重组干扰素

菌种建立 菌种特性 菌种库 工作菌种库
干扰素α-2b基因的克隆 表达载体的构建 工程菌的构建
转化腐生型假单胞杆菌 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种
参考文献：元英进， 制药工艺学 ，2007，P223
构建与保藏
菌种建立 菌种特性 菌种库 工作菌种库
发酵 分离纯化
具有宿主菌的特征：
➢细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 ➢菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状，粘稠。 ➢生化特性：Ser—，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为碳源。
此发生过敏反应。详见说明书。
生产工艺
制剂研究 给药方式
市场分析 研究进展
重组人干扰素生产工艺
基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 干扰素的发酵工艺过程
干扰素的分离纯化工艺过程 产工艺
构建与保藏 发酵 分离纯化
菌种建立 菌种特性 菌种库 工作菌种库
干扰素α-2b基因的克隆
制备白细胞
表达载体的构建
病毒诱导
166aa糖基化蛋白 22.5 ku
分泌表达 产量低成本高
过程严格
IFN α-2b/ Alferon安福隆 无糖基化可溶性蛋白 具有天然分子结构 具有生物活性
1996 ~
2002 1986
资20~0金2 来源多样化 2003
体外诱生制备: Sendai诱导人白细胞
人源转化细胞系培养: 多亚型混合干扰素
1966-1971
Friedman发现干扰素抗病毒的作用机制
抑制病毒的信使RNA功能
干扰素的作用机制
脊椎动物感染病毒体细胞
干扰素细胞因子IFN
激活ISGs(interferon stimulated genes)
相邻细胞及受感染细胞 • 抗病毒蛋白
免疫细胞 • 使细胞裂解 • 抗病毒抗体
Finlay McNab, Katrin Mayer-Barber, Alan Sher, Andreas Wack and Anne O’Garra“Type I interferons in infectious disease”. Nature reviews. Immunology : 87–103. 2015,2
AAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCA
GCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGAC
TCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAG
ACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGA
ATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGG
构建与保藏 发酵 分离纯化
菌种建立 菌种特性 菌种库 工作菌种库
干扰素α-2b基因的克隆 表达载体的构建 工程菌的构建
pVG3
IFN基因连接质粒
转化E.coli
筛选鉴定阳性克隆 测序：人IFNα-2b基因序列， 501bp，165aa
参考文献：元英进， 制药工艺学 ，2007，P223
构建与保藏 发酵 分离纯化
1980
获得重组干扰素
科学家们用基因工程技术在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了重组人干扰素。
生产工艺的发展
IFNα-n3批准上市 工艺复杂
产量低: 1g=3亿ml 来源困难 价格昂贵
潜在血源性病毒污染
1989
IFN α-n1/Wellferon 首次实现大规模商业化生产
活性低 退出临床应用
1999
无糖基化 无N-met 无活性包涵体
重组干扰素
重组干扰素 Recombinant Interferon
1957
Alick和Jean发现干扰素
病毒感染的细胞能产生一种因子作用于其他细胞并干扰病毒的复制。
什么是干扰素
(retrieved on January 3, 2016 ) Passage Downloaded from on December 29, 2015
张焜和,乙肝病毒感染的基础与临床,江西科学技术出版社,1999年07月第1版,第34页 高翔.乙肝病毒携带者健康歧视的法律规制研究[D].福建:华侨大学, 2007.
干扰素的分类及应用
主要适应症：
✓ 几乎能够抵抗所有病毒引起的感染 ✓ 目前主要用于乙肝、丙肝的治疗
(retrieved on January 3, 2016 )
工程菌Baidu Nhomakorabea构建
分离mRNA
ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGG GTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCAC
反转录酶合成cDNA、PCR
AGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTT
GAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCA
GGAGGGTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTG
TGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGG
AGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTT
CCAAAGAATCACCTCTACTGAAAGAGAAGA
AATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAG
AGCAGAAATCATGAGATCTTT参TT考CT文TT献GT：CA孔晓清，张忆疆.假单孢杆菌发酵生产 α-2b 干扰素工艺,2010
✓ 适应症: 本品用于慢性乙型肝炎，慢性丙型肝炎，肾 细胞癌，恶性黑色素瘤等疾病的治疗。
✓ 用法用量：皮下注射。 ✓ 不良反应：常见为发热、疲乏、头痛和肌痛。 ✓ 禁忌：对重组干扰素α-2b及其所含组分有过敏史的
患者禁用。禁止使用本品和利巴韦林联合治疗。 ✓ 注意事项：本品含稳定剂间-苯甲酚，某些患者可对
1976
干扰素用于临床
用纯化的人白细胞干扰素成功治疗2例慢性乙肝患者，但是由于人白细 胞干扰素原材料来源有限，未能大量应用于临床。
关于乙肝
嗜肝DNA病毒：HBV
• 本身无毒害：慢性发作：我国1.2亿乙肝病毒携带者 • 顽强生命力 • 引起免疫反应→损坏肝脏
干扰素治疗乙肝：
• 抗病毒作用 • 免疫调节作用 • 抗纤维化作用
基因工程E.Coli 发酵: 重组人干扰素
工程CHO细胞系构建 动物无限细胞系培养
假单胞杆菌工程菌发酵
1986
甘乐能上市
世界上第一个重组人干扰素 IFN-2b—Intron A由美国Schering Plough公司 上市，被FDA批准于治疗慢性乙肝。
甘乐能 一个重组干扰素的典型事例 A specific example of recombinant IFN