法的依据
• 二、动物材料的预处理 • 三、细胞培养液的预处理
一、确定预处理方法的依据
1. 生物活性物质存在方式与特点 —胞外： 多数微生物酶如淀粉酶、蛋白酶、糖化酶常大量存 在于胞外培养液中。而合成酶类、代谢酶类、遗传物质 和代谢中间物则存在于细胞内，如DNA聚合酶、细胞色 素C等。 微生物酶是指起着催化作生物体系中特定反应的、由 微生物活细胞产生的蛋白质。作为催化剂的微生物酶， 它可以加速三种反应：水解反应、氧化反应和合成反应 。
3.目的物稳定性
• 不稳定的：要防失活 • 青霉素---pH4.8-5.2，低温 • 蛋白类---高级结构 • 稳定的：可采用较剧烈的变性和处理条件，沉淀 杂质蛋白. 如：链霉素，1943年美国 S.A.瓦克斯 曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生 产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效 作用，开创了结核病治疗的新纪元。 • 如链霉素稳定性较好，可在 pH 2.8~3.2，75℃加 热处理，提高过滤速度。链霉素为白色无定形粉 末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶 剂，强酸、强碱条件下不稳定。
• 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损 伤匀浆阀）
适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。
2.高速珠磨机 • 原理：玻璃 小珠与细胞 悬液一起快 速搅拌，研 磨作用，细 胞破碎。
操作过程中会产生热量，易造成某些 生化物质破坏，故磨室还 装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻璃小珠。
3.超声波振荡器
成功地把人的基因移入大肠杆菌生产出生长激素，每升工程
菌液含生长激素2.4mg，治疗一例病人只需100多升菌液。目 前已开始人工生产并进入临床应用试验。
2.后续操作的要求 • 一般要求：滤液澄清、pH 适中、有一定 的浓度
• 不同后续操作有不同的要求
• 离子交换---高价无机离子、澄清度等严格控 制 • 溶剂萃取---蛋白质含量较低，防乳化
— 错流过滤： 料液与过滤介质表面平行的大流量冲刷
错流过滤优点： • 过滤收率高 • 滤液质量好 • 减少处理步骤
• 2.过滤设备 • 板框过滤机
真空鼓式过滤机
• 3.过滤介质和助滤剂 • （1）过滤介质
二、物理法 1.干燥法 原理：干燥后的菌体，期细胞膜的渗透性发 生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后 用丙 酮、丁醇或缓冲液溶剂处理时，胞内 物质就会被抽提出来。
气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25～30℃ 的气流中吹干；真空干燥多用于细菌；冷冻干燥 适用于较不稳定的物质。
• 2.反复冻融法 • 将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后 在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 原理： • 细胞膜疏水键结构破裂，增加细胞亲水性 • 冰晶粒使细胞破裂
• 操作条件： 搅拌：初期，快好；后期，会 破坏絮凝团

（3）变性作用 • 天然蛋白质分子受到某些物理因素（如热、紫外线照 射、高压和表面张力等）、化学因素（如有机溶剂、 脲、胍、酸、碱等）影响时，生物活性丧失，溶解度 降低，不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改 变。 • 用途： 杂蛋白质变性沉淀析出 • 方法： 加热、大幅度改变pH，加有机溶剂、重金属盐或表面 活性剂
二、动物材料的预处理
• 绞肉机绞碎:提取蛋白质和酶 • 匀浆和组织捣碎:一些胞内产物不能有效地提取， 须通过特殊的匀浆才行。在实验室常用的是玻璃 匀浆器和组织捣碎器，工业上可用高压匀浆泵。
三、细胞培养液的预处理
为什么需要预处理？
• 可溶性粘胶状物质：杂蛋白、不溶性多糖等 • 粘度增加、影响提取操作 • 无机盐 • 在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化 物质的交换容量。
第二节 细胞破碎
• 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁， 细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围 的细胞浆合称原生质体。 • 动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。 • 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗 透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主 要来自于细胞壁。
一、机械法 二、物理法 1.干燥 1、匀浆法 2.冻融 2、珠磨法 3.渗透压 3、超声波 冲击
• 无机盐促凝聚作用：
– 加入相反电性电解质，中和胶体表面电荷，降 低了双电层的排斥力 – 无机盐在水中的水化作用，破坏了胶粒水化层
• 影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化合 价以及无机盐的用量等。
• 通常培养液中细胞或菌体带负电荷，常采用高价 阳离子促其凝固。
• 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+ • 常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3· 2O、AlCl3· 2O 18H 6H 、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。
（4）吸附
• 方法： — 加入吸附剂：活性碳除热原
— 加入反应剂：相互作用形成沉淀吸附蛋白质
四环素发酵液：黄血盐+硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾 K2Zn3[Fe(CN)6]2的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等 黏附在其中而除去。 枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液： 氯化钙+磷酸盐生成磷酸钙盐沉淀（吸附、助滤），
三、化学法
1.加入化学试剂
– 表面活性剂：改变膜的通透性，细胞溶解
• 胞内异淀粉酶：0.1%SDS，30℃振荡30h
2.丙酮粉 • 保存+破碎 – 脱水脱脂，细胞结构松散 方法： – 组织或匀浆悬浮0.01mol/LpH6.5的磷酸缓冲溶 液中，0℃ 一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积 的-15 ℃ 丙酮内，10min后离心过滤取其沉淀 ，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥得。