凝胶过滤
凝胶过滤名词解释
凝胶过滤名词解释
凝胶过滤是一种常用的物质分离和纯化方法，通常用于分离生物分子（如蛋白质、核酸等）或颗粒（如细胞、病毒等）。
在凝胶过滤中，通过使用一种类似于海绵的凝胶材料作为分离层，较大的分子或颗粒无法穿过凝胶的孔隙而被滞留在上层，较小的分子或颗粒则可以通过凝胶的孔隙移动到下层。
因此，凝胶过滤可以根据样品中分子或颗粒的大小将它们分离开来。
凝胶过滤常用于分离生物样品中的某些组分，用于去除高分子量杂质、富集目标分子或净化样品。
常见的凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和硅凝胶等，选择适当的凝胶材料取决于待分离的分子或颗粒的大小范围和特性。
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法是生物化学领域常用的两种分离和纯化方法。
它们在分子大小分离和蛋白质结构分析中发挥着重要作用。
今天，我们将深入探讨这两种方法之间的区别，以便更好地理解它们的应用和优势。
一、原理1. 凝胶过滤色谱法：凝胶过滤色谱法是一种按照分子大小分离物质的方法。
它利用具有特定孔径大小的凝胶填料，大分子无法进入凝胶孔隙而直接流出，而小分子则能够进入孔隙而被滞留，从而实现分子的分离和纯化。
3. 凝胶渗透色谱法：凝胶渗透色谱法是一种根据分子在凝胶中的渗透速度来分离物质的方法。
它利用凝胶填料形成的三维网络结构，分子在凝胶中的渗透速度与其分子大小成反比，因此分子越大，其在凝胶中的渗透速度越快，分子越小，渗透速度越慢，从而实现分子的分离和纯化。
二、区别1. 分离原理不同：凝胶过滤色谱法是根据分子大小的不同把大分子和小分子分离开来的，而凝胶渗透色谱法则是根据分子在凝胶中的渗透速度的不同进行分离的。
2. 分子范围不同：在凝胶过滤色谱法中，适用于分离分子量较大的物质，而凝胶渗透色谱法适用于分离各种分子量的物质，并且对于高分子更为有效。
3. 分离效果不同：凝胶过滤色谱法可以获得较好的分离效果，但对于高分子的分离效果不如凝胶渗透色谱法。
而凝胶渗透色谱法可以实现对高分子的高效分离。
三、应用凝胶过滤色谱法常用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子，用来检测生物大分子的分子大小和形态。
而凝胶渗透色谱法除了用于生物大分子的分离外，还可以用于溶液中各种溶质的分子量测定。
四、个人观点以上就是凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别和应用。
在实际科研工作中，选择合适的色谱方法对于提高分离效率和分析准确性非常重要。
我们需要根据样品的特性和需要进行全面评估，选择合适的色谱方法进行分离和分析。
总结回顾通过本文的讨论，我们对于凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法有了更全面的了解。
这两种色谱方法在生物化学和生物医药领域具有重要的应用价值，能够帮助科研人员进行生物大分子的分离、纯化和分析，对于推动生物技术和医药领域的研究具有重要的意义。
第四章 凝胶过滤
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二、分配系数Kd
衡量组分被排阻程度的一个特征参数 介质内部组分的浓度 介质外部组分的浓度 C内 C外
Kd=
=
A：当分子量大到完全不能进入颗粒内部，即完全被排阻，此时C内=0，
Kd=0。
B：当分子量小到完全可以自由进入到凝胶颗粒内部，在分配达到平衡时， 凝胶内部与外部组分的浓度相等，此时Kd=1。 C：在一般情况下，凝胶层析中，流动相和固定相溶液的性质是相同的，所
械强度大于2B，筛孔也小于2B。 以上三种胶：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶本身的理化性质
不稳定，机械强度比较低，流速慢。称为软胶。
Sepharose 与1，3-二溴异丙醇在强碱条件下反应后，即形成CL型交联琼脂 糖。其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性 都有了提高。 琼脂糖凝胶的最大优点是对生物大分子非特异性的吸附最小，回收率高。
它是以甲撑双丙烯酰胺做交联剂，以过硫酸铵为催化剂，在N,N,N`,N`四甲基乙二胺（TEMED）加速剂的作用下，将丙烯酰胺（单体）聚合而 成。当单体浓度改变时，可得到吸水率不同的产物。
产品型号： Bio-gel P-2到P-300，数字相当于排阻限度的1000分之一。 通常聚丙烯酰胺凝胶为珠状颗粒，并以干胶形式出售，使用前必须溶涨。
2014-8-1
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A：Vt-Vo的值太小，洗脱峰便拥挤在一起，不容易分离 B：通过增加Vt来提高分辨率 C：柱床体积不变，减少上样量 D：减少Vo，减少粒径范围 Vt≈ Vo+Vi Vo→Kd=0，选用兰色葡聚糖2000（分子量200万），呈兰色，在各种型号的 凝胶中都被完全排阻。 Vi →Kd=1，选用硫酸铵等与凝胶无吸附力的小分子物质。
凝胶过滤法
凝胶过滤法
DNA的凝胶过滤是一种分子筛选法，主要是利用凝胶内部由水分子组成的网状结构，将DNA的特定长度分离开来。
此方法需使用凝胶，凝胶可以选择两类，一类是采用核苷酸聚合体测定DNA长度，另一类是利用磁性凝胶分离DNA测定其重复性结构。
对凝胶进行处理后，可以将DNA连接到凝胶上，然后将凝胶放入一种特定的溶液中，利用溶液的流动作用就可以分离出不同长度的DNA。
凝胶过滤法的优点是简单快捷，可以给出大量的精确测量的DNA。
缺点是，不同物种的DNA长度会有少许误差。
凝胶过滤与分配层析
凝胶过滤与分配层析一、凝胶过滤凝胶过滤是一种基于分子大小不同的分离技术，通过将样品溶液通过装有凝胶颗粒的柱子，根据分子大小不同，样品中的组分被分离。
凝胶颗粒的孔径可以控制，从而可以选择性地保留或排除特定大小的分子。
凝胶过滤主要用于蛋白质、DNA等生物分子的分离和纯化。
凝胶过滤的原理是：样品溶液通过装有凝胶颗粒的柱子时，分子较大的物质由于不能进入凝胶颗粒的微孔而被排斥在外，最先流出柱子；而分子较小的物质则能进入凝胶颗粒的微孔，从而被滞留在了柱子的内部。
随着淋洗液的不断流过，小分子物质会逐渐被带出柱子，而大分子物质则被不断洗脱。
凝胶过滤的应用领域广泛，如生物制药、生物化学、分子生物学等领域。
它是一种简单、快速、有效的分离方法，尤其适用于分离大分子物质。
然而，凝胶过滤的分离效果受多种因素影响，如样品浓度、柱子的长度和直径、淋洗液的性质等。
二、分配层析分配层析是一种利用样品中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同的原理进行分离的技术。
样品溶液通过装有固定相和流动相的层析柱时，各组分在两相之间进行分配。
由于不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，因此它们在层析柱中的移动速度也不同，从而达到分离的目的。
分配层析的原理是：样品溶液中的各组分在固定相和流动相之间进行分配，根据其在两相之间的分配系数不同，其移动速度也不同。
固定相是层析柱中的固体部分，流动相则是通过层析柱的液体部分。
样品溶液通过层析柱时，组分会根据其分配系数在两相之间进行动态分配，从而实现分离。
分配层析的应用领域广泛，如化学、生物化学、药物化学等领域。
它具有分离效果好、分辨率高、操作简单等优点。
然而，分配层析的分离效果受固定相和流动相的性质、层析柱的长度和直径等因素影响。
三、固定相和流动相在凝胶过滤和分配层析中，固定相和流动相都是影响分离效果的重要因素。
固定相是层析柱中的固体部分，用于吸附样品中的组分；流动相则是通过层析柱的液体部分，用于将组分从固定相中洗脱出来。
凝胶过滤
⏹凝胶过滤（又叫分筛层析）是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。
⏹其原理是：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物却被排阻在外部; 当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。
凝胶过滤特点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等。
⏹常用于：分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物；⏹还可用于测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等方面⏹凝胶是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的一类化合物。
⏹这化合物目前主要有：葡聚糖凝胶天然琼脂糖交联琼脂糖⏹其次还有：聚丙烯酰胺凝胶(生物胶Bio-gel) 交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶交联琼脂糖与葡聚糖共结合的凝胶(superdex)一、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex。
它是由葡聚糖[右旋糖酐(G型)]和3-氯-1,2环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而成的。
⏹⏹在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
1．理化性质葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。
它带有大量的羟基，亲水性好，因此在⏹水溶液或电解质溶液中极易膨胀。
由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质在水中的有明显的差异：膨胀度(床体积) 吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) 筛孔的大小分级范围葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样，详见表6-2。
⏹以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。
⏹以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。
2．稳定性⏹葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。
⏹在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其性质并不改变。
凝胶过滤
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷 键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加 入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否 则，微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。
该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质） 发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但 当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。 葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作 洗脱液。
一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形 式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅 速发生分解（高温条件）。
缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸 附现象，使用离子强度略高的洗脱液操 作可以克服。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗 透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以 它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的 组分先流出，分子小的组分后流出。
琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在 含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。
CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇 （1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热 稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较 强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生 解聚。
凝胶过滤法原理
凝胶过滤法原理凝胶过滤法是一种常用的分子分离方法，主要用于分离和分析生物大分子，如蛋白质、核酸和多肽等。
凝胶过滤法是一种基于分子大小的分离方法，利用分子在凝胶中的深度穿透程度来分离分子大小不同的物质。
本文将详细介绍凝胶过滤法的原理、操作步骤、优缺点以及应用领域。
一、凝胶过滤法原理凝胶过滤法是一种分子尺寸分离的方法，属于分子筛分离方法。
其原理是通过凝胶微球的孔径大小来实现对分子进行分离。
凝胶微球的孔径大小与其交联程度及交联剂浓度有关，一般来说，交联程度越高，孔径越小，分子的分离效果就越好。
凝胶过滤法的操作步骤如下：1. 凝胶材料的制备：根据需要分离的分子大小选择合适的凝胶材料，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
制备时需要根据实验要求控制凝胶的交联程度和孔径大小，并进行脱氧处理以去除残留的殉使剂。
2. 凝胶柱的制备：将制备好的凝胶注入柱体中，制备凝胶柱。
凝胶柱的长度和直径应根据实验需要进行选择。
凝胶柱的前端和后端各设置一个过滤器，以保持凝胶柱内部的凝胶均匀分布。
3. 样品的预处理：根据实验需要，对待分离样品进行预处理，如去除蛋白质中的盐、重组蛋白中的肽、除去核酸样品中的杂质等。
预处理的方法包括低速离心、热处理、加盐沉淀、酸性沉淀、甲醇沉淀等。
4. 样品的注入：将预处理好的样品注入凝胶柱中，根据实验需要调整注入速度和量，并在实验过程中保持凝胶柱内部湿润。
5. 柱洗脱液的选择：根据分离物的性质和实验要求选择合适的柱洗脱液，如生理盐水、磷酸盐缓冲液、硝酸盐缓冲液等，逐一加入凝胶柱中。
6. 分离物的收集：收集不同分子大小的分离物，根据需要进一步进行分析、纯化、测定样品的组成和浓度等。
凝胶过滤法有许多优势，如不需要高压，适用范围广，简单易操作，分离效果好，分离物得到的样品污染小等。
它也有一些缺点，如无法分离小分子物质，分子大小分离效果有限，凝胶材料存在的自由基和殉使剂会对样品产生影响等。
二、应用领域凝胶过滤法广泛应用于生命科学领域中各项研究中，如基因工程、蛋白质分离纯化、酶学研究、药物筛选等。
第五章-凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
蛋白质浓缩的方法
蛋白质浓缩的方法蛋白质浓缩是实验室中常用的技术，用于获得高纯度的蛋白质样品。
蛋白质浓缩的方法有很多种，包括凝胶过滤法、酒精沉淀法、斯利筛法、离子交换法等等。
以下是对这几种蛋白质浓缩方法的详细讲解：1.凝胶过滤法：凝胶过滤法是一种常用的蛋白质浓缩方法。
其原理是通过孔径适当的聚丙烯腈膜或聚乙烯醇膜，将待浓缩的蛋白质样品加入腔体中，然后通过离心作用使溶剂被迫从孔径较大的膜上迅速逃逸，而蛋白质则被约束在孔径较小的膜上，从而实现蛋白质的浓缩。
2.酒精沉淀法：酒精沉淀法是一种简便而有效的蛋白质浓缩方法。
其原理是通过加入适量的酒精或醋酸，使溶液中的蛋白质发生沉淀，然后用离心将蛋白质沉淀分离。
最后将蛋白质沉淀用适量的溶剂重溶，即可获得浓缩后的蛋白质样品。
3.斯利筛法：斯利筛法是一种常用的蛋白质浓缩方法。
其原理是通过使用一种具有特殊筛分性能的纤维膜，将待浓缩的蛋白质样品置于较筛孔径较小的一侧，通过压力差来实现蛋白质的浓缩。
斯利筛法具有分子筛选性能好、结构稳定等优点，适用于多种蛋白质的浓缩。
4.离子交换法：离子交换法是一种常用的蛋白质浓缩方法。
其原理是通过利用离子交换树脂表面具有的离子交换性质，将待浓缩的蛋白质样品在树脂中与载体上的相对较大分子物质交换位置，然后通过洗脱将蛋白质从树脂上洗脱下来，从而实现蛋白质的浓缩。
蛋白质浓缩的方法选取要根据实验目的和待浓缩的蛋白质性质进行选择，不同的方法各有优缺点，在实验中要根据具体情况选择适合的方法。
蛋白质浓缩方法的优点包括：操作简便、效率高、可控性强、适用性广等。
而其缺点包括：可能造成失活、可能引入其他物质或污染等。
因此，使用蛋白质浓缩方法时需要根据实验目的和需求进行实验设计，并严格控制操作步骤和条件，以获得高质量的蛋白质样品。
总结起来，蛋白质浓缩是一种常用的实验室技术，根据实验需要可以选择凝胶过滤法、酒精沉淀法、斯利筛法、离子交换法等方法进行浓缩。
使用蛋白质浓缩方法时要控制好操作步骤和条件，以获得高质量的蛋白质样品。
第三章 凝胶过滤层析
交联度
交联剂占单体和交联体总量的百分数 凝胶颗粒孔径大小与交联度有关
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl 2）琼脂糖凝胶 3）聚丙烯酰胺凝胶
（1）葡聚糖凝胶
① G类葡聚糖（Sephadex）
其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质 完全渗入凝胶内。
分级分离，将样品中一些分子量比较接近的物质分开。 策略是使在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地 深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最 后得到分离。
组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50(3*104 Da)，脱盐一般选用G25（1000-5000Da）。
柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ
计算法： Vt = 1/4 D2h
测量法： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ 由于Ｖｇ 非常小，可忽略不计，因此： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ Ｖ０可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如蓝 色葡聚糖-2000； Ｖi可用硫酸铵等无吸附力的小分子物质。
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
（2）样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。
影响流速的因素
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
凝胶过滤法名词解释
凝胶过滤法名词解释
凝胶过滤法又称分子排阻法，这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。
原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。
选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。
将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。
被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。
缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。
分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。
而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。
06第六章凝胶过滤
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵 抗力，在pH4.0~9.0的缓冲液中是稳定的。
琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰 胺和葡聚糖凝胶。
琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放 在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。
琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2％)、4B(4％) 和6B(6％)。
玻璃珠 有大量的网孔，且分布均一; 它机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不 受影响; 缺点是对蛋白质等物质有吸附能力。
第二节 基本原理
凝胶过滤层析的基质: 具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的 物质。
排阻、扩散效应（见下图） 这种基质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于 筛孔之外， 而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自 由地扩散、渗透。 任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围 均在0~100％之间。
一、凝胶的选择和处理
1．凝胶的选择 (1)型号 凝胶型号多。型号不同，筛分范围亦不相同。
Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。 蛋白质脱盐时，可选用凝胶SephadexG-25。
一般来说， 在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大， 分离的效果越好。
(2)粒度 凝胶的粒度有粗有细(与交联度无关)。 细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均一，因此分离效果
在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3~12范 围内变化，溶液中加入去污剂(如1％SDS)和(或)解离剂 (如8mol／L尿素、6mol／L盐酸胍)时，也不会影响分 离效果。
此凝胶共有6种类型，详见表6-6
除上述5类凝胶外，还有： Superose(高交联度的多孔琼脂糖珠，有制备级和分析级)、 玻璃珠 聚苯乙烯凝胶 等也具有分子筛功能。
凝胶过滤的洗脱条件
凝胶过滤的洗脱条件1. 洗脱速度很关键呀！就像跑步一样，太快了可能会错过好东西，太慢了又耽误时间。
比如在分离蛋白质的时候，洗脱速度太快，一些小的蛋白质可能就一下子冲过去了，没被好好分离。
2. 缓冲液的选择可不能马虎！这就好比给汽车选油，得合适才行。
要是选错了缓冲液，那结果可能就差之千里喽。
像在分离生物分子时，不合适的缓冲液可能会让它们变形呀！3. 温度也有影响呢！温度高了，分子们可能会变得活跃过头；温度低了，又好像它们都懒得动了。
就像人一样，温度适宜才舒服自在。
在做凝胶过滤时，不注意温度，可能会让结果不如意哦。
4. 柱子的大小和形状也得考虑呀！这就像住的房子，太小了住不下，太大了又浪费。
如果柱子不合适，那怎么能让分子们舒舒服服地被分离呢？比如柱子太细，大量样品进去可能就堵住啦。
5. 样品的浓度也很重要哇！太浓了容易挤在一起，太稀了又不好检测。
这不就像煮汤放盐一样嘛，多了咸少了淡。
要是样品浓度没把握好，那分离效果肯定大打折扣。
6. 凝胶的类型得选对呀！不同的凝胶就像不同的工具，得用在合适的地方。
要是选错了凝胶，那还怎么能有效地进行洗脱呢？比如说要分离大分子，却选了个小孔径的凝胶。
7. 洗脱的次数也有讲究哦！一次不够干净，太多次又麻烦。
这就跟洗衣服似的，洗一次可能还有污渍，洗太多次衣服都要洗坏啦。
在凝胶过滤中，不合理的洗脱次数会影响结果呀。
8. 压力也不能忽视呀！压力太大可能会把凝胶压坏，太小又推动不了。
这就好像给气球打气，气太多会爆，气太少又飞不起来。
不注意压力，凝胶过滤可能没法顺利进行。
9. 检测方法得选好呀！不然怎么知道分离得好不好呢？就像找东西得有个好眼睛一样。
如果检测方法不行，那岂不是白忙一场？10. 操作人员的技术也很关键啊！再完美的条件，没有好的操作人员也不行。
这就跟开车一样，车再好，司机技术不行也容易出问题。
在凝胶过滤中，操作人员可得认真负责呀！我的观点结论就是：凝胶过滤的洗脱条件真的每一个都很重要，都需要认真对待和仔细研究，这样才能得到理想的结果呀！。
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理一、凝胶过滤层析的概念和原理凝胶过滤层析是一种常用的生物化学分离技术，主要用于蛋白质的精细纯化和分离。
其原理是利用凝胶颗粒的孔隙结构，根据蛋白质的大小和形状差异，使不同分子量和形状的蛋白质在凝胶颗粒的孔隙中发生不同程度的阻滞和流动，从而实现蛋白质的分离和纯化。
二、凝胶过滤层析的操作步骤1. 样品加载：将待纯化的蛋白样品均匀地加载到预先平衡的凝胶柱或凝胶板上。
2. 洗脱：用缓冲液通过凝胶柱，洗去未结合的蛋白和其他杂质。
3. 洗脱物收集：收集洗脱液中的目标蛋白。
4. 分析和检测：对收集的蛋白样品进行分析和检测。
三、凝胶过滤层析的优点和适用范围1. 分辨率高：凝胶过滤层析能够分离不同分子量的蛋白，分辨率较高。
2. 操作简单：操作过程不需要高昂的设备和特殊技能，相对容易进行。
3. 适用范围广：适用于各种不同分子量和性质的蛋白质的纯化和分离。
四、对凝胶过滤层析的个人理解和观点凝胶过滤层析作为一种生物化学分离技术，在蛋白质纯化领域有着广泛的应用。
它的原理简单易懂，操作相对容易，且适用范围广，因此备受科研人员的青睐。
在生物制药和基因工程等领域，凝胶过滤层析也发挥着重要的作用，为蛋白质的纯化和分离提供了有效的技术手段。
总结：凝胶过滤层析作为一种重要的蛋白质纯化技术，具有分辨率高、操作简单、适用范围广等优点。
通过对凝胶过滤层析的深入理解和掌握，能够为生物化学研究和生物制药领域的发展提供有力支持。
通过本文的深度探讨，相信您对凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理有了更深入的了解。
希望本文能够帮助您更全面、深刻和灵活地理解这一主题。
凝胶过滤层析属于分子量分馏技术，是一种物理性质分离方法。
它基于蛋白质在凝胶柱内孔隙中的迁移速度的差异，可以将混合物中的不同分子量的蛋白质分离开来。
对于高分子量的蛋白质来说，凝胶柱内的孔隙会成为一个障碍，从而使它们在柱内停留的时间更长，而低分子量的蛋白质会更容易通过孔隙，因此在经过相同时间的洗脱后，不同分子量的蛋白质就可以被有效地分离开来。
蛋白干燥方法
蛋白干燥方法蛋白干燥是一种常见的实验室技术，用于去除蛋白溶液中的水分，使蛋白质保持干燥状态。
本文将介绍几种常用的蛋白干燥方法及其原理。
一、凝胶过滤干燥法凝胶过滤干燥法是一种常用的蛋白干燥方法，它利用凝胶材料的吸附性能将蛋白质溶液中的水分去除。
具体步骤如下：1. 首先，将蛋白质溶液加入凝胶柱中；2. 然后，通过重力或离心力将溶液从凝胶柱中通过；3. 在溶液通过凝胶柱的过程中，凝胶材料会吸附住蛋白质中的水分；4. 最后，收集溶液，其中的蛋白质已经变得干燥。
凝胶过滤干燥法的优点是操作简单、效果好，但需要注意选择合适的凝胶材料和操作条件，以避免对蛋白质的损伤。
二、冷冻干燥法冷冻干燥法是一种将蛋白质溶液中的水分直接转化为气体的干燥方法。
具体步骤如下：1. 首先，将蛋白质溶液放入冷冻器中进行冷冻，使水分结晶；2. 然后，将冷冻的蛋白质溶液放入真空容器中；3. 在真空条件下，通过升温使冷冻的水分直接从固态转化为气态，从而实现蛋白质的干燥。
冷冻干燥法的优点是能够保持蛋白质的活性和稳定性，适用于对蛋白质活性敏感的实验。
三、喷雾干燥法喷雾干燥法是一种通过将蛋白质溶液喷雾成细小颗粒，并在高温条件下将水分蒸发，实现蛋白质的干燥。
具体步骤如下：1. 首先，将蛋白质溶液喷雾成细小颗粒，可以使用喷雾干燥器等设备；2. 然后，将喷雾后的颗粒置于高温环境中，使水分快速蒸发；3. 最后，收集干燥的蛋白质颗粒。
喷雾干燥法的优点是可以制备颗粒均匀、溶解度好的干燥蛋白质样品，适用于药物制剂等领域。
四、真空干燥法真空干燥法是一种通过在真空条件下蒸发蛋白质溶液中的水分，使蛋白质干燥的方法。
具体步骤如下：1. 首先，将蛋白质溶液放入真空容器中；2. 然后，通过减小容器内部的压力，在低温下使溶液中的水分蒸发；3. 最后，收集干燥的蛋白质样品。
真空干燥法的优点是能够快速蒸发溶液中的水分，避免对蛋白质的热损伤，适用于对蛋白质活性敏感的实验。
蛋白干燥是一种常见的实验室技术，通过凝胶过滤、冷冻、喷雾或真空等方法将蛋白质溶液中的水分去除，使蛋白质保持干燥状态。
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1.0 1.5 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0
2 3 5 10 12-15 15-20 20-30 30-40
1) 任意卷曲的多糖 2）多肽和球蛋白 Sephadex在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸溶液中稳定，在强碱中糖苷键被水解。可在 100℃高压消毒40分钟。
（二）、琼脂糖凝胶（Sepharose） 由琼脂制成的线性多糖，由D-半乳糖和3，6-脱水L-半乳糖交替 组成。
（二）、凝胶级别的选择 1.细的（20-80μm）： 2.超细的（10-40μm）：以上二者区带窄， 分辨率高。 3.中等的（50-150μm）： 4.粗的（100-300μm）：以上二者流速快， 适用于制备，组分离。
（三）、层析柱的选择
1.柱长：两个区带的分辨率与柱长的平方根成正比。 2.柱内径：大小由载样量决定。 3.加样装置：样品进入凝胶前避免稀释。 4.死体积：样品经柱分离后避免再混合。 5.层析床支持物：避免阻塞。
植物外源性凝集素----红细胞、淋巴细胞的表面抗原、某 些糖和多糖
（二）、层析原理 1.以共价键将配位体与不溶性基质连接，制成层析床。 2.将欲分离样品加到柱上，与配位体有亲和性的大分子被保 留，其它直接流过。
3.改变洗脱剂组成，使吸附大分子解离和洗脱。
（三）、亲和层析的吸附剂 1、基质 1）、理想基质的性质 (1)不溶性基质应具备松散的多孔网络，大分子可以均匀和不 受阻碍地进出，并具有良好的流动性。 (2)凝胶颗粒应为规则球形，并具刚性，有利于流动和耐受静 压。 (3)基质的化学性质必须是惰性的，基质骨架与蛋白质等的反 应必须极弱以降低非特异 性结合吸附作用。 (4)凝胶的理化性质必须稳定，不因偶联配位体和吸附、洗脱 互补大分子所应用的条件而发生变化。 (5)基质必须有能活化或修饰的功能基，并且数量充足，以便 能偶联较多的配位体。
三、凝胶过滤的材料 最常使用的材料是聚合的有机化合物，它们都具有立体 的孔型网状结构。 （一）、交联葡聚糖（Sephadex） 交联葡聚糖为葡聚糖与表氯醇交联得到的，改变交联度 可以得到不同类型的Sephadex。 排阻极限：被凝胶完全排阻在孔外的大分子的最低分子量， 称为凝胶的排阻极限。 吸水值：1克干胶在完全膨胀后凝胶颗粒所吸取的水量。
一些Sephadex凝胶的特性
型号 分级分离范围1) 吸水值 （克水/克干胶） 床体积 （毫升/克）
G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200
700 1500 100-5000 1000-5000 2) 500-10000 1500-30000 2) 1000-50000 3000-80000 2) 1000-100000 4000-150000 2) 1000-150000 5000-300000 2) 1000-200000 5000-600000 2)
2）、有实际应用价值的基质
(1)纤维素 (2)交联葡聚糖 (3)琼脂糖 (4)交联琼脂糖
2、间隔臂 配位体直接和基质骨架偶联，它与互补蛋白质的相互 作用将受到空间阻碍的影响。配位体必须远离网络骨架。 一般是将配位体与基质骨架间加入一段长链，称为间隔臂。
1）、间隔臂的长度 一般认为，为了互补大分子获得最佳相互作用，配位 体与骨架间必须插入至少4到6个亚甲基的臂。然而，当互 补大分子的分子量低或与配位体亲和性高，则间隔臂长度 不像大蛋白质分子或低亲和系统中那样严格。 目前还有采用长链间隔分子的,如聚赖氨酰丙氨酸， 分子量约260,000，纯化作用较短链强。 2）、间隔臂的性质 惰性间隔分子：原认为脂肪族碳氢化合物是惰性的， 但是实验证明存在空间干扰和非特异吸附。 亲水性间隔分子：在长轴方向引入极性基团，如二级 胺、羟基、肽能极大降低非特异性吸附作用，但亲和层析 结果不好。 疏水性间隔分子： 甘氨酸倍半肽（亲水）对肝葡糖激酶吸附差 6-氨基乙酸（疏水）对肝葡糖激酶吸附好
（七）、洗脱的流速
当洗脱的流速增加时，色谱的分辨率降低。 可根据不同的目的选择适合的流速。要求得到好分 辨率时，要采用长层析柱和慢流速。要得到快速分离，可 采用短层析柱和快流速。好分辨率与快速分离不可兼得。
（八）、优化
有时不是一次就可以得到很理想的分离条件，可通过优 化来选到。例如：
A : IgG, B: transferrine, C: α-chymotrypsinogen IgG与transferrin已无法在 保持好分辨率的情况下加 快洗脱速度。 Transferrine 和αchymotrypsinogen的分离可 以加快流速，分辨率仍可 为2.25。 如改变柱长，使分辨率为1， 柱长约为17cm，分离时间 由30小时变为35分钟。
一些Sepharose凝胶的特性 型号 Sepharose 2B 近似的琼脂糖浓度(%) 2 多糖 20×106 蛋白质 40×106
Sepharose 4B
Sepharose 6B
4
6
5×106
1×106
20×106
4×106
可适用于pH3-11，低于此pH，葡聚糖可能水解。可耐受清洁剂、SDS、盐酸 胍等。可ห้องสมุดไป่ตู้温消毒。
对于一个凝胶过滤柱，有几个体积的参数： Ve为洗脱体积，即样品被洗脱出层析柱的体积， V0为外水体积，即凝胶颗粒间隙中溶剂的体积， Vi为内部体积，即凝胶内部孔径中溶剂的体积。 Vi = a· Wr，a为干胶重，Wr为吸水值。 这些体积间存在关系式 Ve Vo ，为特征值。 Ve = V0 + Kd· Vi，也即 Kd = Vi
（二）、装柱
1. 2. 3. 4.
5. 6. 7.
将凝胶悬液调成大约75%。 用负压泵脱气。 如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。 层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温 度变化。 排掉层析床支持物内的气体。 层析柱调到垂直位置。 凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。
（三）、检查层析柱 以蓝葡聚糖2000（2mg/ml）为样品，观察色带在柱内洗脱时移动 的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。 （四）、加样 1.手工加样 2.加样阀加样 要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。 （五）、洗脱 洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给， 不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。 （六）、凝胶的清洗 凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，需 清洗后才能恢复原样。 Sephadex,，Sepacryl， Sepharose CL 可用0.2M NaOH。 Sepharose 可用4<pH<9缓冲液及非离子清洁剂。
四、凝胶过滤的参数和公式 对于某一种凝胶，一种溶质在其内部和外部溶剂之间的 分配由一个分配系数Kd决定，它是溶质分子大小的函数。 如果是大分子溶质，完全被凝胶内部所排阻，则Kd = 0， 如果溶质分子足够小，完全进入内部溶剂，则Kd = 1，由于 凝胶内部孔径大小不同，对于中等大小溶质，可以进入部分 内部溶剂，不能进入全部内部溶剂，Kd就在0与1之间变化。
六、凝胶过滤的实验 （一）、凝胶的准备 Sephadex 干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行， 注意不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。 不同类型的凝胶膨胀的时间不同： G-25, G-50 膨胀过夜 G-75 一天 G-100 二天 G-200 三天 在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。 Sephacryl, Sepharose, Sepharose CL是膨胀好的。
亲和层析(affinity chromatography)
一、介绍
（一）、概念：亲和层析是利用配位体和大分子相互作用时 所固有的独特的生物学特性建立的一种吸附层析.
这种相互作用包括：
酶----底物、产物、抑制物、辅酶和变构调节剂
激素----结合蛋白、细胞受体 基因----核酸、阻遏蛋白
抗体----互补抗原
六、凝胶过滤的实验设计 目的：包括达到最好的分离，最大的回收率，最小的样品 稀释，尽可能短的分离时间。 分辨率（Rs）=
两峰间的距离 可反映分离的效果，当 峰宽
Rs≥1.2时，表明基线分离。
（一）、凝胶类型的选择 1.组分离：当两种成分分子量差距很大时采用，例如脱盐。 凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外水（Vo），区带窄， 稀释少。低分子量的洗脱体积接近Vt。脱盐一般推荐 Sephadex G-25。 2.分级分离：当分离几种分子量接近的组分时，应该使用各 种凝胶的选择性曲线，避免几种成分的洗脱体积接近Vo或 Vt。 3.分子量测定：要使样品分子量落在选择性曲线的线性部分 及处于校正标准品的中间。一般推荐使用Sephacryl S-200 superfine, Sephacryl S-300 superfine或Sepharose CL-6B。 这些胶对水溶性差使用助溶剂不会造成影响。 如果可选择的胶有交搭，应该选择较低排阻极限的，这 样可以分离的时间短，回收率高。
（四）、样品量 较难的分离：样品体积占床体积的1-5%。 组分离和一般分级分离：可根据情况，加大 样品量。
（五）、样品浓度和粘度 凝胶过滤在很大程度上与样品浓度无关，但除了溶 质的溶解性以外，样品的粘度限制了浓度的增加。
（六）、洗脱剂
洗脱剂的组成不直接影响凝胶过滤的分辨率。
完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。 带电荷的物质可以用Tris-HCl、磷酸盐缓冲液， Sephadex和Sepharose用离子强度0.02M以上缓冲液， Sephacryl用离子强度0.05M以上缓冲液，防止与基质间的 离子作用。NaCl也可采用。如果产物要冷干处理，可采用 挥发性的缓冲液如乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙二铵等。 最重要的要考虑洗脱液对样品的作用，如pH、离子强 度、清洁剂等，是否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、激 素的活性。
仪器分析课程
凝胶过滤和亲和层析
中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所
凝胶过滤（Gel filtration）