SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
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5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。
对本科生的实验教学、本科生的 论文设计、研究生的高级生化实验等 方面都充实了内容。
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（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
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蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。
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区带电泳使用不同的支持介质，有
滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
球蛋白（去年完成的基金项目）
（三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G子量（ 连续四个单项实验）。
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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。
其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。
具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。
2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。
3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。
4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。
5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。
需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。
生物化学实验-SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
实验原理
电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即 向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据 各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷 多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电 泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区 间，故称区带电泳。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质分子 的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系，符合下列方程式：
lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截 距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤
凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加
10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl
电泳凝胶配方：
30.8%Acr-Bis
1.5mol/l Tris(pH8.9)
0.5mol/l Tris(pH6.7) ddH2O水
10%SDS
10%过硫酸铵AP
3、样品处理与加样 ⑴样品制备
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50μl，分别放入1.5ml离心管中， 12000r/min离心10分钟，上清即为电泳样品。 ⑵样品处理
将离心后的上清各取20ul，加入等体积“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温 3分钟，取出冷却后，12000r/min离心2min,取上清直接加样。 ⑶加样
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
四. 实验过程
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒
定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱 色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
•
二. 实验原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH ， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
三.
实验试剂和器材
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融 化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml。
(完整版)实验四SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量
实验四 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量姓名：mangogolaSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是：蛋白质在电泳中的迁移速率取决于其所带电荷、分子大小以及形状等因素，而大多数蛋白质与SDS 按一定比例结合（1:1.4/g:g ），这样使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，而且形状为短轴相同的雪茄烟形。
由此蛋白质分子的电泳迁移率仅取决于其分子量，在特定凝胶浓度下，一定范围内的蛋白质分子量对数与迁移率呈直线关系，选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白，与样品同时电泳计算得到标准曲线，并根据待测样品的相对迁移率在标准曲线上查出其分子量。
一．实验过程1.凝胶工作液的配制2.灌制分离胶将制胶玻璃板清洗安装紧密后，插入制孔器，在距制孔器下端1cm 处做一标记，取下制孔器将分离胶溶液加入两块玻璃板之间至标记处。
然后立即用注射器向凝胶液面轻轻铺上一层厚约0.5cm 的dd 水，目的是使凝胶面平整，放置待其聚合凝固。
3.灌制浓缩胶将分离胶上的双蒸水用注射器取出并用滤纸吸干，放入制孔器，用滴管灌入浓缩胶至玻璃板顶端待其聚合凝固。
4.待测样品的制备取0.1ml 透析除盐后的样品稀释液（浓度在0.2mg/ml 左右），加入0.1ml 样品溶解液，混匀后沸水浴5min ，冷却。
（沸水浴的目的是使蛋白质变性成肽链，便于与SDS 结合，甘油可以增加蛋白质的比重，便于沉降到加样孔底部，不易飘散） 5.加样和电泳将电极缓冲液注入缓冲液槽，然后轻轻拔出制孔器，加样后连接电泳仪，记录每个加样孔的样品类型及上样量。
浓缩胶使用50V 恒压，分离胶使用100V 恒压。
浓缩胶浓度4%，交联度2.7%[Acr （30%）：Bis （0.8%）]溶液0.67ml dd 水3.05ml0.5M pH6.8 Tris-Hcl （0.4%SDS ）溶液 1.25mlTEMED （原液）6ul将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀，加入10%的硫代硫酸铵0.026ml ，摇匀后灌胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定【实验目的】1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。
2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。
【实验原理】SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。
2.实验试剂⑴ 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
⑵ 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量实验数据：标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条溴酚蓝前沿距离/cm 4.70距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16样品 1 2 3溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37标准曲线：y=5.05-1.10x结果：样品 1 2 3Mr 12706 59566 43954mr 4.104 4.775 4.643一. 实验目的和要求1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2 掌握垂直板电泳的操作方法。
3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二 .实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
(生物化学)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
ml
4.0 2.5 0.1 0.1 3.3 0.006
灌注分离胶（水封，室温30分钟左右凝固） *丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性神经毒性 ——手套
3. 浓缩胶的制备和灌注
5%浓缩胶（10ml）-3ml/组
试剂
ml
Acr/Bis 30%
1.7
0.5mol/L Tris-HCl Ph 6.8
2.5
在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和 夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧
夹子。
玻璃夹放在制胶架上，薄玻璃朝向自己。按弹 簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内分别
灌制分离胶和浓缩胶，放上梳子，待胶凝固。2. 分离胶的制备和灌注
12%分离胶的制备（10ml）-5ml/组
试剂
Acr/Bis 30% 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8 10% SDS 10% AP H2O TEMED
• 电泳：80V，15-20min（浓缩胶）；100V（分 离胶）至指示剂距凝胶底边1cm。
6. 染色、脱色
染色：凝胶于0.25% 考马斯亮蓝染 色20min。
脱色：于脱色液 （7.5%冰乙酸， 5%甲醇）中脱 色至蛋白带清 晰。
蒸馏水煮沸5-10’
7. 照相、分析结果
➢凝胶成像系统照相 ➢绘制标准曲线 ➢计算样品蛋白的分子量
兔磷酸化酶B（97400） 牛血清白蛋白（66200）
兔肌动蛋白（43000） 牛碳酸酐酶（31000）
胰蛋白酶抑制剂（20100） 鸡蛋清溶菌酶（14400）
8. 思考题
➢ 浓缩胶与分离胶的作用机制各是什么? ➢ 分离胶灌注完毕，以蒸馏水封闭的作用是
什么? ➢ 根据实验结果，分析实验误差的可能原因。 ➢ 如何配置1L 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 缓
生化实验七 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、 实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量 二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。
若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。
1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。
加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。
同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。
其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。
不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。
这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。
需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。
因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。
(完整版)实验8--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品，则蛋白质分子中的二硫键被还原，1g 蛋白质可定量结合1.4g SDS。
由于SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量的负电荷，其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时，它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离，有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。
用这种方法测定蛋白质的Mr，简便、快速，只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。
所得的结果，在Mr为15000~200000的范围内，与用其他方法测得的Mr相比，误差一般在±10%以内。
因此SDS测定Mr的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。
现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。
实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。
在一定的条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。
在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时，应注意以下几个问题：1.如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：⑴二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 . 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 . 熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动, 称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状, 在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量, 因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同, 二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动, 经过一定的时间后得以分离, 这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时, 蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小, 形状和所带的电荷量有关, 为了使其只与蛋白质分子的大小有关, 从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量, 就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称, 它是一种阴离子表面活性剂, 加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上（在一定条件下, 大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质）, 使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷, 其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别, 使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素, 于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线, 可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明, 它们在水溶液中的形状, 近似于雪茄烟形状的长椭园棒, 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? , 即 1.8 nm ）, 而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）测定蛋白质分子量，简便、快速且重复性好，是一种常用的蛋白质分子量测定方法。
百泰派克生物科技提供基于SDS-PAGE或质谱的蛋白质分子量测定服务。
SDS-PAGE
SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种间断的电泳系统，通常用于分离分子量在5—250kDa之间的蛋白质。
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate ，SDS）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel ，PAG）组合使用可以消除结构和电荷的影响，从而仅根据分子量的差异来分离蛋白质。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
蛋白质分子量即蛋白质相对分子质量，是蛋白质化学式中各个原子的相对原子质量的和。
蛋白质分子量正确与否往往预示着蛋白质的结构和功能正确与否。
测定蛋白质分子量的方法有很多，SDS-PAGE是主要方法之一，也是实验室使用最普遍的一种。
在SDS-PAGE中，已知分子量的标准蛋白质和未知样品同时电泳。
染色后，根据标准蛋白质的相对迁移率和分子量的对数，可得到一条标准曲线，利用未知样品的相对迁移率可在标准曲线上求得其分子量。
另外，SDS-PAGE法可分为还原电泳和非还原电泳，还原电泳中蛋白质二硫键被还原使得蛋白质可以充分伸展，因此使
测定结果更为准确。
实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量
实验四 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量姓名：mangogolaSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是：蛋白质在电泳中的迁移速率取决于其所带电荷、分子大小以及形状等因素，而大多数蛋白质与SDS 按一定比例结合（1:1.4/g:g ），这样使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，而且形状为短轴相同的雪茄烟形。
由此蛋白质分子的电泳迁移率仅取决于其分子量，在特定凝胶浓度下，一定范围内的蛋白质分子量对数与迁移率呈直线关系，选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白，与样品同时电泳计算得到标准曲线，并根据待测样品的相对迁移率在标准曲线上查出其分子量。
一．实验过程1.凝胶工作液的配制2.灌制分离胶将制胶玻璃板清洗安装紧密后，插入制孔器，在距制孔器下端1cm 处做一标记，取下制孔器将分离胶溶液加入两块玻璃板之间至标记处。
然后立即用注射器向凝胶液面轻轻铺上一层厚约0.5cm 的dd 水，目的是使凝胶面平整，放置待其聚合凝固。
3.灌制浓缩胶将分离胶上的双蒸水用注射器取出并用滤纸吸干，放入制孔器，用滴管灌入浓缩胶至玻璃板顶端待其聚合凝固。
4.待测样品的制备取0.1ml 透析除盐后的样品稀释液（浓度在0.2mg/ml 左右），加入0.1ml 样品溶解液，混匀后沸水浴5min ，冷却。
（沸水浴的目的是使蛋白质变性成肽链，便于与SDS 结合，甘油可以增加蛋白质的比重，便于沉降到加样孔底部，不易飘散） 5.加样和电泳将电极缓冲液注入缓冲液槽，然后轻轻拔出制孔器，加样后连接电泳仪，记录每个加样孔的样品类型及上样量。
浓缩胶使用50V 恒压，分离胶使用100V 恒压。
浓缩胶浓度4%，交联度2.7%[Acr （30%）：Bis （0.8%）]溶液0.67ml dd 水3.05ml0.5M pH6.8 Tris-Hcl （0.4%SDS ）溶液 1.25mlTEMED （原液）6ul将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀，加入10%的硫代硫酸铵0.026ml ，摇匀后灌胶。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
03 结果分析
CHAPTER
蛋白质分子量的计算
蛋白质分子量计算
根据已知标准蛋白的迁移率和分子量 ，通过线性回归分析，计算未知蛋白 的分子量。
校准曲线的建立
使用已知分子量的标准蛋白，在相同 条件下进行电泳，绘制迁移率与分是指凝胶能够区分相邻蛋白条带的能力，高分辨率的凝胶能够清晰区分 相近分子量的蛋白质。
电泳的原理
电场作用
01
在电场的作用下，带负电荷的SDS-蛋白质复合物向正极移动。
分离效果
02
不同分子量的蛋白质在电场中移动速度不同，从而实现分离。
检测方法
03
电泳结束后，可以通过染色、银染或荧光染色等方法检测分离
的蛋白质条带，并可根据染色深浅判断蛋白质含量。
02
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 的实验步骤
电泳
01
02
03
安装电极
将凝胶放置在电泳槽中， 确保电极与凝胶接触良好。
加样
将准备好的样品加入到凝 胶的样品孔中。
开始电泳
接通电源，开始电泳。确 保电流稳定，避免电流过 大或过小对实验结果的影 响。
染色和脱色
染色
在电泳结束后，将凝胶取出，放 入染色液中染色，使蛋白质条带 呈现可见的着色。
脱色
将染色后的凝胶放入脱色液中脱 色，去除背景颜色，使蛋白质条 带更加清晰可见。
分离度
分离度是指凝胶中各蛋白条带之间的分离程度，好的分离度能够使各蛋白条带 完全分开，便于准确分析。
实验误差和注意事项
实验误差来源
实验误差可能来源于电泳过程中电压、电流的波动、染色过程中染料的浓度和染 色时间等因素。
注意事项
为确保实验结果的准确性，应使用高质量的电泳试剂和设备，严格控制实验条件 ，并遵循标准化操作程序。同时，应定期对标准蛋白进行检测，以确保标准曲线 的准确性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS的性质与作用
十二烷基磺酸钠(SDS) Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+
SDS的性质与作用
Protein Strand
Denature
-
SDS Molecules
-
SDS的性质与作用
蛋白质变性
0.1-1% SDS 0.1 M 2-巯基乙醇 蛋白质变与SDS分子按比例结合 1 ：1.4
插入样品梳加入电极缓冲加入电极缓冲液液ph83ph83浓缩胶浓缩胶ph86ph86通电通电分离胶分离胶ph88ph88加入样品加入样品上样及电泳开始电流恒定在开始电流恒定在10ma10ma当进入分离胶后改为当进入分离胶后改为20ma20ma溴酚蓝距凝胶边缘约溴酚蓝距凝胶边缘约5mm5mm时停止电泳
SDS-聚丙烯酰胺
制备浓缩胶
加入浓缩胶溶 液 pH 8.6
分离胶 pH 8.8
通电
加入电极缓冲 液pH 8.3
上样及电泳
加入样品
浓缩胶 pH 8.6
开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA， 溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
分离胶
pH 8.8
凝胶板剥离与染色
电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
凝胶电泳
生化社团 吕炎
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
测定蛋白质分子量
一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、结果分析 五、注意事项
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质分子量的原理。 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的 操作技术。
二、实验原理
SDS的性质与作用 聚丙烯酰胺凝胶的性质
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
. 样作为实验组来 同上项目三 SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）测定蛋白质分子量一实训目的1 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作步骤2 学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein ），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。
再与标准样品对照即可确定各区带的成分。
要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。
SDS 能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成 S DS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在 1.2X104～16.5X104 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。
LogMW ＝K －bm(LogMW 为分子量的对数，K 、b 为常数，m 为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋 白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量 三、实训器材序号 1 2 3 4 56 设备名称垂直板电泳槽及附件 直流稳压稳流电泳仪 微量进样器玻璃注射器玻璃平板电炉 规格，型号可变压数量1 12 1 41序 试剂纯度、浓度 作用配 制 需要工具 需要工具号 方法1低分子量标 准蛋白质样 2mg /ml以标准样品为 对照即可确定 见 表 格 下 水浴锅、小烧 杯，玻璃棒 本样品各区带的 方成分210~20mg/ml水浴锅、小烧品3浓缩胶缓冲 液测定蛋白质的 分子量呈弱酸性，使甘 同上 氨酸解离很少， 在电场作用下， 涌动效率低，二 氯离子含量高，杯，玻璃棒天平、容量 瓶、棕色试剂 瓶保 证 电 泳 的 作为催化剂，产去掉其电荷效SDS加速剂，可催化4分离胶缓冲 液形成较高的电 位梯度压着蛋 白质聚集在一 起，凝缩为一狭 小区带。
SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量
实验二十三SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量一、目的学习和掌握垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法, 并应用该方法测定蛋白质分子量。
二、原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时, 其迁移率取决于它所带净电荷、分子大小、形状等因素。
1967 年Shapiro 等人发现, 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS) , 则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量, 而与其所带电荷多少和形状无关。
SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂。
SDS 以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合,形成蛋白质- SDS 复合物。
SDS 与大多数蛋白质的结合是高密度的, 其重量比为l .4∶1 , 由于十二烷基硫酸根带负电, 使各种蛋白质的SDS 复合物都带上相同密度的负电荷, 而且带电量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而消除或降低了不同蛋白质分子之间所带净电荷对电泳迁移率的影响。
SDS 与蛋白质结合后, 还引起了蛋白质构象的改变。
根据流体力学的研究, SDS - 蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形棒状结构, 不同蛋白质的SDS 复合物的短轴长度都一样, 约为1 . 8 nm, 而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。
这说明, SDS - 蛋白质复合物的形成也消除了天然蛋白质构象不同对迁移率的影响。
影响带电化合物电泳迁移率的内在因素有三: 即带净电荷的多少、分子量的大小和分子的形状。
从以上的分析不难看出, 由于SDS 和蛋白质的结合, 消除了净电荷和分子形状二因素对电泳迁移率的影响。
那么在外界条件固定的情况下, 凝胶电泳的迁移率只取决于蛋白质分子量大小。
因此, 我们只要测出4～6 个已知分子量的标准蛋白质的迁移率, 作出标准曲线, 即可得到待测蛋白质分子的分子量。
只是每次测定样品必须同时做标准曲线, 而不得利用另一次电泳的标准曲线。
SDS - 凝胶电泳具有分辨率高、重复性好、设备简单、操作容易等优点。
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（二）、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分 子量的计算 1、根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关 系，精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距 离 。把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质 把溴酚蓝迁移的距离定为d1， 迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前 迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前 的长度，D2定为 凝胶染色后的长度。 的长度，D2定为 凝胶染色后的长度。 2、根据公式：Rm＝d2d1×D1D2计算各 根据公式：Rm＝d2d1×D1D2计算各 种蛋白质的迁移率 。
3、以标准蛋白质的迁移率为横座标，以其对 以标准蛋白质的迁移率为横座标， 应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线， 应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线， 可得到一条直线，然后根据未知样品的迁移 可得到一条直线， 率，在半对数座标图上查出其对应的分子量。 在半对数座标图上查出其对应的分子量。 4、 实验需多次重复。 实验需多次重复。
实验仪器
1、电炉 2、玻璃平板 3、玻璃注射器 4、微量进样器 5、垂直板电泳槽及附件 6、直流稳压稳流电泳仪
实验试剂
A．单体溶液(Acrylamide-Bis，30％)； 单体溶液(Acrylamide-Bis，30％ B．浓缩胶缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I=0.5M)； 浓缩胶缓冲液(TrisI=0.5M)； C．分离胶缓冲液(Tris-HCl pH8.8 I＝1.5M)； 分离胶缓冲液(TrisI＝1.5M)； D．电极缓冲液(Tris-甘氨酸PH8.3 I＝0.05M)； 电极缓冲液(Tris-甘氨酸PH8.3 I＝0.05M)； E.1％过硫酸铵； E.1％过硫酸铵； F．1％SDS； SDS； G．样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I＝ 样本缓冲液(TrisI＝ 0.0625M)； 0.0625M)；
H．样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M，2 样本变性液(TrisI=0.01M， SDS， 10％蔗糖，0.001％溴酚兰) ％SDS， 10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；使用时 与样本l:1(v/v)混匀 与样本l:1(v/v)混匀。 混匀。 I．固定液； 固定液； J．染色液； 染色液； K．脱色液； 脱色液； L．保存液； 保存液； M．指示染料液； 指示染料液； N．1％TEMED。 TEMED。
实验原理
1、主要依赖于电荷效应和分子筛效应，再与标准样 主要依赖于电荷效应和分子筛效应，
品对照即可确定各区带的成分。SDS能使蛋白质 品对照即可确定各区带的成分。SDS能使蛋白质 的构象发生变化， 的构象发生变化，降低或消除了各种蛋白质分子 间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负离子 ， 间的天然电荷差异，形成SDS电泳时， 电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小 ， 蛋白质分子量在1.2X104～16.5X104之间时 蛋白质分子量在1.2X104～16.5X104之间时， 之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系， 合下列方程。 下列方程。
4. 点样： 点样： 用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5µl， 用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5µl， 按分子量（从小到大） 按分子量（从小到大）的顺序注入样品槽内的浓 缩胶面上，同时吸取待测样品液25µl， 缩胶面上，同时吸取待测样品液25µl，注入其它 样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。 样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。 5. 电泳： 电泳： 加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（ 加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上 负下正），调节电流为15mA， ），调节电流为 负下正），调节电流为15mA，当指示剂进入分 离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80～ 离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80～ 100伏之间 100伏之间，约3～4h后，指示剂达到距前沿1～ 伏之间， 4h后 指示剂达到距前沿1 2cm时 可终止电泳。 2cm时，可终止电泳。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电 SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳测定蛋白质的分子 量
Байду номын сангаас
生物制药1011 生物制药1011
第三组
实验目的
1、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子的 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子的 原理。 原理。 2、掌握垂直板电泳的操作方法。 掌握垂直板电泳的操作方法。 3、运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量 及染色鉴定
6. 固定： 固定： 胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS， 胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS， 然后将胶浸泡在25％异丙醇和10％ 然后将胶浸泡在25％异丙醇和10％乙酸的混合液 中1h，蛋白质就得到固定了。 1h，蛋白质就得到固定了。 7. 染色： 染色： 取出凝胶板，测定胶长（D1） 取出凝胶板，测定胶长（D1）后，加入染色液染 2h。 色2h。 8. 脱色 将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次 将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次 脱色液，至少换3 待蓝色基本脱掉， 脱色液，至少换3次，待蓝色基本脱掉，再放在脱 色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止， 色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止，精确测定胶 D2）。 长（D2）。
LogMW＝ LogMW＝K－bm (LogMW为分子量的对数， (LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m 为常数， 为分子量的对数 为迁移率) 为迁移率) 2、 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量的对数作图，可获得一条标准曲线， 量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白 质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得其分子量。 可在标准曲线上求得其分子量。
操作步骤
（一）制备聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 电泳槽的安装： 电泳槽的安装： 干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内， 干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固 定在电泳槽上，周边用1.5％的琼脂密封。 定在电泳槽上，周边用1.5％的琼脂密封。 2. 样品处理： 样品处理： 将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处 理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热3 ），在沸水中加热 理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热3～ 4min，待冷却后作点样用。 4min，待冷却后作点样用。 3. 制胶：选择合适的胶浓度配制7.5％的分离胶， 制胶：选择合适的胶浓度配制7.5％的分离胶， 为小孔胶，进行电泳和分子筛分离） （为小孔胶，进行电泳和分子筛分离）