基因工程重组人干扰素概述(

根据来源、基因序列和氨基酸组成分类

I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω

来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等

功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长

免疫调节(较弱）

其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。

II 型干扰素：干扰素γ（IFN )

来源：活化的T细胞和NK细胞产生

功能：免疫调节

提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性

抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答

趋化作用

抗病毒和抗肿瘤作用（次要）

2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。

免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。

●对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达

增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc 受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。

●对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂

量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。

●对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性

粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；

③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞（如血管内皮细胞、某

些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递呈

作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分

化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。

二重组干扰素的临床应用

●广谱抗病毒活性（rhuIFNα）

慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。

●直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）

毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。

●免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）

●多发性硬化症 rhuIFNβ

对已知基因序列的干扰素 , 基因文库的调用可以用其序列 3' 端和5' 端部分事先用同位素

标记过的序列作为探针 , 通过杂交的方法进行调用。由于干扰素基因的种属特异性不是很大 ,| 可以用人的干扰素基因为同源探针 , 从鼠基因文库中调出相应的干扰素基因 , 其方法将在下文 1 中提到。 | 对于扰素基因的取用 , 不仅可以使用构建基因文库的方法 , 对已

了解其氨基酸或核昔酸割

成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的 DNA 序列 ,

再对其进行表达。化学合 | 成方法包括固相合成法及液相合成法两大类。与利用基因文库的方法相比 , 化学合成法比较 | 复杂 , 由于每

加入一个核昔酸就会有一定比例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况 , 并且在 l 整个合成过程中这种错误不断积累 , 因此该方法适合比较短的基因 , 而对长的基因则有目的产 | 物含量低、产物纯化困难的缺点。但它也有优点 , 如可根据研究的需要对一些氨基酸进行定点| 突变 , 或根据宿主菌的特性 , 在不改变其氨基酸组成的情况下使用宿主的偏爱密码子 , 以提高 | 产物的产量。 |

对于不同亚型的干扰素 , 由于同源性较高 , 可以用相同的引物从诱导的小鼠细胞系中提取

mRNA 混合物进行反转录和扩增 , 然后用亚型特异性探针对 CDNA 混合物进行 Southern 印迹 , 这样便可将序列上相差较小的同种、不同亚型的干扰素基因进行分离 , 为生产高纯度的单一干扰素提供了方法 O

三、表达方法

随着对干扰素研究的深入 , 人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的

10~40 位、 78~107 位、 123~166 位的 A 、 B 、 C 区 , 尤其是位于 78 和 79 位的氨基酸对抗病毒 | 活性十分重要。而人 IFNt1 的121~136 位对抗病毒活性作用较大 , 人 IFN 子的 N 端 10 个集 | 基酸也是保持其活性所必需的。对干扰素结构的了解为更好地构建基因表达奠定了基础。干 | 扰素最初是用其外源序列进行表达的 , 但近年来的研究表明嵌合表达的干扰素往往优于单一

干扰素 , 因此出现了较多的嵌合表达形式 , 并取得了较好的效果。

1.IFN- α的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、生产周期短、夕阳基因表达量高的优点 , 同时由于家蚕为真核生物 , 能对表达产物自行进行糖基化修饰 , 产生有生物活性的蛋白 , 并且在产物提取的过程中只要将家蚕进行匀浆 , 再进行抽提即可 , 操作上十分方便 , 因此 , 它在基因工程领域内被广泛应用。下面便以人 IFN, α的生产为例介绍家蚕表达体系在干扰素生产中的应用。

用家蚕核型多角病毒 BIIINPV 体外感染的家蚕传代细胞株 BM-N 通过噬菌斑法纯化得到 BmNPV 的τ 3 亚型。利用从感染脂肪体 mRNA 制得的 CDNA 为探针 , 对其多角蛋白序列进行检验 , 其中 10.5kb 的EcoR I 片段及 3.9 灿的 HindE 片段可与探针杂交 , 将 10.5 灿的EcoR I 片段克隆到 pBR322 中 , 产生质粒 pBmE360 对其用 HindE 切 , 得到 3.9kb 片段 , 其中 | 含有多角蛋白全部序列 ( 图 123 中为黑色框架 ), 将该片段插入 pUC9 的 HindE 位点 , 产生质 | 粒p9H18 。将 p9H18 用 EcoR I 切后于 50U BAL31 外切核酸酶缓冲液中23 ℃水浴 10min, 更 | 掐锺油油菲如 n 入 07 倍他烈的。气 mnlAd EDTA 终止反应。将截短的 p9H18 片段用 Hind E i切 , 并通过琼脂糖凝胶电泳分离 2.7kb 的 Hind 皿平头末端片段 , 将其插入 pUC9 即

p9B310

的 Hind HI-Sma I 位点 O 另外 , 将 pBmE36 的 3.1 峙的 HindE 片段连接到 pUC8 上 , 得到质粒 p8H225, 用 EcoR I 及 Aat E 切 , 得含有多角蛋白基因下游 3.1kb 基因的 3.5kb 片段 , 将其连接到

p9H18 的 4.7kb 的 EcoR IAat E 片段上 , 产生杂交质粒 p89B310,